Inhibition des bactéries indésirables par l`activité antimicrobienne

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique
Université d'Oran-Es-Sénia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoire de Magister
Option: Microbiologie fondamentale et appliquée
Présenté par
Melle : HANNACHI Souad Sabrina
Thème
Inhibition des bactéries indésirables par l’activité
antimicrobienne des espèces de Leuconostoc
isolées du lait cru de chèvre
Devant les membres du jury :
Mr K. El. Aboudi
Professeur, Université d'Oran
Président
Mr J.E.Henni
Professeur, Université d'Oran
Examinateur
Mr T. Sahraoui
Maitre de conférences, Université d'Oran
Examinateur
Mr M. KIHAL
Professeur, Université d'Oran
Rapporteur
Melle Z. Benmechernene
Docteur, Université d'Oran
2007-2008
Co Rapporteur
Remerciements
Ce travail rentre dans le cadre d’un projet CNEPRU ; il a été réalisé a l’université
d’Oran, Faculté des sciences au Laboratoire de Microbiologie appliquée et fondamentale
sous la direction du Pr Kihal Mabrouk. Je voudrais lui exprimer ma profonde gratitude de
m’avoir dirigé tout au long de ce travail avec beaucoup de patience, grâce à ces conseils, ce
travail à été achevé.
J’exprime toute ma gratitude au Dr Benmechernene , co-directeur du mémoire, pour
tout son aide.
Toute ma reconnaissance va au Pr Henni et Dr Sahraoui d’avoir accepté de faire
partie du jury de mémoire en qualité d’examinateur, et au Pr El-Aboudi d’avoir accepté
d’être le président du jury, ainsi que pour l'attention et l'intérêt qu’ils ont portés à ce travail.
La rédaction de ce mémoire me donne l’occasion de remercier ainsi
toutes les
personnes qui ont participé et contribué au bon déroulement de ce modeste travail, toutes les
personnes qui de loin ou de prés m’ont aidée dans la réalisation de ce travail ; je cite
quelques noms : Dr Bensalah. F, Mr Yehlalli.Y (de l’université claude bernard France), Mr
AEK et Mr Ahmed (du laboratoire pédagogique de microbiologie Université Es Senia),Mr Ait
Abdeslam N., Mme Hamini..N, Karkachi S et Mme Benhammouche N…
Je remercie, plus particulièrement toute l’équipe de notre laboratoire de
microbiologie appliquée et fondamentale et du laboratoire de phytopathologie
Je remercie chaleureusement ma promotion de Magister ainsi toutes personne qui m’a
soutenue.
Je témoigne toute ma reconnaissance à mon fiancé pour sa disponibilité quotidienne,
ses conseils et son encouragement, toujours là dans les bons et les mauvais moments.
« Merci Maman, merci Papa, je remercie les membres de ma famille pour leur amour »
Dédicace
Je tenais en mon âme à dédire ce fruit de toute une carrière
en signe de respect et d’amour et de reconnaissance aux êtres
les plus chers à mon c ur ; Mes parent que dieux les garde pour moi
Une dédicace spéciale à l’être qui m’a donné beaucoup,
sans hésitation à mon cher fiancé
Mr Kamraoui A.
Je dédie ainsi ce travail à ma très chère
s ur ;Lemaane ainsi à mes
fréres « Zakkaria, Mehdi et Ayoub »
.
Sommaire
Remerciement
Dédicace
Résumé
Liste des figures
Liste des tableaux
Abréviation
Introduction générale
Introduction
1
Synthèse bibliographique
I-Généralité sur le lait de chèvre
2
1. Définition
2
2. Composition du lait de chèvre
2
II. Généralité sur Leuconostoc
3
1. Définition des Leuconostoc
3
2. Habitat des leuconostocs
4
2.1. Présence dans divers environnement
4
2.2. Présence dans les produits fermentés
5
2.3. Présence en produits laitiers
5
3. Rôle clinique
6
3.1. Infection et épidémiologie
6
3.2. Résistance aux antibiotiques
6
3.3. Les activités métaboliques bénéfiques sur la santé
7
4. Caractérisation et taxonomie
7
4.1. Identification, caractérisation et biodiversité
7
4.2. Taxonomie récente
8
4.3. Comparaison des méthodes d’identification
9
5. Croissance du Leuconostoc
10
5.1. Culture et conservation des cultures
10
5. 1.1. Isolement et milieux de cultures
10
5. 1.2. Conservation des cultures
12
6. Resistance des Leuconostoc au stress
13
7. Métabolisme du Leuconostoc
15
7.1. Utilisation d'hydrate de carbone
15
7.1.1. Transport du sucre
16
7.1.2. Catabolisme du sucre
16
7.2. Métabolisme d'acides organiques
18
7.3. Métabolisme des composés azotés
21
7.3.1. L’exigence des acides aminés
21
7. 3.2. Le système protéolytique
22
7. 4. Métabolisme du Leuconostoc en présence de l'oxygène
23
7. 5. Métabolisme lipidique
24
8. La génétique des Leuconostoc
24
9. Intérêt biotechnologique des Leuconostoc
26
9. 1. Rôles dans la technologie agroalimentaire
26
9. 1.1.Les formations des ouvertures
27
9.1.2. Production d'arôme
28
9. 2. Rôles en nourritures fonctionnelles
29
9. 2. 1. L’effet probiotique du Leuconostoc
29
9.2. 2 Production des polysaccharides et l’effet prébiotiques
29
9. 2. 3 Production de mannitol
30
9. 2.4. Hydrolyse des -galactosides
31
9. 2. 5. Production des vitamines
31
10. Leuconostoc et l'interaction microbienne
31
10.1. Réactions de Co-agrégation
32
10. 2. Croissance du Leuconostoc en cultures mixtes
32
10. 3. La production d’acide organique
33
10.4. Les bactériophages du Leuconostoc
34
10. 5. Les bactériocines produites par Leuconostoc
34
III-Généralité sur Staphylococcus aureus et Bacillus cereus
36
1. Staphylococcus aureus
36
1.1. Caractéristiques générales
36
1.2. Toxines staphylococciques et la production de pigments
37
1.3. Le staphylocoque et les intoxications alimentaires
37
2. Bacillus cereus
38
2.1. Caractéristiques générales
38
1.2. Pouvoir pathogène
38
Matériel et méthode
1. Prélèvement et collection des échantillons
39
1.1. Les échantillons des laits de chèvre
39
1.1.1. Provenances des échantillons
39
1.1.2. Collecte du lait
39
1.1.3. Mesure de l’acidité Dornic et le pH des échantillons
40
1.2. Les échantillons du fromage de Roquefort
40
2. Isolement et purification des souches de Leuconostoc
40
2.1. Milieux de culture et d’isolement
40
2.2. Traitement des échantillons
40
2.3. Isolement et purification
41
3. Identification et caractérisation des souches
41
3.1. Test phénotypique
41
3.1.1. Examen macroscopique
41
3.1.2. Examen microscopique
42
3.1.3. La catalase
42
3.2. Test physiologique et conservation des souches
42
3.2.1. Croissance en milieu hypersalé
43
3.2.2. Croissance à pH 9,6
43
3.2.3. Croissance à différentes températures
43
3.2.4. Test de thermorésistance
43
3.2.5. Conservation des souches
43
3.3. Tests biochimiques
43
3.3.1. Production de dextrane
43
3.3.2. Recherche de l’arginine hydrolase (ADH)
43
3.3.3. L’utilisation du citrate
44
3.3.4. Recherche du type fermentaire
44
3.3.5. Métabolisme des sucres
44
4. Tests biotechnologiques
45
4.1. Mesure de la production de l’acide lactique
45
4.2. Etude du pouvoir inhibiteur
45
4.2.1. Recherche d’inhibition
46
4.2.2. La détection de la nature de l’agent inhibiteur
47
4.2.3. Cinétique de la croissance et de l’acidification en culture mixte
48
Résultat et discussion
1. Isolement et purification
49
2. Caractéristiques phénotypiques
49
3. Caractéristiques biochimiques et physiologiques
51
3.1. Type fermentaire
51
3.3. Production du dextrane
52
3.4. Production de la citratase
52
3.5. Effet du pH de NaCl et de la temperature d’incubation
54
3.6. Le profil fermentaire des sucres
55
4. Caractérisations biotechnologiques
57
4.1. La cinétique d’acidification
57
4.2. Effet inhibiteur des leuconostocs sur les germes pathogène
63
4.2.1. Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur
63
4.2.2. L’évolution du pH, l’acide lactique et la croissance en culture pure et mixte
71
4.2.2.1. L’évolution du pH et de l’acide lactique
71
4.2.2.2. Dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte
72
Conclusion
77
Références bibliographiques
79
Annexe
Résumé
Les bactéries lactiques du genre Leuconostoc contribuent à la texture, à la saveur des
aliments et à la production de composés aromatiques dans l’industrie laitière et dans la
fermentation de nombreux autres produits alimentaires. Elles fermentent les glucides en acide
lactique, ce qui provoque une diminution du pH favorable à la conservation des aliments.
Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition pour les substrats et à l’élaboration
de bactériocines qui inhibent les germes indésirables, par la production de ses substances ; ce
genre de bactéries lactiques représentent un intérêt technologique très important.
Dans notre travail, nous avons
isolé, purifié et identifié neuf souches lactiques
appartiennent au genre Leuconostoc, à partir du lait cru de chèvre et du fromage Roquefort,
par l’utilisation des méthodes microbiologiques de base, et testé leur pouvoir acidifiant et leur
effet antimicrobien vis-à-vis des bactéries pathogènes tels que Staphylococcus aureus ATCC
25923et Bacillus cereus ATCC 11778et finalement nous avons recherché la nature des
substances inhibitrices.
Bacillus cereus ATCC 11778 était résistante aux souches isolées, en revanche une
inhibition importante de la croissance de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a été mise en
évidence par les souches SH1 et SH20. Les substances antimicrobiennes produites par les
souches de Ln mesenteroides subsp. mesenteroides (SH1 et SH20), sont des bactériocines.
L’effet de l’acide lactique à été écarté par l’utilisation d’un tampon phosphate, la
cinétique de croissance en culture pure et mixte à bien montré la sensibilité de
Staphylococcus aureus aux souches de Leuconostoc mesenteroides subs. mesenteroide,
ces souches ont même présenté un pouvoir acidifiant performant.
Mot clés : Leuconostoc, Staphyloccocus aureus, germes pathogènes et nuisibles, acide
lactique, inhibition, bactériocine.
Leuconostoc
.
pH
.
:
Bacillus cereus ATCC 11778 Staphylococcus aureus ATCC 25923
Bacillus cereus ATCC 11778
Staphylococcus aureus
(Roquefort)
%20
(SH1,
Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroide
SH20)
Staphylococcus aureus
.
SH20
96
,Staphylococcus aureus
Leuconostoc:
.
Abstract
It is known that Leuconostoc species contribute in food industry, more precisely milk and
its diary and this is due to its production of aromatic compounds and their sugar fermentation
to lactic acid, which will lead to the decrease in pH for food conservation. Moreover, its
antagonistic capacity also elaborate in the inhibition of altered germs by the production of
these substances, which represent an important technological interests.
The identification of Leuconostoc is an important step in fundamental and technological
development relative to metabolic activities which help in the selection of new stable and
preferment lactic acid bacteria strains for further use as starters.
The microbiological results showed that all isolates were belonging to Leuconostoc
species. The antimicrobial effect of these species against pathogenic bacteria such as
Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Bacillus cereus ATCC 11778 was carried out on
solid media and milk.
The nature of these substances was then evaluated by several existed chemical tests.
Our results showed that two strains of Leuconostoc mesenteroides (SH1 and SH20)
demonstrated a high inhibition activity towards only Stphylococcus aureus ATCC 25923.
The growth kinetic in both pure and mixed cultures has shown the sensitivity of
staphylococcus aureus ATCC 25923 to the isolated Leuconostoc mesenteroides..
These results show that the Algerian raw goat’s milk can be a source of new strains which
can be used as a bio-preservative in food industry.
Key Word : Leuconostoc, Staphylococcus aureus, lactic acid, interaction, bactériocine,
.pathogenic and harmful microorganisms
Liste des figures
Figure1 : Leuconostoc mesenteroides, image au microscope à contraste de phase.
14
Figure2 : L’adhérence du Leuconostoc sur le moule des grés glacés.
14
Figure 3 : Métabolisme général du Leuconostoc.
19
Figure4 : Aspect des cultures pures des Leuconostoc en milieu MRS solide.
50
Figure5 : Aspect des cultures pures des Leuconostoc en bouillon MRS.
50
Figure 6 : Observation microscopique des cellules de Leuconostoc Gx1250.
50
Figure 7 : Le caractère hétérofermentaire des Leuconostoc.
51
Figure8 :L’aspect des colonies de Leuconostoc sur milieu M16BCP.
53
Figure 9 :Morphologie des colonies productrices de dextrane des espèces de Leuconostoc
(SH1, SH4 et SH8) sur milieu MSE.
53
Figure 10 : Recherche de la citratase sur milieu KMK.
53
Figure 11 : Le profil fermentaire de la souche SH15.
56
Figure 12 : Représente la cinétique d’évolution du pH et de l’acidité Dornic chez les souches
pures (SH4, SH8 et SH13) de en milieu lait.
59
Figure13 : Représente la cinétique d’évolution du pH et de l’acidité Dornic chez les souches
pures (SH16, SH18 et SH3) de en milieu lait.
60
Figure14 : Représente la cinétique d’évolution du pH et de l’acidité Dornic chez les souches
pures (SH20, SH15 et SH1) de en milieu lait.
61
Figure15 : Coagulation du lait par les leuconostoc après 24h d’incubation à 30°C.
62
Figure16 : .L’activité antimicrobienne diriger contre Staphylococcus aureus ATCC 25923
et Bacillus cereus ATCC 11778 par les isolats de Leuconostoc.
68
Figure17 : la sensibilité de l’activité antimicrobienne de la souche SH20 à l’action des
enzymes protéolytiques et sa résistance à la température.
69
Figure18 : l’action des enzymes protéolytiques sur l’activité antimicrobienne de la souche
SH8.
69
Figure19 : Evolution de l’acidité Dornic en culture pure et mixte en fonction du temps de
la souche inhibitrice SH20 et le Staphylococcus aureus.
73
Figure20 : Evolution du pH d’une culture pure et mixte (SH20, S. aureus).
74
Figure 21 : Evolution de la croissance de la souche inhibitrice SH20 et le Staphylococcus
aureus en une culture pure et mixte en fonction du temps.
75
Figure 22 : Croissance de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte sur milieu
Shapman.
76
Liste des tableaux
Tableau 1 : Les espèces incluent dans le genre de Leuconostoc.
9
Le tableau 2 : Les codes utilisés pour la nomenclature des souches ayant été utilisées comme
indicatrices.
39
Tableau 3 : Illustration des résultats des caractères phénotypiques capables d'orienter la
classification du genre de bactéries lactiques.
54
Le tableau 4 : Indiquant le comportement de nos souches vis-à-vis les quatorze sucres
utilisés.
55
Tableau 5: Illustre l’appartenance des souches isolées.
56
Tableau 6 : Résultats des interactions entre souches productrice « Leuconostoc » et les
souches tests « Staphylococcus aureus et Bacillus cereus ».
Tableau 7: Résultats des interactions entre
58
souches productrice « Leuconostoc » et les
souches tests « Staphylococcus aureus » sur milieu tomponné et non tomponné.
58
Tableau 8: l’acidité Dornic en culture pure et mixte en fonction du temps de la souche
inhibitrice SH20 et le Staphylococcus aureus.
67
Tableau 9:Evolution du pH d’une culture pure et mixte de la souche inhibitrice SH20 et le
Staphyloccocus aureus en fonction du temps.
67
Tableau 10:Evolution de la croissance de la souche inhibitrice SH20 et le Staphylococcus
aureus en une culture pure et mixte en fonction du temps.
70
Tableau 11: L’acidité Dornic (°D) en culture pure et mixte en fonction du temps (h) de la
souche inhibitrice SH20 et le Staphylococcus aureus.
73
Tableau 12:Evolution du pH d’une culture pure et mixte de la souche inhibitrice SH20 et le
Staphylococcus aureus en fonction du temps.
74
Tableau 13:Evolution de la croissance de la souche inhibitrice SH20 et le Staphylococcus
aureus en une culture pure et mixte en fonction du temps.
75
Abréviations
Abréviations des noms des bactéries
Lb. :
lactobacillus
Lc. :
Lactococcus
Ln. :
Leuconostoc
St. :
Staphylococcus
Autre abréviations
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ARN : Acide Ribonucléique
NADH: Nicotinamide adenine dinucléotide
LPT : LactoPeroxidase Thyocianate
PCR:
Polymerase chain reaction
ATP : Adénosine Triphosphate
ADH : Arginine dihydrolase
pH :
Potontiel d'hydrogène
Pi :
Phosphate inorganique
Kpb: Kilo paire de base
Ufc :
Unité formant colonie
ORF: Open reading frame
PM :
Pois moléculaire
°D :
Degré dornique
°C :
Degré Celsius
µg :
Microgramme
g:
Gramme
h:
Heure
ml:
Millilitre
Introduction
Les espèces appartenant au genre Leuconostoc sont les bactéries à Gram positif
appartiennent au groupe de bactérie lactique (BL) d'importance économique, lié à de
nombreux aspects positifs:
- Fermentation des produits alimentaires (choucroute, charcuterie, lait, conserves au
vinaigre, etc.).
- Production de gaz (CO2) dans les fromages présentant des ouvertures (en particulier
fromages bleues).
- Production des composés aromatiques dans les produits laitiers multiples.
-Amélioration de la texture par la production du dextrane à partir du saccharose ;
-Rôles potentiels en nourritures fonctionnelles en haute valeur nutritive.
-Production de composés antimicrobiens pour la lutte contre les germes indésirables.
Les leuconostocs sont également liés à quelques aspects négatifs comprenant la
détérioration dans
l'industrie de canne à sucre
et dans les
produits alimentaires
(Susiluoto et al.,2003) par la formation de boue. Cependant, la bibliographie de leur
utilisation en industrie laitière et en agroalimentaire, a mené à la conclusion
de
l’importance de ces microorganismes.
En technologie laitière, l'importance des espèces de Leuconostoc est largement
identifiée. Elles sont souvent présentes
dans des cultures starters dans l’industries
laitière et également dans l'environnement de l’industrie laitière et pourraient être
considérées ainsi en tant que bactérie lactique non-starter
comme les lactobacilles
mésophiles (Cogan, et al., 2002). Leur rôle dans la formation de l'arome et la texture de
certains produits laitiers est essentiel. Elles fermentent les hydrates de carbones en acide
lactique, ce qui provoque une diminution du pH qui devient favorable à la conservation
des aliments. Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition pour les substrats
et sont capable d’élaboration de bactériocines, qui sont des peptides antibactériens,
présentent un spectre d’activité étroit et aussi large diriger contre des espèces pathogènes
qui pourraient contaminer les produits fermentés donc sont très importantes dans la
conservation des aliments.
Notre mémoire porte sur l’étude des espèces du genre Leuconostoc isolées du
lait cru de chèvre et tester leur pouvoir acidifiant et antimicrobienne à effet bactéricide
vis-à-vis des bactéries pathogènes tel que Staphylococcus aureus et Bacillus cereus.
I-Généralité sur le lait de chèvre :
1. Définition :
La chèvre fait partis des animaux domestiques, c’est un mammifère ruminant très
résistant, elle survit la où d’autre animaux ont des difficultés, elle présente selon les
races une grande diversité morphologique due aux origines variées. Les chèvres sont
actuellement répandues dans tout le globe. En Algérie l’élevage caprin vient en seconde
position (14%) après les ovins (26%), il se trouve en masse dans la zone de montagne,
des hauts plateaux et des régions arides, (Benhamouche., 2005).
Les chèvres sont élevées particulièrement à raison de leurs capacités à produire le
lait par lactation, une chèvre peut produire entre 400 et 700 litre de lait par an. Le lait de
chèvre est caractérisé par une odeur de caprin et une couleur blanche mate (Masle et
Morgan., 2001), comme le lait de vache, il offre une bonne teneur et un bon équilibre en
calcium, magnésium et phosphore (Moulay., 2005).
2. Composition du lait de chèvre :
La composition du lait varie selon la race et l’espèce, les conditions
d’environnement et le stade de lactation (Badis ., 2004) La composition chimique à un
rôle important sur son aptitude à l’acidification par les bactéries lactiques, et sa
résistance au facteur extrinsèque « température, micro-organisme de détérioration »
(Masle et Morgan.,2001).
Le lait de chèvre est composé par un pourcentage élevé de micelles de caséine
soluble de 10% à 20%, il est composé de 88,6% d’eau, de 3,28% de matière grasse,
4,29% de lactose, et une quantité de 3,20% de protéine, il est faible en élément
minéraux : (0,64%) Calcium, (0,11%) Phosphore (0,08%) Magnésium, (0,02%),
Sodium (0,04%), Potassium (0,2%) (St-Gelais et al., 1992), certains de ces éléments
sont important sur le plan technologique dans l’équilibre salin et le phénomène de
coagulation.
Badis et al., 2005, ont étudie la distribution qualitative des bactéries lactiques dans
le lait de chèvre chez deux races caprin Algériens (Kabyle et Arabia) et ils ont conclu
que le genre Lactobacillus est le plus dominant à un pourcentage de (61,18%) suivie
des Lactococcus à (22,5%), Streptococcus( 8,88%), Leuconostoc (5,92%) et (0,74%)
pour les Pediococcus dans la population Kabile .
II. Généralité sur Leuconostoc
1. Définition des leuconostocs
Ce sont des microorganismes procaryotes, saprophytes, chimio-organotrophes
morphologiquement extrêmement hétérogènes ne sporulent pas, elles
ne sont
habituellement pas mobiles, dépourvue d’oxydase et de catalase. Le métabolisme
glucidique essentiellement celui du lactose donne de l’acide lactique comme produit
final ce qui les a regroupées avec les bactéries lactique. Le groupe de bactéries lactiques
a été définit pour la première fois par Orla Jensen en 1919. Actuellement les genres
représentant les bactéries lactiques sont les suivants : Vagococcus, Pediococcus,
Aerococcus,
Carnobacterium,
Alloiococcus,
Enterococcus,
Peptococcus,
Lactobacillus,
Peptostreptococcus,
Tetragenococcus,
Gamella,
Streptococcus,
Lactococcus, Pediococcus, Weissella, Oenococcus et Leuconostoc (Jay, 2000, Ghazi et
al., 2006).
Définis pour la 1ère fois par Vantieghem (1878) et grâce aux travaux d’Orla Jensen
(1919) basés sur, le type de l’acide lactique produit ainsi que la dégradation de
l’arabinose et du métabolisme hétérofermentaires, confirmé par Hucker et Pederson
(1931) que ce genre a été séparé des Streptococcus.
Leuconostoc, la famille des Leuconostocaceae, contient des coques ovoïdes (Fig1)
Gram positifs pouvant être allongés ou elliptiques ce sont des cellules sphériques
disposent en paire ou en chaine elles sont caractérisées par un métabolisme
hétérofermentaires en convertissant le glucose en D-lactate et éthanol ou en acide
acétique par la voie de transcétolase, elles sont incapables de dégrader l’arginine ce qui
leurs distinguent des lactobacilles hétérofermentaires. (González et al., 2007).
On range habituellement les leuconostocs dans les anaérobies facultatifs, mais
certains les considèrent comme des anaérobies aérotolérants. Elles sont exigeantes et
présente souvent une auxotrophes pour les acides aminés, les peptides, les vitamines,
les sels minéraux et les glucides (Dellaglio et al., 1994).
Les leuconostocs acidifient peu le lait et certaines espèces ne le coagulent pas, ce
sont des mésophiles, la température optimale de croissance se situe autour du 25°C
selon l’espèce (Badis et al., 2005, González et al.,2007).
Les leuconostocs produisent du diacétyle de l’acétoine, et du CO2 à partir du citrate
du lait mais plus efficacement chez Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris
(Khedid et al.,2006). Ce sont des producteurs d’arome dans l’industrie laitière ; et leur
métabolisme gazogène est responsable de la formation des ouvertures (yeux) dans les
fromages bleus (Bourgeois et Larpent., 1989)
2.
Habitat des leuconostocs
Selon les travaux de Ignacio Sanchez et al.,(2005), les espèces de Leuconostoc
sont très répandues dans la nature, elles colonisent des écosystèmes très variés du
point de vue physico-chimique tel que les végétaux (intact ou pourrissante) et les
animaux (Lait, appareil digestif…).
2.1. Présence dans divers environnement
Les leuconostocs sont présentes dans divers écosystèmes, elles colonisent les
végétaux qui constituent leurs habitat écologique normale (Ignacio Sanchez et al.,
2005). Bien que leur population soit réduite (moins que 1%) comparée à celle des
autres bactéries et des levures aérobies (Buckenhuskes, 1993). A partir de cet habitat
d’origine, ils peuvent facilement se propager dans diverses niches comprenant les
matières végétales telles que les légumes et les ensilages (Ennahar et al., 2003) et les
produits alimentaires fermentés.
Les bactéries du genre Leuconostoc peut être ainsi isolées à partir de la matière fécale
des êtres humains et des échantillons de lait de mammite (Dal Bello, et al., 2003).
Elles ont été également isolées à partir de la microflore de bétail (Brashears, et al.,
2003), de poisson (Ringo et Gatesoupe, 1998), et des insectes (Ohkuma et Kudo,
1998; Reeson, et al., 2003)
Le genre Leuconostoc était parmi les premiers genres du groupe de bactéries
lactiques étudié pour leur rôle causatif dans des pertes commerciales dans l'industrie du
sucre (Day, 1992). Ces bactéries ont été également associés à la détérioration des
poissons (Lyhs, 2002) et des produits carnés (Bjorkroth et al., 2000; Hamasaki, et al.,
2003).
2.2. Présence dans les produits fermentés :
Les bactéries lactiques
appartenant
au genre
Leuconostoc,
jouent un rôle
important dans la fermentation des produits alimentaire variés. La source de la flore
microbienne peut être la matière première quant à la production des fromages de lait
cru, de la choucroute et de quelques saucisses fermentées ou des cultures de ferment
référencier.
Pendant la fermentation, les produits finaux du métabolisme d'hydrate de carbone
contribuent non seulement à l'acidification mais également à la saveur et à la texture du
produit. La fermentation peut également augmenter la qualité alimentaire du produit en
augmentant sa digestibilité, comme dans la fermentation du lait en fromage, ou en
réduisant sa toxicité (Gueguen, et al.,1997).
2.3. Présence en produits laitiers
Les souches de
Ln. mesenteroides subsp. cremoris ou de Ln. lactis
sont
classiquement utilisés dans la production du beurre et de crème et quelques produits
laitiers frais fermentés (Vedamuthu, 1994).
La présence de Leuconostoc
est régulière dans de
nombreuses variétés de
fromage, sans addition des ferments starters de Leuconostoc, en particulier en fromages
du lait cru. Cogan et al.,( 1997) dans une étude étendue sur la flore lactique de 35
fromages européens différents comprenant 24 fromages artisanaux, ont constaté que
parmi 4379, 10% de souche étaient des leuconostocs ; ce taux a été comparé aux taux
des lactobacilles (mésophile, 12% et thermophile 14%) et les entérocoques 17%. Ces
résultats confirment des données précédentes indiquant la présence du Leuconostoc
dans la majorité de fromages de lait cru (Devoyod et Poullain, 1988).
De nombreuses études sont encore consacrées à l’écologie
des fromages
artisanaux, et l’évolution des principaux groupes microbiens pendant la fabrication. Les
études éditées les cinq dernières années se sont fondées
progressivement sur de
nouvelles méthodes qui se base sur la biologie moléculaire (Mas et al., 2002; Tavaria et
Malcata, 2003).
Leuconostoc est présent dans une grande variété de lait fermenté. Ces bactéries
sont également parmi les composants du grain de kéfir, légèrement comparés aux
levures, intervenant dans la production de l'éthanol et de l'acétate, qui sont
caractéristiques de ce produit (Robinson, et al., 2002).
3. Rôle clinique :
3.1. Infection et épidémiologie :
Cliniquement, le leuconostoc a été décrit pour causer la bactériémie primaire,
infections pulmonaires, péritonite et infection du fluide, l'endocardite, la méningite,
l'ostéomyélite, l'abcès et la septicémie péritonéale. La plupart des souches
appartiennent a l’espèce Ln. mesenteroides, l'isolement de Ln. lactis est rare puisque la
plupart des espèces à l’exception de Ln. mesenteroides subsp. cremoris sont capables
de se développer à 37°C (Rodriguez, et al., 1999; Fauchais et al., 2003).
La source de ces infections demeure inconnue. La peau représente un passage
possible dans les cas de co-isolement à partir de la microflore de peau et l'accès à la
circulation sanguine par l'appareil gastro-intestinal a été également suggéré. Dans ces
deux cas, ces germes ont été isolée chez des enfants ou de l'alimentation infantile,
indiquant que ce sont des sources possibles. Leuconostoc dentium est l’espèce la plus
répondue dans les infections dentaires (Dhodapkar et Henry, 1996).
3.2. Résistance aux antibiotiques :
La résistance du leuconostoc à la
vancomycine
est un dispositif intrinsèque
général, ce caractère est lié à la présence d'un pentadepsipeptide avec un C terminal
D -lactate au lieu d'un D - alanine dans le peptidoglycan (Delcour, et al., 1999). Le
gène responsable de la résistance à la vancomycine D-Ala-D-Ala
chez Ln.
mesenteroides a été étudié et cloné par Parc et Walsh, (1997), En revanche peu de
rapports sont disponibles sur d'autres antibiotiques (Deye et al., 2003). Les études
étaient partielles ou bien les agents antimicrobiens examinés et les méthodes employées
(dilution en bouillon, diffusion par disque..) ont différé, ainsi peu de résultats sont
disponibles. Les études sur la susceptibilité antibiotique des isolats de leuconostoc
d’origine cliniques
ont prouvé qu'elles sont résistantes aux quinolones, et aux
glycopeptides. Elles sont susceptibles ou donnent une sensibilité intermédiaire aux
macrolides et aux tétracyclines.
Néanmoins, l'utilisation des cultures bactériennes référenciées dans la production
des produits laitiers a pu représenter un potentiel pour la diffusion des gènes codant la
résistance aux agents antimicrobiens (Teale, 2002)
3.3. Les activités métaboliques bénéfiques sur la santé :
L'hydrolyse des sels biliaires dépend sur l’effet des bactéries intestinales sur les
métabolites de l’être humain. Cette réaction a un effet facilitant pour l'excrétion des sels
biliaires mais peut également être impliquée dans diverses maladies. Les espèces de Ln.
mesenteroides sont incapables d’hydrolyser les sels biliaires (Tanaka, et al., 1999).
Les leuconostocs produisent la D -lactate par le métabolisme d'hydrate de
carbone comme les espèces appartiennent au genre de Lactobacillus delbrueckii (Carr
et al., 2002). Les êtres humains métabolisent lentement la D- lactate de sorte que la
prise quotidienne recommandée ne devrait pas excéder 100 mg Kg-1 (FAO, 1966). Le
D- lactate ou DL - lactate ne devrait pas être employé en nourritures infantiles, sauf
dans des buts thérapeutiques. La consommation normale des produits laitiers n'a pas pu
mener à un excès de D - lactate.
4. Caractérisation et taxonomie
4.1. Identification, caractérisation et biodiversité :
La connaissance de l'écologie microbienne dans diverses places et des processus de
fermentations pourraient également s'améliorer par l'apparition de l'identification
moléculaire quoique les caractères biochimiques demeurent d'intérêt principal pour des
applications technologiques. Il a été basé depuis longtemps sur des caractères
phénotypiques pour isoler et caractériser les bactéries lactiques y compris les
Leuconostoc, ainsi pour différencier entre l'espèce ou la sous-espèce (tableau 1). On
peut citer : la tolérance à l’oxygène, la résistance à la salinité dans des différentes
concentrations, l’aptitude à produire du gaz et des composés aromatiques, le profil
fermentaire et la production des exopolysaccarides.
L’emploi de ces méthodes classiques a l’inconvénient de ne refléter qu’une
quantité réduite d’information sur l'espèce et la sous-espèce de plus le choix des
critères considérés comme des critères de base se diffère d’un auteur à un autre, ce qui
est une source potentielle d’instabilité , Dans les dernières décennies, les nouveaux
outils moléculaires, en particulier les techniques basé sur les progrès réalisés dans la
connaissance de l’ADN, ont contribué largement à clarifier la phylogénie du
Leuconostoc et identifier de nouvelles espèces et ont donné une identification fiable et
cohérente. Ces techniques sont employées seuls ou combinées pour estimer la diversité
moléculaire ou pour identifier les leuconostocs au niveau de l'espèce ou la sous-espèce
(Gurtler et Mayall, 2001).
Les méthodes basées sur l’ADN sont extensivement employé pour la différentiation
des leuconostocs (Reeson et al., 2003). La séparation de l'ADN 16S ribosomal par
l'électrophorèse de gel de gradient de Température Temporelle (TTGE) est d'intérêt
particulier parce qu'elle permet une identification rapide de la plupart des espèces
bactériennes qui colonisent les produits laitiers, y compris les leuconostocs (Ogier, et
al., 2002). La distinction entre les sous-espèces de Ln. mesenteroides : dextranicum et
le cremoris a été confirmé en utilisant des modèles du profil protéique ou ribotypage
(Perez et al, 2002 ; Gazi et al., 2006) tandis que Cibik et al. (2000 ) ont proposé que ces
sous-espèces puissent être des biovars, en utilisant d'autres méthodes moléculaires.
4.2. Taxonomie récente
Seulement quatre espèces de leuconostoc ont été incluses dans le manuel de
Bergey de la systématique bactériologique
(Garvie, 1986), les espèces de
Ln.
mesenteroides comportant trois sous-espèce, Ln. mesenteroides subsp mesenteroides ,
Ln. mesenteroides
subsp
dextranicum et,
Ln. mesenteroides
subsp cremoris
(Tableau1 ) . Les deux faits principaux au sujet du leuconostoc sont la découverte du
genre Weissella
qui comporte
W.
paramesenteroides
(précédemment,
Ln.
Paramesenteroides) et Ln. oenos comme nouveau genre, Oenococcus oeni (Dicks, et
al., 1995). Onze nouvelles espèces ont été décrites (Tableau 1): Ln. gelidum et
Ln.
carnosum
Ln.
isoler dans des produits
à base de viande, Ln.
citreum
et
pseudomesenteroides à partir des isolats cliniques; Ln.fallax de la choucroute, Ln.
argentinum du lait cru de l'Argentine, Ln.gasicomitatum lié à la détérioration de
viande, Ln. kimchii et Ln. inhae provenant du kimchi, Ln. ficulneum des figues
mûres et Ln. fructosum
(précédemment Lb. fructosus). Les souches trouvées dans la
microflore de Vespula germanica présentent une homologie de 90% avec les espèces
connu de Leuconostoc et peuvent constituer un nouveau taxon (Reeson et al., 2003).
Tableau 1 : Les espèces incluent dans le genre de Leuconostoc
Les espèces récentes de Leuconostoc
L’ancienne nomenclature
Ln. mesenteroides
subsp. cremoris
subsp. dextranicum
subsp. Mesenteroides
Ln. lactis
Ln.pseudomesenteroide
s
Ln. carnosum
Ln. gelidum
Ln. fallax
Ln. citreum
Ln. amelibiosum
Ln. argentinum
Ln. gasicomitatum
Ln. kimchi
Ln. culneum
Ln. fructosum
Lactobacillus fructosus
4.3. Comparaison des méthodes d’identification:
Bien que les méthodes moléculaires soient utiles pour la taxonomie et la phylogénie
des souches, les caractères
phénotypiques demeurent rationnels et jouent un rôle
prédominant dans la microbiologie alimentaire. On s’intéresse souvent aux souches
utilisées comme outils dans des activités humaines qui est souvent liée au moins à une
propriété importante et la
compréhension de la relation
entre le génotype et le
phénotype qui représente un grand défi (Morriset et al., 2002).
Ainsi, les souches de Ln. fallax qui ont été caractérisées par des méthodes
phylogéniques (Barrangou et al., 2002), pourraient également être distinguées des Ln.
mesenteroides par la réaction malolactique, qui est absente dans l'ancienne espèce mais
présente
dans la nouvelle espèce. Ceci souligne
l'intérêt de l’étude des critères
phénotypiques qui pourraient être employés systématiquement avant le passage par les
techniques moléculaires, en effet la fermentation de l’arabinose, le raffinose , et le
fructose ( Cibik et al., 2000), la résistance à la vancomycine, la production du CO2 , la
production du dextrane, ainsi que l’utilisation de citrate et la capacité du leuconostoc
d'acidifier le lait à pH 6.5 et à 4.1 ont permis de distinguer entre 107 souches testées
pour des applications en technologie laitière par des études faites par Demirci et
Hemme,1995. Une étude similaire récente a proposé une caractérisation des souches de
bactérie lactique, sur la base des composés neutres
produites dans le petit lait
(Mauriello et al., 2001). Quelques outils qui ne sont pas adéquats à la caractérisation de
l'espèce pourrait néanmoins être employé pour décrire un groupe réduit de souche , le
profile plasmidique
et la fermentation d'hydrate
de carbone pour distinguer
physiologiquement les souches productrice de dextrane ou bien le métabolisme de
citrate, profil type de la fermentation d'hydrate de carbone et l’activités peptidase pour
sélectionner les souches les plus importantes sur l’échèle technologiques (ServerBusson, et al., 1999).Cliniquement les souches de Leuconostoc ont été identifiés par la
résistance à la vancomycine (VAN), et par le marquage de Leu-aminopeptidase (LAP)
et l’activité pyrrolidonylarylamidase (PYR) en utilisant la méthode de diffusion (les
disque) (Facklam, et al., 1995).
5. Croissance du Leuconostoc
5.1. Culture et conservation des cultures
5. 1.1. Isolement et milieux de cultures
Comme toute les BL (Bactéries Lactiques) l’isolement des leuconostocs s’effectue
par la méthode de dilution dans l’eau peptonée (1 g de peptone + 8.5 g NaCl)
devraient être employés (Foucaud et al., 2001).
L’isolement
de Leuconostoc peut être accompli en utilisant des bouillons
d'enrichissement et des milieux sélectifs ou non sélectifs, selon le besoin d'isoler un
genre particulier d'un mélange des micro-organismes ou de maintenir des isolats dans la
culture (Bjorkroth et Holzapfel, 2003).
Les milieux de cultures qui répondent aux exigences nutritionnels générales
(également appelées électives) du Leuconostoc permettent normalement des taux élevés
de croissance, sans
empêcher complètement d'autres genre de bactéries lactiques
« Lactobacillus » de croitre. Les plus communs sont APT, Briggs, MRS, et BHIYE. En
raison de leur basse sélectivité, leur application est limitée aux communautés dominées
par un type ou un groupe de micro-organismes. On a proposé des milieux sélectifs, qui
contiennent un ou plusieurs facteurs
restrictifs, qui permettent la croissance du
Leuconostoc mais inhibe toujours les autres groupes bactériens dans une culture mixte.
Cependant, aucun milieu complètement efficace n'est pourtant disponible. La plupart
des milieux de cultures sélectifs basés sur la capacité de métaboliser le citrate se sont
avérés insuffisants parce que beaucoup de bactéries dans le même habitat (par exemple,
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis métabolisent également le citrate
et pas tout les espèces de Leuconostoc sont capables d’utiliser le citrate). La nature
acidosique ou leur préférence pour les micro-aérophiles aux conditions anaérobies a été
pris en considération. Des facteurs inhibiteurs tels que le sorbate de potassium (MRSS
pH 5.7), l'acétate thallium (MRST pH 6.5), azide de sodium (MSE), ainsi que les
antibiotiques tels que la vancomycine ou la tétracycline ont été plus ou moins efficace
(Mathot et al., 1994).
Le milieu habituel pour la purification des souches de Leuconostoc est le MRS
milieu classique ou modifié par l'absence de l'extrait de viande et de citrate, les milieux
de cultures utilisés pour réaliser des études physiologiques : le profil fermentaire des
sucres, production de gaz, formation de dextrane, dégradation de citrate et d'autres ont
été développés et utilisés (Bjorkroth et Holzapfel 2003).
Dans une culture mixte de Leuconostoc avec Lactococcus sur , MRS contenant
30µgmL-1 de vancomycin qui reste le milieu le plus simples et efficace pour détecter
Leuconostoc, les
lactococcus seront inhibé par des faibles
concentrations (la
concentration inhibitrice minimale est inférieur à 2.5 µg mL-1, mais puisque il est
possible de rencontrer des souches de Lactobacillus résistantes à la vancomycine il est
préférable d’utiliser le milieu LUSM additionné à la vancomycine, tetracycline et jus de
tomate. (Mathot et al ., 1994). Le milieu M17 contenant 5% de glucose pourraient
également être employé puisque Lactococcus donne des grandes colonies après 24 h
tandis que Leuconostoc exige 48 h (Liu, et al.,1997). Sur milieu MRS avec 5-bromo-4chloro-3-indolyl-
-D-galactopyranoside les souches de Leuconostoc qui sont
-
galactosidase ( -gal) positives donnent des colonies bleues qui peuvent être distinguées
des Lactococcus qui sont négatives (Mathot et al., 1994; Bellengier et al., 1997). Ce
milieu est également pratique pour la détection du genre ainsi il est utilisé pour la
distinction entre les espèces de Leuconostoc qui sont
-gal positives des espèces -gal
négatives.
Leuconostoc se développent à 30°C comme les Lactococcus mésophiles mais
favorisent une température plus basse. La plupart des souches se développent bien à
10°C et même à 4°C (Hamasaki et al., 2003).
5. 1.2. Conservation des cultures
Pour la conservation à court terme de Leuconostoc, des cultures jeunes peuvent
être ensemencé sur MRS agar contenant 1% lactose et stockées à 4°C pendant 1 –2
semaines. La viabilité peut être maintenue en lait de tournesol contenant 5% d’extrait
de levure et 5% de glucose ou dans du bouillon MRS contenant 1% de lactose et 10%
de glycerol en tant qu’agents protecteurs pendant 6 mois à 1 année à -20°C ou excédent
pendant longue période à -80°C. L'utilisation des cultures en phase exponentielle donne
une viabilité maximum lors de la congélation (Bellengier et al., 1997; Bjorkroth et
Holzapfel, 2003). La lyophilisation des souches de Leuconostoc d’intérêt dans du lait
contenant 4% de lactose a eu comme conséquence une bonne survie à long terme et une
bonne conservation des caractéristiques métaboliques.
6. Resistance des Leuconostoc au stress
Les espèces de Leuconostoc peuvent survivre à
de longues durées dans les
environnements défavorables aussi divers que le sucre, le pétrole ou les industries
laitières. Elles sont restées viables pendant plusieurs années sur la surface « du gerle en
bois » (Fig.2), les moules en métal ou en plastique et d'autres outils en bois ou en verre
utilisés
dans
les
fromageries
traditionnels
(Devoyod
et
Poullain,
1988).
L’environnement hostile favorise les phénomènes d'interaction à travers la formation
des colonies visqueuses en présence du saccharose et des traces minéraux, sous forme
d’un biofilm, qui protège les cellules contre les agents nuisibles (Kim, et al., 2000). Le
lait caillé du fromage muri permet probablement la survie du Leuconostoc qui ont été
détecté a un niveaux cellulaires très élevés (Devoyod et Poullain, 1988;Mor-Mur, et al.,
1994).
Dans une solution tamponnée avec un tampon de potassium, la capacité des
cellules non proliférantes de se lyser était inférieure pour les cellules développées en
MRS contenant le lactose ou le galactose que celui qui contient du glucose et varie en
fonction de la souche de 7% à 44% après 24 h d’incubation à 30°C et à pH 6,5 (Cibik
et Chapot-Chartier, 2000). En technologie fromagère, la dépendance des souches de
Leuconostoc a été également démontrée et une faible lyse qui a été observé confirme
celle observé dans le tampon (Martley et Crow, 1993).
L'homéostasie du pH interne est essentielle pour la croissance et la survie de tout
les micro-organismes, y compris Leuconostoc mais la croissance bactérienne est un
processus d’autoinhibition par l'acidification du milieu externe et l'accumulation d'acide
(Cogan et Jordan, 1994; Konings, 2002). Par exemple quand le pH du milieu externe
se diminue, le pH interne des cellules de Ln. mesenteroides diminue aussi
contrairement aux espèces de Lc. Lactis. La croissance s’arrête quand les valeurs du pH
internes « cellulaire » atteintes 5.4 à 5.7. En revanche, le pH cellulaire externe est
considérablement influencé par le pH du milieu de culture, la concentration et la nature
des acides organiques.
La réponse au choc de la chaleur chez les espèces de Ln. mesenteroides consiste à
l’arrêt de l’expression des protéines de stress (Salotra et al., 1995). La régulation du
choc thermique se fait par une protéine homologue : la Ctsr cette dernière a été
identifié chez Oenococcus oeni et chez les autres bactéries Gram positives, suggérant
également son existence chez Leuconostoc (Derre, et al., 1999).
Les technologies des techniques de préservation et de conservation, telles que la
technologie de la haute pression, qui combinent la réduction efficace de germe, la
rétention maximale des produits chimiques et des propriétés physico-chimiques de
produit, font actuellement l’axe de recherche. Wuytack, et al., (2002) ont réalisé des
traitements à haute pression s'étendant entre 100 et 300 MPa d'homogénéisation à 25°C
pendant 15 minutes et qui ont prouvé que les bactéries Gram positives, incluant les
Ln. mesenteroides étaient plus résistantes
que les bactéries Gram négatives. La
structure du peptidoglycane contribue probablement à la résistance tandis que tous les
deux groupes ont dissimulé à une pression hydrostatique élevée. La destruction du
Leuconostoc dépend du niveau de la pression et la durée du traitement, la résistance
des Ln.
mesenteroides a la pression étant inférieurs à celui
cerevisiae (Basak, et al. , 2002).
de
saccharomyces
Figure1 : Leuconostoc mesenteroides, image au microscope à contraste de phase .La
barre=10µm
Figure2 : L’adhérence du Leuconostoc sur le moule du gré glacé, examen réalisé par
microscopie électronique (Devoyod et Poullain, 1988)
7. Métabolisme du Leuconostoc
Le métabolisme général du
Leuconostoc
est présenté dans la Figure3, sa
connaissance a beaucoup progressé au cours de ces dernières décennies, en particulier
en ce qui concerne le transport des substrats dans l’espace intracellulaire et les
processus énergétiques qui sont associent.
Les leuconostocs sont assimilent reconnues pour être très exigeantes, du point de
vue nutritionnel, ils sont considérés comme faisant partie de la famille des bactéries
hétérotrophes, c’est-à-dire quelle n’assimilent que faiblement le dioxyde de carbone et
requièrent pour leur développement des substances organiques supplémentaires (Khedid
et al., 2006).
Il a été démontré que la croissance des bactéries lactiques et en particulier des
leuconostocs étaient contrôlées
par deux principaux facteurs : l’acide lactique qui
inhibe et les substances nutritives qui limitent la croissance de ces bactéries. Il est à
noter que l’effet de ces facteurs est fortement dépendant de la composition du milieu de
culture (Bibal et al, 1989).
7.1. Utilisation d'hydrate de carbone
Leuconostoc ne possède pas les cytochromes fonctionnels et manque de quelques
enzymes de cycle de Krebs ces bactéries ont besoin d’un apport de nutriments
comportant au moins un sucre fermentescible comme source d’énergie (Cogan et
Jordan 1994). Une grande variété de mono-et de disaccharides maintiennent la
croissance des leuconostocs (Server-Busson et al., 1999). La fermentation de
l'arabinose, le xylose, le ribose, et le fructose par les souches de Leuconostoc constitue
un critère phénotypique important pour la caractérisation d'espèce, de sous-espèce et
pour la caractérisation et le choix des souches de grand intérêt pour l'application
industrielle.
La fermentation des sucres s’effectue principalement en deux étapes,
premièrement, le transport des hydrates de carbones à travers la barrière hydrophobe de
la membrane cellulaire. Deuxièmement la dégradation du sucre et la formation et
l’expulsion extracellulaire des métabolites terminaux.
7.1.1. Transport de sucre
Les cellules de Leuconostoc ramasse les hydrates de carbone par les perméases
qui permettent l'entrée des sucres dans la cellule sans modification du substrat (par
exemple phosphorylation quand le système de phosphoénolpyruvate-phosphotransférase
« PEP-PTS » est impliqué). le système PEP-PTS est constitué de trois enzymes (EI,
EIILac et EIIILac ) et d’une protéine de transport (HPr) (Hengstenberg et al.,1989). EI
catalyse le transfert du phosphate du phosphoénolpyruvate à un déchet Histidine de
HPr, EIILac et EIIILac sont des enzymes inductibles spécifiques du lactose et catalysent
le transfert du phosphate du HPr au lactose de plus EIILAC est une protéine
membranaire, qui fixe spécifiquement le sucre et assure son transport ( Thompson,
1989)
7.1.2. Catabolisme de sucre
Le métabolisme des sucres chez ce genre de bactérie lactique s’effectue par la voie
hétérolactique qui utilise les voies de la glycolyse et celle du pentose -6 phosphate, et
conduit à l’abaissement du pH et à la production d’acides organiques (Ignacio Sanchez
et al.,2005) .
Les leuconostocs fermentent le glucose en quantité équimolaires de D(-) lactate,
éthanol (acétate), le CO2 (Kihal et al., 2006) et le pyruvate. Le pyruvate est encore
réduit par un D- lactate déshydrogénase en D- lactate qui sera ensuite employé pour la
synthèse de peptidoglycane. Le gène de D- lactate déshydrogénase, D-ldh de Ln.
mesenteroides a été cloné par Phalip et al., (1994). La réaction finale pourrait être
affectée par l'acétaldéhyde exogène, qui est pris du milieu quand il existe et utilisé
comme un récepteur d'électron. La proportion des métabolites dépend de la conversion
de l'acétyle-P formé à partir du xylulose-5-P. L'acétate kinase dirige le flux vers la
formation de l'acétate avec production d’ATP, l’énergie supplémentaire étant employée
pour la croissance, tandis que le phosphotransacetylase (ATP) produit acétyle-CoA qui
est employé pour la biosynthèse ou pour le ré-oxydation du NADH avec la production
de l'éthanol par l'alcool déshydrogénase. Le gène pta qui a été cloné semble ne pas
être associé au gène de l’acétate kinase, les deux gènes étant comme monocistronique
de transcription (Bourel et al., 2001).
Leuconostoc fermente le fructose à fructose-6-P, qui pénètre alors dans la voie de
pentose-P et se converti en mannitol sans Co-formation du sorbitol (Von Weymarn,
et al., 2002a). L’oxydation de NADH vers NAD + est achevé par la réduction du
fructose en mannitol par une NADH- dépendant mannitol déshydrogénase. Ceci
affecte l'équilibre redox de la cellule et favorise la production de l'acétate au lieu de
l'éthanol de sorte qu'un ATP soit gain. L'enzyme est un tétramère de 4 sous-unité
identique d'environ 38 kDa (Aarnikunnas, et al., 2002; Hahn et al.,2003). Hahn et al.,
(2003) ont cloné le gène de mannitol déshydrogénase (mdh). La séquence du gène et
de l'enzyme sont distinctes de ceux des autres bactéries lactiques, les hybridations se
sont produites faiblement avec quelques souches de Lactobacilles hétérofermentaires.
La question est demeurée pour savoir si cette particularité est liée à l'utilisation du
fructose comme un accepteur d'électron.
Le galactose et le mannose sont probablement employés par l'intermédiaire de la
voie de Leloir (Cogan et Jordan 1994). Les gènes du galactose sont codés par le
chromosome et le gène galK du Ln. lactis a été étudié et cloné récemment (Grossiord,
et al., 1998). L'utilisation de la voie du D-tagatose a été récemment étudié (Bertelsen,
et al., 2001).
Des pentoses sont convertis en xylulose-5-P qui sera catabolisé
ensuite
en
glycéraldéhyde-3-P et acétyle-P. Ni l'éthanol et ni l'acétaldéhyde n'est produit et 1 mole
d’ATP et d’acétate sont formés à partir d'acétyle-P (Cogan et Jordan, 1994).
Le lactose est clivé en galactose et glucose par la
-galactosidase ( -gal )qui est
codé par deux gènes super enrouler (lacL et lac M), qui sont fortement homologues
(99%) avec ceux de Lb.casei (Cogan., 1995). Les deux monosaccharides sont alors
employés par l'intermédiaire de la voie de Leloir et de pentose-P, respectivement. La
plupart des souches de Leuconostoc
se développent en présence d'une basse
concentration de lactose (20 g L-1), tandis que peu exige une concentration élevée,
équivalente à celle qui existe dans le lait (50 g L-1) ou plus. Dans ce cas, l'induction des
-gal peut limiter la croissance (Carr et al.,2002).
L'utilisation de raffinose par Leuconostoc varie d’une espèce à une autre et les
enzymes impliquées sont (l’ -galactosidase et la
-fructosidase), ce caractère a été
étudié dans la limite de l'équilibre de fermentation et de l’'induction (Server-Busson et
al., 1999; Carr et al., 2002).
Dans les milieux de cultures à base de saccharose, une large fraction de ce dernier,
est convertie en dextrane qui se libère à l’extérieur de la cellule et en fructose dans
l’espace cytoplasmique. L'autre fraction pénètre dans la cellule, où elle sera
phosphorylée par une phosphorylase de saccharose puis converti en glucose-6-P. Le
gène de phosphorylase de saccharose de Ln.mesenteroides a été détecté et cloné par
Kawasaki, et al., (1996).
Quelques polysaccharides (par exemple cellulose) sont aussi métabolisée (Carr et
al., 2002) comme les dextranes qui sont des exopolysacchacarides difficiles à la
dégradation (Eggleston et Legendre, 2003) mais peu d’information sont connus
relativement sur l'excrétion des produits métaboliques finaux et la régulation du
catabolisme des hydrates de carbone.
7.2. Métabolisme d'acide organique
Le citrate et le malate sont les deux principaux acides organiques métabolisés par
Leuconostoc, le métabolisme du premier est la fonction importante chez certaines
espèces lactiques de ce genre conduisant à la formation d’arôme, notamment le
diacétyle et a la production du gaz en produits laitiers (Kihal et al., 1996, Ignacio
Sanchez et al.,2005) , tandis que le dernier n’a pas d’importance parce que le lait ne
contient pas du malate (Konings, 2002).
Le citrate présent dans le lait à (8 mM) et d’avantage dans le caillé du fromage il
n’est pas comme une source unique d'énergie chez Leuconostoc mais peut être dégradé
en présence d'un sucre fermentescible et d’une source d’azote. Le transport du citrate à
travers la membrane cellulaire est assuré à l’aide d’une citrate perméase, ou il est
scindé en acétate et en oxalo-acétate par le complexe enzymatique citrate-lyase (Bekal
et al., 1998) selon un système de transport secondaire dépendant
motrice (Bourel et al., 2001). L'Arg
425
d’une force proton
de la perméase est impliqué dans le procédé de
transport du citrate et des S-énantiomères des
autres
substrats avec un
2-
hydroxycarboxylate (Bandell et Lolkema., 2000; Bourel et al., 2001).
Intérieurement, Hcit-2
est encore dégradé en acétate et
oxalo-acétate, qui sera
décarboxylée en pyruvate. L'addition du citrate au glucose augmente le taux de la
croissance spécifique et le rendement de la croissance molaire chez Ln. mesenteroides
Figure 3 : Métabolisme général du Leuconostoc. Les produits principaux formés sont
indiqués dans "bold". Les nombres se rapportent à des enzymes impliquées ou à des
étapes: (1) Dextrane- saccarose; (2) Mannitol-déshydrogénase; (3) -galactosidase;
(4) Estérase;(5) HADH oxydase ; (6) alcool- déshydrogénase; (7) Phosphoketolase;
(8) Phosphotransacetylase, (9)
-acétolactate décarboxylase; (10) Acétate kinase ; (11)
-acétolactate synthase; (12) décarboxylation non-enzymatique ; (13) Diacétyle
réductase; (14) Décarboxylase d'oxaloacétate; (15) lactate déshydrogénase; (16)
Metabolisme du citrate; (17) Malate déshydrogénase; (18) Formation d'aspartate; (19)
Enzyme malolactique; (20) ATPase. (Foaud., 2004)
dans ces conditions, le lactate est produit à partir du métabolisme de citrate et du
glucose et les échanges entre le citrate et le lactate favorise le métabolisme du citrate.
Konings (2002) a étudié la conservation d'énergie métabolique et l'homéostasie de pH
par le métabolisme de citrate chez Ln. mesenteroides.
L'utilisation du citrate mène à la formation du diacétyle, qui est un composant
important de saveur des produits laitiers, et d'autres composés tels que
l'acétate,
l'acétoine et le 2,3-butanediol. Une partie des réactions prévues impliquées dans la
formation du diacétyle reste peu clair. Deux voies différentes peuvent conduire au
diacétyle
ou
l’acétoine
par
l’acétoine
réductase
ou 2-3 buthyléne
glycol
déshydrogénase. Alors le diacétyle pourrait être produit par l'intermédiaire du diacétyle
synthase bien que cette enzyme n'ait pas été clairement détectée dans d’autres bactéries
lactiques. L’autre manière d'obtenir le diacétyle, est la décarboxylation oxydative d'un
-acétolactate formé à partir du pyruvate. Récemment, le décarboxylase d'acétolactate
du Ln. lactis a été purifié et séquencé (O'Sullivan, et al., 2001).
Le Co-métabolisme du citrate plus xylose chez Ln. mesenteroides a comme
conséquence une stimulation de la croissance, une augmentation de production de D lactate et d'acétate et une répression de la formation de l'éthanol (Schmitt et al., 1997).
Ceci se corrèle avec la formation d'acétyle-P de pentose.
Les espèces de Leuconostoc cremoris sont capables de produire le diacétyle à partir
du citrate, ce processus est très important dans l’industrie laitière (Dellaglio et al.,
1995).
Les mécanismes génétiques du transport et du métabolisme de citrate ont été
progressivement étudiées. Lin et al., (1991) ont montré que les gènes codants pour la
citrate perméase sont portés par des plasmides et sont localisées sur des plasmides de
23 Kb Chez les Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides. Kihal et al (1996) ont
constaté l’instabilité de ce caractère puisque qu’il est liée à la perte du plasmide citrate,
tandis que Bourel et al (2001) ont montré que ce phénotype semble stable chez Ln.
lactis et la souche de Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris ( Ec 195) puisque
qu’il est localisé sur le chromosome donc l’existence d’une exception est possible.
Les gènes impliqués dans la dégradation du citrate sont chromosomiques et
disposés dans un lieu de clyR-mae-citDEF dans des Ln. mesenteroides (Bourel et al.,
2001). Les gènes de La citrate perméase (citP) de Ln. lactis (Vaughan et al., 1995) ou
Ln. Mesenteroides, le gène d'utilisation du citrate (cit CDEFG) de Ln. mesenteroide
ou (cit MCDEFGR P) des Ln. paramesenteroides ainsi que le gène d'une protéine
putative de régulation la clyR (Bourel et
al., 2001) ont été séquencé et clonés.
L’enzyme diacétyle -réductase a été purifié et le gène a été cloné et séquencé par
Rattray et al., (2003).
La plupart de bactéries lactiques, y compris Leuconostoc à l’exception de Ln. fallax
effectuent la fermentation malolactique avec la formation de L-lactate et CO2 à partir
du malate par l'enzyme malolactique ( Barrangou et al., 2002; Konings, 2002).
7.3. Métabolisme de composés azoté
7.3.1. L’exigence des acides aminés :
Les souches de Leuconostoc sont des microorganismes fastidieux, exigent pour
leurs croissances des acides aminés et des vitamines en plus des hydrates de carbone
fermentescibles. Les exigences nutritionnelles pour des acides aminés est variable
considérablement entre les espèces et les souches, les acides aminés leucine, isoleucine
et valine, aussi bien que la glutamate sont avérés essentiel, ainsi que la serine qui
stimule la croissance de quelques souche de Leuconostoc, alors que l'alanine n'est pas
exigeant par toutes les leuconostocs (Foucaud et al., 2001).
Les espèces appartiennent au Ln. mesenteroides peuvent synthétiser l'aspartate de
l'oxaloacétate par l'intermédiaire de la transamination, qui peut être plus tard convertie
en Aspargine et participe à la biosynthèse des pyrimidines et des purines (Konings.,
2002). L’aptitude du leuconostoc d'utiliser des acides aminés libre ou comme mélange
en présence ou en absence d'un accepteur aminé supplémentaire varie selon les souches
et les espèces, suggérant que Leuconostoc offre soit un grand potentiel à la production
de la flaveur des acide aminés ou cible légèrement la physiologie et la maturation de
fromage (Tavaria, et al., 2002; Liu, et al., 2003).
7. 3.2. Le système protéolytique
Leuconostoc se développe mal dans le lait puisque aucune souches n'excède 5 x
108ufc ml-1 .La croissance des Leuconostoc peut être stimulé jusqu'au 109ufc ml-1 quand
le contenu du (NPN) du lait est artificiellement augmenté par l'addition des acides aminés
ou des peptides (par exemple mélange d'acide aminé, extrait de levure, etc..). Ceci indique
qu'ils manquent d'activités protéolytiques proportionnées qui pourraient leur fournir NPN
assimilable (Bellengier et al., 1997).
7.3.2.1. L'utilisation de protéine : Contrairement au Lactococcus, peu d'attention a été
consacré au système protéolytique de Leuconostoc bien que peu de souches aient montré
quelques activités caséinolytiques, ceci n'a pas contribué beaucoup à la croissance. Trois
composants
structuraux sont impliqués dans ce métabolisme ; les protéases
qui
hydrolysent les caséines en peptide, les peptidase dégradent les peptides et les système de
transport qui permet le passage des produits issus de la dégradation à travers la membrane
cytoplasmique (Herreros et al., 2003).
7.3.2.2. L’utilisation et le transport de peptides : Ln. mesenteroides peut utiliser un
grand nombre de Di-et des tri-peptides et oligopeptides jusqu' à sept résidus d'acides
aminés pour la croissance (Foucaud et al., 2001). Les capacités varient selon les souches.
Aucune dégradation extracellulaire des peptides ne se produit pendant le transport de
peptide. Des peptidases sont localisées au niveau intracellulaire (Foucaud et al., 2001).
Des systèmes séparés de transport ont été montrés pour échanger la prise des acides
aminés et de leurs dipeptides chez Ln. mesenteroides (Foucaud et al., 2001). Récemment,
le système de transport d'oligopeptide pour des peptides contenant au moins quatre résidus
d'acide aminé ont été caractérisés dans Ln. mesenteroides. Le transport des peptides peut
être augmenté en présence des ions de Mg+2 ou de Ca2+ (Germain -Alpettaz et al., 2002).
Les profils peptidases de la plupart des souches de Leuconostoc sont comparables à ceux
du Lc. lactis (Foucaud et al., 2001; Herreros et al., 2003). Cependant, dans l’extrait
cellulaire du Leuconostoc, l’activité de carboxypeptidase était soit significative soit faible
ou absente (Macedo, et al .,2000; Herreros et al., 2003), alors qu'une telle activité n'était
pas définitivement observée en employant les cellules entières, suggérant l'absence d'un
carboxypeptidase ou bien l’absence d’un système adéquat de transport ou de la spécificité
de la peptidase existante (Foucaud et al., 2001).
7.3.2.3. Le transport et l’utilisation des acide aminé : le transport des acides
aminés à chaînes branchées dans les membranes cytoplasmiques chez les espèces de
Ln. mesenteroides a été caractérisé comme un système canal dépendant d’une force
proton-motrice- (Winters, et al., 1991). Récemment, les systèmes multiples de transport
d'acide aminé ont été caractérisé en utilisant les cellules entières de la bactéries,
certains de ces systèmes ont été partagés par plusieurs acides aminés et
caractéristiques cinétiques pourraient être un outil
leurs
supplémentaire pour estimer la
biodiversité des leuconostocs (Gendrot et al., 2002) bien que leur activité ne limite pas
la croissance.
7. 4. Métabolisme de leuconostoc en présence de l'oxygène
Habituellement les métabolites issus d’une fermentation anaérobie du glucose chez
ce genre exigent de bactérie lactique sont essentiellement le lactate, l’éthanol et le CO2,
mais dans les conditions aérobies l'acétate est largement substitué à l'éthanol et les
vitesses de la croissance ainsi que le métabolisme de glucose sont plus rapide qu’en
absence d’oxygène. Ainsi la fermentation hétérolactique des leuconostocs en présence
d’oxygène est liée à une augmentation du rendement de l’ATP et conduit à une
accélération de la croissance et à une production augmenté de biomasse (Plihon, et
al.,1995).
L’oxygène est employé comme un accepteur alternatif d'électron et se réduit en
peroxyde d'hydrogène plus eau (Condon, 1987; Cogan et Jordan, 1994). Ceci est dû à la
plus grande
synthèse de
efficacement la
NADH
oxydase et de l’acétate-kinase, qui régénère
réduction des équivalents pour continuer la fermentation et
seul
l'acétyle-P est employé pour la formation de l’ATP et de l’acétate plutôt qu'à la
réduction à l'éthanol comme dans le Co-métabolisme du sucre et du citrate. La NADH
oxydase de Ln. mesenteroides a été décrite comme un dimère ou un tétramère avec une
masse moléculaire de
sous-unité de 53 ou 55 kDa, respectivement, dépendant
probablement de la souche et du FAD comme cofacteur (Sakamoto, et al., 1996).
Les niveaux intracellulaires élevés du manganèse Mn+2 (6-10 mmolL-1)
pourraient
fournir au Leuconostoc autant qu’une autre bactérie lactique, un mécanisme important
de défense contre l'O-2 endogène et toute autre réaction de l'oxygène. Ceci pourrait être
lié à leur habitat original où le manganèse Mn+2 est présent à des concentrations
élevées (Horsburgh et al., 2002).
7. 5. Métabolisme lipidique :
La détection de l’activité estérase chez Leuconostoc avec des galeries
enzymatiques (Biomérieux, France) en employant le - naphtyle comme substrat
(Milliére et al., 1989) a montré des taux d’hydrolyse progressivement faible .
Meyers, et al., (1996) n’ont pas détectée l'hydrolyse de la tributyrine, du trioleine,
et de la tributyrine ou du beurre chez Leuconostoc en utilisant milieu Elliker-rhodamine
tandis que l'hydrolyse de la tributyrine a été récemment décrite chez Ln. mesenteroides
en utilisant les dérivés de naphtyle et la détection
postélectrophoretique (Katz et al.,
2002). Leuconostoc lactis synthétise principalement les esters éthyliques et butyliques
de la
tributyrine et de l'éthanol pendant l'incubation dans un bouillon par
l'intermédiaire d'une réaction de transférase (Liu, et al., 2003b). Il a été démontré que le
S-methylthioacetate est le seul thioester constitué par des cellules de Leuconostoc
incubées avec le methanethiol seul ou en conjonction avec des diverses chaînes courtes
d’acides gras (Lamberet, et al., 1997).
8. La génétique des Leuconostocs :
L’étude de la génétique des leuconostocs est récente comparée à celle d’autres
bactéries la plupart des intérêts génétique autrefois s'étaient concentré sur l'instabilité
des phénotypes essentiels dans les fermentations d’intérêt industriel (Dessart et
Steenson.,1995) ; mais elle a évolué rapidement au cours de la dernière décennie. Son
domaine couvre plusieurs axes de recherche :
-l’étude des conditions de mutagènes des bactéries et de l’obtention de variant ou de
mutants.
-l’exploitation de leur génome : la caractérisation du chromosome, des plasmides et le
gène qui les constituent.
-l’étude des systèmes de transfert naturels, in vitro, existent parmi les bactéries
lactiques.
-la mise au point de transfert de gène in vitro par la technologie de l’ADN recombiné,
fondement du génie génétique.
Le matériel génétique ou le génome de Leuconostoc est formé de plusieurs
molécules d’ADN distinctes capable de se répliquer de manière autonome ; on parle de
réplicons. Le plus grand d’entre eux, formé de 1800 à 2600 kilos pairs de bases (KPB),
le chromosome (ou nucléosome) qui porte l’ensemble des gènes nécessaires aux
synthèses cellulaires, à la croissance et à la division cellulaire et qui est responsable de
l’identité de l’espèce bactérienne.
Les
cellules
bactériennes
peuvent
contenir
aussi
des
éléments
extra
chromosomiques : des réplicons plus petit, généralement libres dans le cytoplasme,
appelés plasmides, et le génome d’un ou de plusieurs phages tempérés, le plus souvent
intégrés dans le chromosome (De Roissart et Luquet, 1994).
Comme toute
Les bactéries de la flore lactique les leuconostocs
ont des
pourcentages de G+C très différent d’une souche à une autre, la classification
bactérienne proposée par Larpent, (2000) les a classé parmi les bactéries à Gram (+) à
un faible pourcentage de G+C.
Les espèces de
Leuconostoc héberge un ou plusieurs plasmides indigènes de
diverses tailles. L'utilisation de lactose, l’activité du citrate perméase (Dessart
et
Steenson, 1995), la production de bactériocine, et la diacétyle réductase (Rattray et al.,
2003) sont tous des caractères liés à des plasmides mais la fonction de la majorité des
plasmides n’a pas encore été connu. L’organisation génétique et le mode de réplication
des petits plasmides cryptiques ont été récemment décrits (Biet, et al., 1999 ; Biet, et
al., 2002).
La séquence nucléotidique et l'organisation structurale du plasmide pCI411 (2,9
kb) du Ln. lactis 533 (Coffey et al., 1994) et du plasmide pFR18 (1,8 KBS) des Ln.
mesenteroides FR52 qui ont été étudié par Biet et al., (1999) ont suggéré que leur
réplication se fait par le mécanisme de cercle de roulement. Touts ces plasmides
peuvent être utiles pour la construction des vecteurs d’intérêt.
9. Intérêt biotechnologique des leuconostocs :
Comme toutes les bactéries lactiques, les espèces appartiennent au genre
Leuconostoc sont employées empiriquement depuis des siècles pour la fermentation
d’un grand nombre de produits dans différent industries. (Champagne, 1998).
En effet le rôle majeur de ces bactéries est la production d’acide lactique et du
CO2 qui change la texture, le goût et la qualité microbiologique des produits fermentés,
(Devoyod
et Poullain,
1988). La production d’acide facilite la coagulation des
protéines par la présure et provoque l’abaissement du pH qui limite aussi la croissance
des bactéries indésirables (Doleyres, 2003).
L’action de cette bactérie sur la conservation d’un aliment est liée à la production
d’acide lactique et à l’abaissement du pH. Les leuconostocs peuvent aussi assumer la
production de nombreux agents antibactériens tels que les bactériocines, qui contribuent
à inhiber la croissance des flores indésirables et des germes pathogènes tel que
Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes. Enfin elles ont une action
déterminante sur les qualités organoleptiques des produits fermentés (Drouault et
Corthier, 2001)
Les espèces aromatisantes des leuconostocs comme Leuconostoc mesenteroides
subsp. cremoris produisent des composés aromatisants qui contribuent au goût des
produits frais et à la production de CO2 responsable d’ouvertures dans le fromage.
Enfin, certaines espèces
produisent des exopolysacchrides tel que le dextrane qui
influence notamment l’aspect et la texture des produits fermentés. (Doleyres, 2003 ;
Khedid et al ., 2006)
9. 1. Rôles dans la technologie agroalimentaire:
Les leuconostocs sont employé dans la production des produits alimentaires
fermentés tel que le fromage, le yaourt etc.., ce genre de bactéries lactiques donne une
saveur caractéristique et améliore la texture et la saveur d’une grande variété de produits
fermentés (Khedid et al ., 2006).
Les leuconostocs sont considérés comme une base d’amorçage bactérien requis
dans l’industrie laitière, ces bactéries sont caractérisé par la production du CO2 qui
provient de l’héterofermentation du lactose et de la dégradation du citrate (Bourel et al.,
2001 ).
Les espèces de Leuconostoc mesentéroides sont employées dans la fabrication des
produits laitiers frais comme la crème fraiche, le beurre et le fromage frai. Leuconostoc
mesentéroides est aussi utilisé dans la fermentation de choucroute et de vinaigre cette
espèce se trouve dans la nature sur la surface des feuilles fraiche de chou (Cibik et al .,
2000)
Le rôle de Ln. mesenteroides subsp cremoris dans la production d'arome a été bien
décrit (Vedamuthu, 1994), mais cela a été
moins identifié chez d’autre
Ln.
mesenteroides. Ln. mesenteroides subsp cremoris est connue depuis longtemps par son
potentiel aromatique, était l'adjonction unique disponible. De la même manière, la
littérature reflète plus l'utilisation du Ln. mesenteroides subsp. cremoris que les autres
espèces appartenant au même genre
d’information. En effet,
cela est due
principalement à un manque
il a été démontré que les isolats du fromage de lait cru
appartiennent principalement aux Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln.
mesenteroides subsp. dextranicum
et
Leuconostoc citreum mais pas à Ln.
mesenteroides subsp. cremoris (Devoyod et Poullain, 1988; Cogan et al., 1997; Cibik et
al., 2001).
9. 1. 1. Les formations des ouvertures:
La formation des ouvertures et des cavités « Eyes » est la règle pour les fromages
et en particulier le Roquefort à veines bleues qui
seront ensuite
colonisé par
Penicillium roqueforti. En fromages mûris à pate molle, Leuconostoc crée une cavité
résultant de la production du CO2. En cours de la fabrication des fromages Hollandais
mûris tels que l'Edam, le Gouda et toute autre fromages salé, les petites ouvertures
brillantes sont également due à la production du CO2 par Leuconostoc présent dans les
cultures starter et sont pas liées aux ouvertures mécaniques ( Martley et Crow, 1996 ;
Khedid et al., 2006).
Dans la production du fromage Roquefort, Leuconostoc représente de 5% à 10%
7
-1
de la concentration de Lactococcus ; c’est -à-dire 5x10 cellules par ml du lait, la
6
concentration minimale est de 10 cellules mL-1. Des résultats optimaux ont été obtenus
avec une sélection des souches de Ln. mesenteroides subsp mesenteroides utilisés en
tant que suspensions cellulaire concentrées (Devoyod et Poullain, 1988. )Dans quelques
cas, la population du Leuconostoc d’origine naturel de lait et de l'environnement est
capable de créer des bonnes ouvertures (Martley et Crow, 1996).
La concentration maximal du CO2 produit est de 16 le mmol kg-1 au fromage,
correspondant à l'utilisation de 8mmol L-1 du citrate existant dans le lait, mais
l'activité change entre les espèces et les souches ( Bellengier, et al., 1994). Les
souches qui dégradent le citrate doivent se développer pendant les étapes préliminaires
de la production du fromage (pression) bien que les conditions classiques (30°C)
soient défavorables au
Leuconostoc. Ils doivent survivre pour
continuer ce
métabolisme pendant la maturation en l'absence des hydrates de carbone (Bellengier, et
al., 1994).
9.1.2. Production d'arome
Les composés principaux liés à l'utilisation du
Leuconostoc dans l’industrie
laitière sont le diacétyle, l’acétate et l’éthanol contribuant également à la formation
d'arome (Vedamuthu, 1994). Le niveau du diacétyle qui peut donner l'arome désiré est
moins de (1,5 à 5 ppm) due à son bas seuil de flaveur. Le nombre suffisant des cellules
et des conditions physico-chimiques particulières sont exigés pour l'utilisation optimale
du citrate et de la production d'arome. Leuconostoc peut convertir le diacétyle en
acétoine et en 2,3-butanediol, qui
ne donnent pas
l'arome. Cette transformation
défavorable pourrait être abaissée quand les produits tels que le lait fermenté sont
refroidis après la
généralement
production d'arome. Le stockage des fromages mûris se fait
à une température qui varie entre 10 à13°C, au-dessus de celle exigé
pour arrêter le processus.
L'acétaldéhyde excessif, qui peut être produit par des cultures starter en babeurre
et dans le lait fermenté mène au développement du « green » qui est un défaut de
saveur. Sous la réfrigération, Leuconostoc peut réduire l'acétaldéhyde en éthanol,
l'activité étant maximale pour Ln. mesenteroides subsp. cremoris (Vedamuthu, 1994;
Cogan et Jordan, de 1994), en revanche le niveau élevé du sel et la basse activité de
l'eau dans le fromage a pH bas, réduisent le métabolisme d'acétaldéhyde chez cette
même espèce (Liu et al., 1997).
9. 2. Rôles en nourritures fonctionnelles
Un aliment fonctionnel comporte un composant qui a pour but de
favoriser la
santé ou important pour empêcher une maladie, en général, le terme est employé pour
indiquer un aliment qui contient quelques facteurs de santé (Health-promoting) au delà
des aliments traditionnels. Ceci inclut l'addition du probiotique dans des aliments et la
production des métabolites bénéfiques pour la santé (Ouwehand et al., 2003).
9. 2. 1. L’effet probiotique du Leuconostoc :
Comme quelques micro-organismes actuellement proposés aux consommateurs,
Leuconostoc peuvent être considérer comme des bactéries probiotiques ces dernières
peuvent être décrite comme étant « un supplément alimentaire microbien qui peut
affecter favorablement l’animal hôte en améliorant sa flore intestinale » (Roy, 1996)
Les produits contenant ces bactéries probiotiques peuvent avoir un effet prophylactique
ou thérapeutique sur la santé. Récemment, des études de la praticabilité du contrôle de
diarrhée chez des enfants consommant du lait fermenté contenant 108 g-1 de Lc. lactis
et de Ln. mesenteroides ont indiquées la réduction de la durée moyenne de cette
diarrhée (Agarwal et Bhasin, 2002).
9.2. 2. Production des polysaccharides et l’effet prébiotique:
Certaines
souches de
Leuconostoc qui appartenant aux
espèces de Ln.
mesenteroides sont capables de produire des exopolysaccharides (EPS), qui sont des
homopolysaccharides composant d'un -D- glucane ; tels que le dextrane qui est lui
même principalement composé de résidus de
-1,6 lié avec des degrés variables
(spécifique de la souche ). La production du dextrane exige la présence du saccharose
sous l’action d’une enzyme d’induction la dextrane-sucrase. La glycosyltransferase
spécifique est également impliquées dans le processus de la biosynthèse du dextrane
(Monchois, et al., 1999). Ce caractère a fait l’objet de plusieurs études ; huit gènes
codants pour glucane-sucrase chez Ln. mesenteroides ont été identifiés et clonés par
Bozonnet et al., (2002). Le gène codant la dextransucrase DsrD a été efficacement
exprimé et
sécrété dans une cellule donatrice hétérologue (Lc.lactis MG1363) et
peuvent conduire à la synthèse de dextrane. Récemment, le gène d’une inulosucrase
chez une espèce de Ln. citreum a été cloné, séquencé et exprimé chez E. coli. Les
inulosucrases bactériennes, codant pour la production de l'inuline, ont été seulement
rapportés chez des mutants de Streptococcus et chez Lb. Reuteri (Olivares-Illana, et
al., 2003).
En technologie
laitière,
le dextrane, comme toutes
les autres EPS, sont
employées comme des additifs alimentaires, comme des agents de texture en
augmentant la viscosité, et comme stabilisateurs en renforçant la rigidité du réseau de
caséine en liant les bandes hydrogène de l'eau en agissant avec les constituants de lait.
Par conséquent, les EPS diminues la synérèse et améliore la stabilité de produit. Ils
jouent un rôle intéressant dans la fabrication du lait fermenté, les crèmes, et le lait
aromatisé (Cooke, et al., 2002).
En plus des avantages technologiques, certains EPS sont prétendus avoir des
effets physiologiques bénéfiques sur le consommateur. On suppose que la plus grande
viscosité d'EPS contenue dans les aliments peut augmenter le temps de séjour du lait
fermenté ingéré dans le tractus gastro-intestinal et donc peuvent être bénéfique pour la
colonisation du transit intestinal par les bactéries probiotiques (German et al., 1999).
Les leuconostocs ont été proposés comme agent prébiotique pour stimuler la
croissance des bactéries bénéfiques utiles dans le tube digestif du nouveau née (Djouzi
et al.,1995) et il a été prouvé que les
mesenteroides NRRL-B-18242
- gluco-oligosaccharides produits par les Ln.
sont fortement résistantes à l'attaque des enzymes
digestives.
9. 2. 3 Production de mannitol
Le mannitol est un sucre à basse calories qui pourrait remplacer le saccharose, le
lactose, le glucose ou le fructose dans des produits alimentaires. Il est métabolisé
indépendamment de l'insuline et est également applicable dans les produits alimentaires
diabétiques. Les espèces appartenant au Ln. pseudo-mesenteroides et Ln. mesenteroides
sont connues par leur capacité à produire le mannitol dans la fermentation du fructose.
(Von Weymarn, et al.,2002).
9. 2.4. Hydrolyse des -galactosides
Les -galactosides tels que le stachyose et le raffinose qui sont généralement
présents dans les plantes (soja, maïs…) sont des composants non métabolisés par les
être humains ni les animaux à cause de l’absence de l’ - galactosidase dans la
muqueuse intestinal de ces être vivants, ce qui peut entraîner un ballonnement. Pour
surmonter ces inconvénients et pour amplifier la consommation de ces composants,
plusieurs travaux ont été réalisés afin d'éliminer les - galactosides en utilisant des
méthodes physiques ou par l’utilisation des enzymes spécifique ( -galactosidase). En
dépit de la capacité du Leuconostoc de fermenter l’ - galactosides (Prévost et al.,
1993; Huang ,et al.,1994) les propositions et les tentatives à employer l’ -galactosidase
des Ln. mesenteroides
comme approche biotechnologique pour métabolisé les
-
galactosides, sont toujours au cour de la recherche et ne sont pas encore bien définis
(Huang et al., 1994 ).
9. 2. 5. Production des vitamines
Des souches de Ln. mesenteroides produisant des quantités significatives de
menaquinones ont été
caractérisées, ces souches seraient proposé comme cultures
starters dans la fermentation des aliments d’origine laitière (et autre) ou des suppléments
diététiques empêchent les maladies d'insuffisance de vitamine. Récemment, la
production de la vitamine B9 a été rapportée chez Ln. lactis et les espèces de
Ln.
paramesenteroides (Sybesma, et al., 2003).
10. Leuconostoc et l'interaction microbienne
Les levains mésophiles de BL (Bactérie lactique) utilisés dans l'industrie laitière
sont des mélanges des genres, des espèces, des souches et même des différentes variant.
Leur composition n'est pas toujours connue ainsi, en particulier dans le cas des levains
naturels. Dans l'addition, les interactions microbiennes, sont soit bénéfiques
(coopération) ou antagoniste (inhibition) et peuvent mener aux changements
incontrôlables de la composition des levains (Juillard et al., 1998). Les interactions
positives peuvent avoir comme conséquence une stimulation de la croissance ou une
meilleure production de métabolite. Elles sont soit directe, comportant les contacts
physiques des individus ou indirect, dus à la modification
des substrats
ou des
paramètres du milieu. Les interactions négatives peuvent aussi être soit directes où les
bactériophages sont impliqués ou elles pourraient être aussi indirectes par la sécrétion
des
métabolites toxiques ou antimicrobiens et la concurrence vis-à-vis de
la
consommation d’un substrat. Leuconostoc, y compris les bactéries lactiques sont très
connues par la production d’une variété de composés antimicrobiens, tels que les acides
organiques, le peroxyde d'hydrogène, l’éthanol, le diacétyle et les
bactériocines.
(Ozlem Osmanagaoglu.,2007)
10.1. Réactions de Co-agrégation
Le matériel extracellulaire isolé de Ln. mesenteroides subsp. dextranicum ATTC
663 a montré que l’interaction physique avec des cellules de Lactococcus cause une
Co-agrégation (Gopal et al., 1996). Ceci peut faciliter les interactions et (ou) la Coculture pendant la fabrication de fromage.
10. 2. Croissance du Leuconostoc en cultures mixtes :
Les souches de Leuconostoc se développent bien
en communauté
avec les
Lactococcus productrice d'acide et leur croissance en culture mixte a été étudiée en se
basant sur le métabolisme du citrate et la formation d'arome. Ce phénomène a été
décrit comme une synergie (Jordan et Cogan, 1995). Les leuconostocs métabolisent le
citrate à un pH de 6,3 à 4,5, et produisent le diacétyle et l'acétoine seulement dans des
conditions acides, ainsi, pour lancer le métabolisme du citrate et pour produire des
composés aromatiques, une production
suffisante d’acide par Lc. lactis est exigée
pour diminuer le pH en milieu lait (Cogan et Jordan, 1995).
Moins d'attention a été consacrée au taux de croissance, la production d’acide et la
biomasse finale de ces bactéries, qui reflètent également l'interaction qui se produit
dans les cultures mixtes de Leuconostoc et du Lactococcus, la
croissance de
Leuconostoc était soit stable soit elle a été inhibé pendant la phase exponentielle et
systématiquement dans la phase
stationnaire (Vedamuthu, 1994; Bellengier et al.,
1997). L'inhibition a été habituellement supprimée par l'addition des peptides ou des
acides aminés, prouvant que la concurrence pour les nutriments azotés est un dispositif
général de culture mixte du leuconostoc et Lactococcus en milieu lait (Bellengier et
al., 1997). It faut noter que lorsque la concentration des besoins azotés est à l’extrême,
le comportement des souches de Ln. mesenteroides désavantage souvent les Lc. lactis
(Foucaud et al., 2001; Gendrot et al., 2002), et que l’addition de ces composées peut
même entrainer chez certaines souches des phénomènes d’inhibition de la croissance,
En revanche, la croissance maximale améliorée de Ln. lactis CNRZ 1091 dans les
cultures mixte avec le Lc. lactis subsp. cremoris AM2 en milieu lait a illustré une
bonne coopération entre ces deux espèces. Les différents types d'interactions peuvent se
produire selon les souches utilisées dans les cultures mixtes dans le lait mais aussi sur
la température de croissance. Une croissance élevée des espèces se produit pendant
l'incubation entre 21°C et 25°C. À une température un peu plus (au-dessus de 25°C), le
rapport métabolique devient plus actif. Lc lactis, se développe à une vitesse plus rapide
à une température plus élevée (entre 25°C et 32°C) relativement par rapport au
Leuconostoc (Liu et al., 1997 ; Barrette et al, 2000).
10. 3. La production d’acide organique
Le mécanisme par lequel Leuconostoc empêche la croissance d’autre genre de
bactérie lactique ainsi que les bactéries pathogènes a été également
produits issus de la dégradation d'hydrate de
attribué aux
carbone et de citrate (Caplice
et
Fitzgerald, 1999). L’effet antimicrobien des acides, y compris les acides lactiques et
acétiques, affectent les propriétés de la
membrane
cytoplasmique : telles que le
potentiel de la membrane et l'intégrité de la cellule (Cabo, et al., 2002). Il faut noter
que l’acide acétique est plus toxique que l’acide lactique, en milieu faiblement
tamponnée, les deux acides agissent en synergie : l’acide lactique contribue à diminuer
le pH du milieu, augmentant ainsi la toxicité de l’acide acétique.
D’autres produits du catabolisme manifestent un pouvoir inhibiteur : Jan et Gill
(1982) ont montré que le CO2
inhibe certains décarboxylases. Les propriétés
antibactériennes du diacétyle ou de l'éthanol ont été également décrites, bien que leurs
effets soient légers dans des fermentations lactiques habituelles (Drosinos et al., 2006).
Dans la présence de l'oxygène, Leuconostoc accumule le peroxyde d'hydrogène qui
pourrait être inhibiteur à quelques micro-organismes (Condon, 1987). Cette
accumulation résulte un déséquilibre entre les systèmes de dégradation et de synthèse.
(De vuyst et Degeest, 1999).
10.4. Les Bactériophages du leuconostoc :
L'absence des rapports indiquant des problèmes dans l’industrie laitière liée aux
bactériophages des leuconostocs peut expliquer la rareté
des études sur de tels
bactériophages. En plus, la croissance lente des souches de
Leuconostoc dans les
levains des cultures mixtes pourrait également expliquer la difficulté rencontrée pour
identifier ces bactériophages dans les fermentations
qui se caractérisent par une
production normale d’acide. Cependant, des bactériophages actifs
contre le
Leuconostoc ont été isolés dans les produits laitiers (des échantillons de petit lait, le
fromage, etc.). Ces bactériophages appartiennent à la famille de Siphoviridae (Dessart
et Steenson, 1995; Ackermann, 2001).
10. 5. Les bactériocines produites par Leuconostoc
Selon Jack et al ., 1995 « Les bactériocine sont des molécules de nature protéique,
synthétisées par la voie ribosomique, sécrétées dans le milieu extracellulaire et douée
d’une activité bactéricide dirigée essentiellement contre des espèces taxonomiquement
proche de l’organisme producteur ».
Ces peptides antimicrobiens sont des composants essentiels du système immunitaire
naturel des
cellules vivantes, elles
sont capables d’empêcher à de petites
concentrations la croissance des bactéries indésirables, telles que les micro-organismes
de
détérioration
et
certains
bactéries
pathogènes
(Listeria
monocytogenes,
Staphylococcus aureu etc.)transmises par les aliments (Osmanagaoglu.,2007)
Peu de rapports existent sur l'action antimicrobienne de Leuconostoc contre les
micro-organismes de détérioration et les bactéries pathogènes, dans lesquels l'activité
inhibitrice est attribuée
à une
bactériocine (Stiles, 1994). Les études qui sont
anciennes ou préliminaires, étaient limitées dans l'isolement des souches productrices
des substances antibactériennes , et leurs caractérisations inachevées (Fantuzzi et al.,
1999; Brashears et al., 2003; Pepe et al., 2003).
Les bactériocines produites par les souches de Leuconostoc appartiennent aux
bactériocines de la sous-classe IIa
comme « les pediocine » : petits peptides non-
modifiés thermostables, et actifs contre Listeria (Ennahar, et al., 2000). La
mesentericine Y105 et B105 et la mesenterocine 52À et 52B des Leuconostoc ont été
intensivement décrits et leur activité biologiques, ainsi que leurs structure et leurs
propriétés ont été analysées (Corbier, et al., 2001; Morisset et Frére , 2002). Les gènes
structuraux de La mesentericine Y105 et B105, la mesY et la mes B respectivement
ont été clonés par plusieurs chercheurs (Héchard et al., 1999 ; Castano et al.,2005).
L’action de la Mesentericine Y105 a été mise en évidence par cytométrie en flux
(CMF), cette technique a permis de suivre en direct une co-culture de Leuconostoc
mesenteroides Y105 et de Listeria monocytogenes
(Héchard et al., 1992) ou le
dénombrement pour chaque bactérie a montré une dominance rapide de Leuconostoc
mesenteroides Y105, la mesentericine Y105 semble avoir une action spécifique contre
Listeria monocytogenes. Castano et al., (2005) ont ainsi confirmé cette propriété et ils
ont rapporté que cette bactériocine est constitué par 37 résidus et réticulé, par un pont
en bisulfure. La leucocine H (Blom et al., 1999) et la dextranicine 24 (Revol-Junelles
et Lefébvre, 1996) ont été ainsi décrites comme des bactériocines produites par
Leuconostoc.
La leucocine J produite par Ln.sp.J2 possède un spectre d’activité plus vaste,
hormis les bactéries lactiques, elle inhibe aussi un grand groupe de bactéries
pathogènes : Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Serratia
marcescens et Yersinia enterocolitica.
Les différents mécanismes, y compris la composition de la membrane en acide gras
ou en protéine putative d'immunité, induisent des
phénomènes de résistance aux
bactériocines chez les leuconostocs (Limonet, et al.,2002 ).
Bien que les bactériocines produites
par Leuconostoc
d'origine laitière (la
mesentericin Y105) soient étudiées pour leur usage possible dans la conservation des
aliments, l'addition d’une bactériocine produite par des leuconostocs dans les aliments
n'a été jamais rapportée. En effet, pour l'efficacité optimale contre les aliments
contaminé par
les bactéries
pathogènes et des germes de
détérioration, des
bactériocines peuvent être employées en tant qu'un système de conservation des
aliments, qui implique un ensemble de facteurs antimicrobiens (Ennahar et al., 2000;
Cleveland, et al.,2001).
III-Généralité sur Staphylococcus aureus et Bacillus cereus
1. Staphylococcus aureus
1.1. Caractéristiques générales :
Appartient à la famille des Micrococcacea, germe cocciforme de 0,8 à 1 un de
diamètre, à Gram positif, immobile, acapsulé sauf de très rares souches sont entourées d’une
pseudo-capsule asporulé, isolé en diplocoques et le plus souvent en amas ayant l’aspect d’une
grappe de raisin (Larpent., 2000). Staphylococcus aureus est un germe aèro-anaérobie
facultatif, il se cultive très facilement sur tous les milieux usuels à température optimum de
37°C et à pH optimum de 7.5. Il peut aussi se développer entre 10°C et 45°C.
En bouillon, on assiste à un trouble uniforme abondant en 24 heures, avec un dépôt
pulvérulent, collerette ou léger voile à surface au bout de 48 heures sans production de
pigments (Freney. 2000). Sur gélose, les colonies sont arrondies, de 1 à 2 mm de diamètre,
humides, opaques, luisantes et crémeuses à surface lisse et brillante et à bords réguliers, c’est
les formes S (smooth). On observe le passage de la forme smooth à la forme R (rooth) avec
des formes rugueuses qui sont antigéniquement dégradées et moins virulentes. Les souches
pathogènes de Staphylococcus aureus présentent une activité protéolytique élevée, une
catalase active, absence d’oxydase, présence de cytochromes d et e, de coagulase, d’une bétalactamase et d’une lipase. D’autres caractères biochimiques se rapportant à ce genre : nitrate
réductase, la réaction de Voges-Proskauer (VP) et la coloration au rouge de méthyle ainsi que
l’uréase sont tous positifs, présence d’une gélatinase, pas de production du CO2 dans la
fermentation de la pluparts des sucres comme le galactose, le glucose, le mannose, le
mannitol, le lactose et le saccharose.
Le test d’hémolyse sur gélose au sang et positif, le type d’hémolyse se diffère d’une
souche à une autre.
1.2. Toxines staphylococciques et la production de pigments:
La plupart des souches produisent un pigment jaune doré ou jaune citron ; mais certaines
donnent des colonies blanches.
Le pigment est produit en présence d’oxygène, de CO2 et de calcium à une température
légèrement inférieur à la température optimal de croissance. Sa production et favorisée par la
présence d’acide gras. Ce pigment est soluble dans les solvants des graisses, il est de nature
caroténoïdes.
Pour s’adapter aux conditions du milieu à l’intérieur d’un hôte Staphyloccus aureus
produit des substances métaboliques de nature protéiques (Les hémolysine et les leucocidines)
qui présentent une détermination génétique.
1.3. Le staphylocoque et les intoxications alimentaires :
Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène responsable d'une large et divergente
gamme des infections chez les êtres humain et les animaux, y compris les intoxications
alimentaires. Dans beaucoup de pays, le Staphylococcus aureus est considéré le deuxième
ou troisième germe pathogène le plus commun causant des manifestations d'intoxication
alimentaire, après les salmonelles et le Clostridium perfringens (Ananou et al., 2005).
En générale le Staphylococcus aureus est effectivement contrôlé à pH 5,3 ou moins
dans l’environnement. Par conséquent, un des manières recommandées pour inhiber
sa
croissance dans les produits fermentés est l'addition des bactéries lactiques à la formulation,
pour réaliser ce pH en un intervalle court de temps (Sameshima et al., 1998). Cependant, il
semble que les métabolites bactériens comme les acides lactiques et acétiques ainsi que la
production de bactériocine sont les responsables majeurs de l'inhibition de cette bactérie,
plutôt que le pH bas lui-même. En fait quand le pH est ajusté avec de l'acide chlorhydrique,
on ne pourra pas observée l’inhibition de Staphylococcus aureus. Néanmoins, la persistance
et/ou le développement de ce germe en produit fermentées avec des valeurs de pH inferieur
à 5 comme le yaourt a été rapportée fréquemment (Ananou et al.,2005).
l'utilisation potentielle des inhibiteurs additionnels à bas pH, tel que des bactéries
lactique avec l'activité anti-staphylococcique, est étudié (en les employant seul ou en
combinaison avec d'autres agents physiques ou chimiques) pour le bio-contrôle de ce microbe
pathogène en alimentation (Thomas et al., 2000).
Contrairement aux autres staphylocoques communs, Staphylococcus aureus produit une
coagulase ; une enzyme responsable de la coagulation du sang. Les types de croissance sur
gélose au sang servent aussi à identifier ces staphylocoques. Récemment, on a déterminé la
structure de l’a-hémolysine staphylococcique. La toxine lyse les cellules en formant dans sa
membrane plasmique, des canaux où s’engouffre le solvant. Les monomères de toxine,
solubles dans l’eau, se fixent à la surface de la cellule et s’associent entre eux pour former
des pores. Ces canaux hydrophiles offrent un passage libre à l’eau, aux ions et aux petites
molécules. S. aureus se développe généralement sur les muqueuses nasales et peau ; on le
trouve aussi dans les appareils gastro-intestinal et urinaire des animaux à sang chaud.
2. Bacillus cereus
2.1. Caractéristiques générales :
Appartient à la famille des Bacillaceae, les bactéries de ce genre habituellement font
partis de la flore de l’environnement et ne sont pas souvent impliqué en pathologie humaine,
en revanche il est actuellement bien établie que certaines espèces de ce genre peuvent causer
des toxi-infections alimentaires chez l’homme. Bacillus cereus est la principale espèce
incriminé, ces germes se présentent sous forme de bâtonnets à Gram positif donnant des
spores thermorésistants et généralement mobiles. Ce sont des bactéries aéro-anaérobie ou
aérobies stricts, possèdent une catalase mais dépourvue d’oxydase, Bacillus cereus
ne
fermente pas le mannitol mais possède une phospholipase très active (Bourgeois et al.,1996)
2.2. Pouvoir pathogène :
Bacillus cereus peut contaminer plusieurs aliments d’origine végétale ou animale par la
production des spores qui reste viable et donnent des formes végétatives au germe en cas
d’une courte cuisson, la multiplication de la bactérie se fait à une température de 15°C à50°C
et secrète une entérotoxine qui provoque des symptômes diarrhéiques (Gaillard, 1989)
Les toxi-infections alimentaires dus à Bacillus cereus se représentent prés de 5% des cas
de toxi-infection alimentaires dans certaines statistiques anglo-saxonnes, et peuvent être
observé dans deux formes :-Dans le 1er aspect, la période d’incubation est de 8h à10h avec
une diarrhée persistante comme symptôme principal.-Dans le second aspect, la période
d’incubation est un peu moins, sa durée est de 1h à5h, et les symptômes principaux sont des
vomissements et l’absence de la fièvre (Turnubrull et al., 1973).
L’objectif de ce mémoire est de mètre en évidence les interactions microbiennes entre les
espèces deLeuconostoc mesentéroides et ces bactéries pathogènes dans le but d’une bonne
bio-préservation des aliments ainsi pour lutter contre les intoxications alimentaires en Algérie.
1. Prélèvement et collection des échantillons :
Les souches de Leuconostoc utilisées dans notre étude ont été isolées à partir de deux
biotopes différents : des échantillons du lait cru de chèvre
notamment du fromage de
Roquefort ; avec l’emploi de quelque souche pathogène fournie
par le laboratoire de
microbiologie appliquée de l’université d’Oran.
Le tableau suivant donne les codes utilisés pour la nomenclature des souches ayant été
utilisées comme
indicatrices (Souches pathogènes) qui sont des souches référenciées et
Gram+:
Le tableau 2 : donne les codes utilisés pour la nomenclature des souches ayant été utilisées
comme indicatrices (Souches pathogènes).
Souche
Code
Staphylococcus
ATCC 25923
aureus St
Bacillus cereus
Bc
Origine
Laboratoire central de microbiologie du CHUO
Souche lyophilisée
ATCC 11778
1.1. Les échantillons des laits de chèvre :
1.1.1. Provenances des échantillons :
Trois échantillons de lait crus de chèvres ont été collectés à partir de trois animaux
différents dans deux fermes de la région ouest d’Algérie (Oran, Tiaret), cette diversité à pour
but d’obtenir une collection de souche appartenant à des espèces lactiques différentes.
1.1.2. Collecte du lait :
Le lait cru doit être traité avec un grand soin afin d’éviter toute risque de contamination
qui peut influencer sur la flore lactique et donc les leuconostocs et ceci par la réalisation du
prélèvement dans des conditions aseptiques en lavant les mamelles de la chèvre et l’endroit
avec de l’eau savonneuse et la collecte du lait doit se faire dés le premier jet dans des flacons
stériles qui sont transportés à 4 °C au laboratoire.
1.1.3. Mesure de l’acidité Dornic et le pH des échantillons :
L’acidité Dornic et le pH de chaque échantillon du lait
doivent être mesurés par
titrimétrie et par le pH-mètre.
1.2. Les échantillons du fromage de Roquefort :
Trois échantillons de fromage ont été utilisés pour isoler les espèces de Leuconostoc:
R1
Fromage bleu Danois «Danemark ».
R2
Bergader « Allemagne».
R3
Société Roquefort « France ».
2. Isolement et purification des souches de Leuconostoc :
2.1. Milieux de culture et d’isolement :
Nous avons employé dans notre étude des milieux de cultures sélectifs pour les
Leuconostoc afin d’inhiber et ralentir la croissance des autres genres de bactéries lactiques :
-Milieu MRS (De Man Rogosa et Sharpe 1960) additionné à un antibiotique la vancomycine à
raison de 30µg/ml dont la plus part des bactéries lactiques sont sensibles a cette dose.
-Milieu MSE (Mayeu, Sandine et Elliker 1962). Badis et al .,2005
Sur lesquelles les espèces de Leuconostoc produisent des colonies de forme spéciale.
2.2. Traitement des échantillons :
2.2.1. Du lait de chèvre :
-On réalise à partir de chaque échantillon du lait de chèvre des dilutions décimales jusqu’à
10-8 dans de l’eau peptonée.
-On prélève à partir des trois dernières dilutions 1 ml qu’on ensemence en profondeur dans
des boites de Pétrie contenant du MSE ou MRSv .
2.2.2. Du fromage Roquefort :
Une quantité de 1 g de chaque échantillon de fromage du Roquefort est broyée avec 9 ml
d’eau physiologique stérile. Après agitation au vortex jusqu’à l’homogénéité, des dilutions
décimales jusqu’à 10-6 sont réalisées.
1ml des trois dernières dilutions est prélevé et
ensemencé en profondeur dans le milieu MRSv et MSE (Badis et al., 2005).
Toutes les boites sont incubées en anaérobiose à 30°C pendant 48h à72h (Mathot et al.,
1993 ;Khedid et al., 2006).
2.3. Isolement et purification :
L’isolement des bactéries lactiques suspect Leuconostoc
à été fait à partir des boites de
pétrie contenant un nombre de colonies compris entre 25 et250, réalisé selon les méthodes
décrites par la Fédération internationale du Lait.
La purification des bactéries isolées a été établie par la réalisation des subcultures sur
bouillon et milieu MRS agar jusqu’à l’obtention de colonies bien distinct et homogène. La
pureté des souches est vérifier par l’étude microscopique et les leuconostocs seront identifier
selon les tests classiques (Mathot et al., 1994, Kihal 1996 et Kihal et al., 1996).
3. Identification et caractérisation des souches :
Les isolats ont été caractérisés selon plusieurs méthodes de façon à mettre en évidence la
diversité phénotypique de la collection (Carr et al., 2002).
3.1. Test phénotypique
3.1.1. Examen macroscopique :
Les cultures obtenues sur boite de Pétrie sont observées à l’ il nu pour caractériser la forme
la taille et l’aspect ainsi que la couleur des colonies (Badis et al., 2006).
En effet les colonies des Leuconostoc rependent généralement au critère morphologique
suivant :
-Colonies transparentes très petites.
-Un diamètre compris entre 0,5 et 1 mm
-Un contour régulier.
-Une forme circulaire lisse sur MRS et gluante et visqueuse sur milieu MSE.
3.1.2. Examen microscopique :
Il s’agit d’observer la morphologie cellulaire et le type d’association par la coloration de
Gram. L’observation microscopique renseigne sur la forme et la disposition des cellules
bactérienne et détermine ainsi le Gram. La sélection les bactéries lactiques suspectes
Leuconostoc se fasse sur l’aspect cellulaire qui sont des cocci ovoïdes et se regroupe en paire
et en chainette (Rodolphe et al., 2002 ; Khedid et al., 2006). Les isolats sont tous Gram
positive.
3.1.3. La catalase :
La catalase est une enzyme respiratoire qui permet la dégradation du peroxyde d’hydrogène
en eau et oxygène :
H2O2
H2O + ½ O2
La recherche de la catalase se fait par la mise en contact d’une colonie bien isolée avec une
goutte d’eau oxygéné ; un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse ou de bulles
traduit la décomposition de l’eau oxygéné sous l’action de la catalase (Guiraud, 1998).
NB : Les bactéries présentes une réaction positive à la coloration Gram et dénuée d’activité
catalase et asporulé ont été retenus.
3.2. Test physiologique et conservation des souches
3.2.1. Croissance en milieu hypersalé :
L’habilité des souches à croître dans un milieu hypersalé est testé en bouillon MRS à 6,5 %
de chlorure de sodium (NaCl), comme témoin en utilise milieu MRS dépourvue de NaCl.
L’incubation est réalisée à 30°C pendant 5 jours (Guessas et Kihal, 2004). La croissance des
bactéries est appréciée par l’apparition d’un trouble dans les tubes (Leveau et Bouix ,1980).
3.2.2. Croissance à pH 9,6 :
Ce test est effectué en inoculant un bouillon MRS dont le pH est porté à 9,6 par des précultures de 18h des souches pures. Les tubes sont incubés à 30°C pendant 24 à 48h. Présence
du trouble signifie un résultat positif (présence de croissance).
3.2.3. Croissance à différente température :
Des cultures sont ensemencées sur bouillon MRS et incubées pendant 5 jours et sont
incubées à des températures différentes 15 °C ,37°C et 45°C (Guessas et Kihal, 2004)
La croissance est exprimée par le trouble du milieu et l’apparition du dépôt au fond du tube.
3.2.4. Test de thermorésistance :
Des pré-cultures de 18h sont soumises à une température de 63°C pendant 30min puis
incubée à 30°C pendant 24h.
3.2.5. Conservation des souches :
-Conservation à court terme : Des souches pures cultivées sur MRS incliné sont conservées à
4° C.
-Conservation à long terme : Le culot bactérien d’une culture en phase exponentiel est
conservé à -20°C dans de lait écrémé additionné du glycérol à 3O%.Au fur et à mesure des
besoins les souches sont décongelée rapidement et repiquées dans du lait écrémée avant
chaque utilisation (Samelis et al., 1994).
3.3. Test biochimique :
3.3.1. Production de dextrane :
La capacité des leuconostocs de produire cette exopolyshacaride rend ce test important
pour leur identification au niveau de l’espèce (Ignacio Sanchez et al., 2005). On réalise des
ensemencements sur milieu MSE de Mayeux et al., (1962), par des pré-culture de 18h puis on
incube à 30°C pendant 24 à 48 h
Les souches dextranigéne sont caractérisées par la formation des colonies gluantes.
3.3.2. Recherche de l’arginine hydrolase (ADH) :
Ce test est très important pour différentier
les leuconostocs des lactobacilles
héterofermentaire (Moulay et al., 2006). Des cultures jeunes des souches sont ensemencées
sur milieu M16BCP (Thomas, 1973) et sont incubée à 30 °C pendant 24 à 48 h.
Les souches dites ADH négatif virent la couleur du milieu au jaune qui signifie la
dégradation du glucose par contre le catabolisme de l’arginine et la libération de l’ammoniac
(NH3) neutralisent l’acidité et garde la couleur stable du milieu violette.
3.3.3. L’utilisation du citrate :
La dégradation du citrate se fait grâce à la citratase, il s’agit d’une enzyme qui existe
dans certaines espèces de Leuconostoc
donc la recherche de la citratase oriente
l’identification des espèces. Sa mise en évidence se fait par la réalisation d’une culture sur
milieu Kempler et Mc Kay (1980) (Kihal et al ., 1996 ; Moulay et al., 2006).
3.3.4. Recherche du type fermentaire :
Ce test permet d’apprécier la nature de la fermentation des substrat carboné le type du
métabolisme (homoférmentaire ou hétéroférmentaire ).
Un bouillon MRS contient une cloche de durham est inoculé par une culture jeune de la
souche à testé et incubé pendant 24h à 48h à une température de 30°C.
Il faut se rappeler que les leuconostocs sont tous productrice de CO2 (héteroférmentaire), donc
ce test est un caractère de base pour leurs identifications.
3.3.5. Métabolisme des sucres :
Ce test permet de connaître l’aptitude des bactéries à utilisées certains sucres.
Le milieu approprié à cette étude est également du bouillon MRS contenant le pourpre de
bromocrésol (0.04 g/l) comme indicateur de pH et additionné avec 1% de différents sucres ou
chaque souche est repiquée dans différents tubes selon la méthode décrite par Stiles et al.,
(1997) :
Des cultures e phase exponentiel de nos souches sont repartis dans des epindorfs à un
volume de 2ml puis on centrifuge à une vitesse de 5000 tours pendant 5min, on garde le culot
et on le lave avec de l’eau physiologique pour éliminer toute marque de milieu puis on
centrifuge une seconde fois ensuite on ajoute au culot bactérien 2ml de MRS BCP. Les tubes
ont été agités pour homogénéiser le mélange.
On répartit dans des tube stériles les sucres utilisée à raison de 100µl /ml de milieu
(MRS BCP) dont on ajoute 100µl de chaque souche.
La lecture se fait après 24 à 48 h jusqu’à 72h d’incubation à 30°C.
Le virage de la couleur du milieu du violet au jaune explique un résultat positif.
Les sucres utilisés sont : Lactose, Galactose, Fructose, Arabinose, Raffinose, Mannose,
Mannitol, Maltose, Xylose , Cellobiose , Sucrose , Ribose , Cellulose, Melibiose.
4. Test biotechnologique
4.1. Mesure de la production de l’acide lactique :
La production de l’acide lactique par les bactéries lactiques indique leurs croissances et
provoque la coagulation du lait d’autre part et la diminution du pH. Le suivi du pouvoir
acidifiant et de la réduction du lait par nos souches a été réalisé par l’enregistrement en
continue du pH et de l’acidité Dornic dans un intervalle de temps régulier tous les deux
heures.
On a réalisé des cultures dans 3 ml d’une préculture ensemencer dans 10ml de lait écrémé
a été transvasés dans un flacon de 100ml de lait écrémé.
Le contenue du flacon a été répartie dans des tubes stériles à raison de 10ml par tubes.
Le tout est incubé à 30°C pour la mesure du pH et de l’acidité Dornic selon les temps
suivant : 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 16 h, 18 h et 24 h.
A chaque mesure on transfère le contenu du tube dans un bécher auquel on ajoute 5 goutte
de phénolphtaléine (composition 2g dans 100 ml éthanol 90%) puis on procède au mesure de
l’acidité par le titrage de la culture sous agitation avec de la soude (1/9 N) jusqu’au pH7 qu’on
décèle par un virage à la couleur rose pale qui doit persister 10s au moins, à cet instant, on
note le volume de la soude versée, nécessaire à l’équilibre de l’acidité produite.
La quantité de l’acide lactique produite est calculée selon la relation suivante :
1°D =0,1g/l d’acide lactique.
Acidité = VNaOH X 10
VNaOH : Volume de la soude coulé.
4.2. Etude du pouvoir inhibiteur :
Pour tester la capacité de nos souches de produire une substance antimicrobienne nous
avons adopté la méthode de Fleming et al 1975 et c’est la méthode la plus intéressante selon
la littérature et aboutis à des résultats qualitatifs et quantitatifs. La mise en évidence de la
production de substances antimicrobiennes par nos souches à été réalisée en deux grandes
étapes :
-Dans la première étape, on a détecté les inhibitions qui existent entre différents couples de
des isolats de Leuconostoc et des bactéries indicatrice (Staphylococcus aureus et Bacillus
cereus).
-Dans la seconde étape, on à déterminé la nature de l’agent inhibiteur.
4.2.1. Recherche d’inhibition :
Des souches en phase exponentielle de croissance considérées comme inhibitrices sont
ensemencées en touche par un multipoint à la surface du milieu MRS gélosé, après séchage
des dépôts on incube 24 h à30°C.
On note la croissance des souches et en ensemence en masse avec 7ml de la gélose molle à
0,7% d’agar contenant 500 µl d’une culture jeune de la souche considérée comme indicatrice
(sensible).On laisse solidifier le milieu puis en incube à 30°C /24h. La lecture des résultats
consiste à déterminé la présence des halos claire au niveau de chaque souche ensemencé en
touche et la mesure de leur diamètre (Tagg et Mc Given, 1971).
4.2.2. La détection de la nature de l’agent inhibiteur :
L’inhibition produite par les souches inhibitrices peut être dues à une lysogénie
spontanée, production d’acide organique, ou à la synthèse d’une bactériocine (Achemchem et
al., 2004),ces derniers sont des substance de nature protéique étant
connus pour leur
thermostabilité (Labioui et al., 2005), dans le but de caractériser l’agent responsable des
inhibitions observé on à réalisé les tests suivants :
Recherche de phage :
On découpe avec une pipette pasteur un fragment de gélose dans la zone d’inhibition que
l’on ajoute à 1ml de milieu stérile contenant 50µl de chloroforme
(Le chloroforme à pour but de tuer les bactéries prélevé avec la gélose).
Après agitation on laisse décanter puis on ajoute à 7ml de gélose molle contenant la souche
indicatrice une quantité de 300µl de milieu .Le tout est coulé stérilement dans une boite de
pétri contenant de la gélose (double couche).
Après incubation à 30°C /24h, on note la présence ou l’absence des plages de lyse qui
indique la présence de phage.
Production d’acide organique :
L’influence du pH de milieu sur le développement des souches indicatrice à été détecté sur
milieu MRS tamponné à pH 7 avec un tampon phosphate (100 mM) préparé selon Sambrook
et al., (1986). Le protocole expérimental suivi est celui de la technique de la double couche,
on compare les résultats au témoin nom tamponné.
Recherche de bactériocine.
Pour s’assurer de la nature protéique des substances inhibitrices nous avons utilisé des
enzymes protéolytiques, la trypsine et l’ -chymotrypsine. Le protocole expérimental suivis est
celui de la diffusion en puits :
La solution enzymatique est d’abord préparer dans des tampons phosphate de sodium (100
mM; pH 7) puis filtré à l’aide des filtre millipores (0,45 µm)
A partir des précultures de 18h dans du bouillon MRS on réalise des centrifugations (8000
t/min pendant 15 min,). On récupère un volume de 500µl de surnageant auquel on additionne
250µl de chaque enzyme, on incube pendant 2h à 37°C et on expose le reste du surnageant à
un chauffage de 100°C pendant 15 et 30min.
On réalise des ensemencements en masse à partir des cultures jeunes de la souche indicatrice
Staphylococcus aureus dans milieu MH agar à raison de 500µl /10ml de milieu, dés la
solidification on creuse 4 puits à l’aide d’une pipete pasteur et on réalise des dépôts comme
suit sur deux boite pétri à la fois:
1-Le culot bactérien
2-Surnageant bactérien non traité
3-Surnageant bactérien +trypsine
4-Surnageant bactérien + -chymotrypsine
On réalise ainsi les dépôts suivants pour confirmer la nature de la substance inhibitrice :
3-Surnageant bactérien +trypsine
4-Surnageant bactérien + -chymotrypsine
5-Surnageant bactérien à pH 7
6-Surnageant bactérien chauffé (100°C/30min)
Le tout est incubé à 37°C pendant 24 à 48 h après une première incubation à une température
ambiante.
4.2.3. Cinétique de croissance et d’acidification en culture pure et mixte:
Même protocolole qui a été utilisé précédemment dans la cinétique d’acidification a été
utilisé pour mesurer le pH et l’acidité Dornic.
La mesure de la population bactérienne a été réalisée en utilisant la méthode de
dénombrement en profondeur sur milieu solide. La souche inhibitrice la plus performante
SH20 ainsi que la souche test ont été repiquées de façon routinière dans 10ml de lait écrémé
stérile contenant l’extrait de levure et après 18h d’incubation on réalise une séries de dilution
décimale dans 9ml d’eau physiologique, en ensemence les dilutions adéquates sur milieu
YMA « Leuconostoc » et milieu Shapman « Staphylococcus aureus », puis on incube à 30°C
pendant 24h-96h (Carr et al., 2002).
Deux à trois boite sont prise par dilution, on dénombre seulement les boite contenant 25à 250
colonies (Kihal., 1996, Badis et al .,2005)
1. Isolement et purification :
L’utilisation des milieux sélectifs pour la recherche des leuconostocs a été effectuée sur
deux milieux différents
(MSE et MRSv) qui nous ont permis d'isoler les espèces de
Leuconostoc. La vancomycine est utilisée comme agent sélectif des leuconostocs à une
concentration de 30µg/l qui inhibe les autres espèces de bactéries lactiques. L’isolement à été
réalisée en profondeur après incubation à 30 °C pendant 48h. Nous avons obtenu des colonies
lenticulaires de petite taille sur MRSv et la production des dextrane a été aussi observée par la
formation de colonies muqueuses sur MSE. Cette production de dextrane sur milieu MSE
nous oriente dans l'identification de certaines espèces de Leuconostoc (Mathot et al.,1994). 30
isolats ont répondus à ces critères.
2. Caractéristiques phénotypiques
- Les caractères macroscopiques des cultures pures se présentent sous forme de petites
colonies d’environ 1mm de diamètre, rondes transparente avec un aspect laiteux, avec un
contour régulier et de petite dimension sur milieu MRSv solide(Fig. 4.). En milieu liquide
MRS la croissance est observée par un trouble au fond du tube loin de l'oxygène, la partie
supérieure est transparente qui montre l'absence de croissance. Un dépôt est aussi observé au
fond du tube et son volume opaque avec l'âge de la culture (Fig. 5).Par agitation on constate
le dégagement du CO2 .
- Les caractères microscopiques : après coloration de Gram et observation microscopique, la
pureté des isolats a été constatée et nous a orientés sur l'aspect cellulaire des souches. Ils sont
tous gram positif de forme cellulaire ronde, légèrement ovale, sous forme de coccobacilles en
paire (diplocoque) et souvent en chaînettes (Fig. 6). Ils sont non sporulés et possèdent une
capsule.
- Catalase : Ce test montre que tous les isolats sont catalase négative.
Ces caractères phénotypiques nous oriente sur l’appartenance probable des isolats indiquent
clairement que les isolats appartiennent aux groupes de bactéries lactiques. La résistance à la
vancomycine et le caractère hétérofermentaire par la production de gaz à partir de glucose
permet une pré-identification de l'appartenance des isolats au genre Leuconostoc.
Figure4 : Aspect des cultures pures des leuconostocs en milieu MRS solide.
Figure 5 : Aspect des cultures pures des leuconostocs en bouillon MRS
(De gauche à droite : Témoin-SH2-SH18)
14µm
Figure 6 : Observation microscopique des cellules de Leuconostoc Gx1250 .
3. Caractéristiques biochimiques et physiologiques :
3.1. Type fermentaire :
La production du CO2 lors de la fermentation des sucres nous indique que 9 isolats
choisis ont révélé un métabolisme hétérofermentaire (Fig 7) ce qui caractérise le genre de
Leuconostoc mais cette probabilité à été confirmé par le test de l’ADH qui est négatif chez les
leuconostocs ce qui les différenciées des lactobacilles hétérofermentaires (Mathot et al. 1994,
Badis et al 2005).
Figure 7. Le caractère hétérofermentaire des leuconostocs par l'apparition du gaz de CO2 dans
la cloche de Durham dans le milieu MRS glucose.
3.2. Hydrolyse de l’arginine :
Les cellules des isolats sont toutes des coccis légèrement ovale, mésophiles,
hétérofermentaires et ont montré une incapacité d’hydrolyser l’arginine (Fig 8). Les isolats
résistent à la vancomycine ce qui conduit à les classer dans le genre de Leuconostoc (Carr et
al.,2002 ; Khedid et al.,2006).
3.3. Production de dextrane :
Les souches productrices de dextrane sont caractérisées par la formation des colonies
larges et gluantes sur milieu MSE (Fig9). La production du dextrane a été observée chez les
souches SH1, SH4, SH8, SH13 et également SH20. Ce caractère important nous a permis de
différencier les espèces de Leuconostoc et de supposer leurs appartenance à une des trois
espèces de Leuconostoc productrices de dextrane (Ln. mesenteroides subsp. dextranicum, Ln.
mesenteroides subsp. mesenteroides ou Ln. gelidium).
Et vue que les isolats sont obtenus à partir du lait cru et du fromage Roquefort l'espèce de
Leuconostoc gelidium est écartée car son écosystème est les produits carnés (Carr et al.,
2002).
3.4. Utilisation du citrate:
Le milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980) a été utilisé pour la mettre en évidence
l'utilisation du citrate, les colonies capables de fermenter le citrate donnent des colonies de
couleur bleu (Fig 10). Le tableau 3 montre que certaines souches utilisent le citrate et d'autres
sont incapables. Cette perte de la capacité d'utiliser le citrate, peut etre due à une perte de
plasmide codant pour la citrate perméase (Kihal et al.,1996). L'utilisation du citrate est un
facteur indisponsable de la production des composés aromatiques chez les espèces
aromatisante de Leuconostoc dans les produits laitiers (Ignacio Sanchez et al.,2005). Ce
caractère peut être variable même chez les souche appartiennent à la même espèce (Khedid et
al.,2006).
Figure8 : L’aspect des colonies de Leuconostoc sur milieu M16BCP
Les fleches indiquent le caractére arginine négatif
Figure 9 :Morphologie des colonies productrices de dextrane
des souches de Leuconostoc sur milieu MSE
Figure 10 : Recherche de la citratase sur milieu KMK
3.5. Effet du pH de NaCl et de la temperature d’incubation :
Ces examens physiologiques nous indiquent que sur l’ensemble des souches
sélectionnées, une seule souche (SH16) a montré une croissance lente sur MRS à 6,5% de
NaCl et l’absence de croissance chez tous les autres isolats dans MRS à pH 9,6 et à
température 45°C. Ce résultat confirme que les isolats sont des mésophiles.
L'absence de la croissance à pH 9.6 eloigne nos isolats du genre Enterococcus et nous à
conduit à supposé
que la souche SH16 peut être une espèce de Leuconostoc
pseudomesenteroides (Tableau 3).
Tableau 3 : Illustre les résultats des caractères phénotypiques des neufs isolats.
SH1
SH3
SH4
SH8
SH13
SH15
SH16
SH18
SH20
Forme cellulaire
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Gram
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ch,Di
Ch
Di
Di
Di
Di,Ch
Ch
DiCh
Di
Dextrane
+
-
+
+
+
-
-
-
+
ADH
-
-
-
-
-
-
-
-
-
CO2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Catalase
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Citrate
+
±
-
-
-
+
-
+
-
T°C 15
+
-
+
+
+
+
+
+
+
T°C 37
+
+
+
+
+
-
±
-
+
T°C 45
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NaCl 6,5%
-
-
-
-
-
-
+
-
-
pH 9,6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
100°C
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Regroupement
(+) : Réaction positive, (-) : Réaction négative, (Ch) : Chainette, (Di) : Diplocoque
3.6. Le profil fermentaire des sucres :
Pour mieux identifier les isolats au niveau de l’espèce ou de la sous espèce on a établit
leur profil fermentaire de quatorze sucres. Le virage de pourpre de bromocrésol utilisé comme
un indicateur du pH au jaune révèle l’aptitude des souches à utiliser les différents sucres qui
ont été disponible. L’utilisation de ce caractère permet de conclure la pré-identification et de
mieux identifier les isolats au niveau de l’espèce.
Tableau 4 : Indique le profil fermentaire des vis-à-vis les quatorze sucres utilisés .
Lactose
Galactose
Fructose
Arabinose
Raffinose
Mannose
Mannitol
Maltose
Xylose
Cellobiose
Sucrose
Ribose
Cellulose
Melibiose
SH1
SH3
SH4
SH8
SH13
SH15
SH16
SH18
+
+
+
+
+
±
+
+
+
±
±
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
±
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
±
+
+
+
+
+
-
+
±
±
+
+
+
+
-
±
+
+
+
+
+
±
+
+
-
+
+
-
+
±
+
+
+
+
+
SH20
+
+
+
±
±
+
+
±
-Le profil fermentaire des sucre nous a permis de confirmé la pré-identification de nos isolats
en se basant sur des donnés bibliographique établis par Carr et al.,(2002) et Khedid et
al.,(2006). La fermentation de l’arabinose et à l’aide du résultat obtenus par le test de la
production du dextrane nous ont permis de différencier les sous espèces de Leuconostoc
mesenteroides, de classer les souches SH1 et SH20 comme Ln mesenteroides subsp
mesenteroides et de confirmer l’appartenance des souches SH4, SH8 et SH13 aux Ln
mesenteroides subsp dextranicum.
T
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
Figure 11: Le profil fermentaire des sucres de la souche de Leuconostoc SH15
T -Témoin ,1- Lactose, 2- Galactose, 3-Fructose, 4-Arabinose , 5- Raffinose , 6-Mannose,
7-Mannitol, 8-Maltose, 9-Xylose, 10- Cellobiose, 11- Sucrose, 12- Ribose , 13-Cellulose,
14- Melibiose.
Au cours de notre étude nous avons pu collecter sur la base des critères phénotypique
rapporté par plusieurs auteur (Carr et al ., 2002 ; Badis et al.,2005 ; Hammes et Hertel, 2006
Khedid et al.,2006) neuf souches de leuconostocs dont trois souches ont été isolées du lait
crus de chèvre et neufs souches de l’échantillon du fromage R3 auxquelles nous avons
attribué les codes suivants :
Tableau 5: Illustre l’appartenance des souches isolées aux espèces les plus proches
% de
fiabilité
Code
Origine
Ln mesenteroides subsp. mesenteroides
91,66%
SH1
L-ch « Tiaret »
Ln lactis
83,33%
SH3
R3
Ln mesenteroides subsp dextranicum
83%
SH4
L-ch « Oran »
Ln mesenteroides subsp. dextranicum
75%
SH8
R3
Ln mesenteroides subsp. dextranicum
83,33%
SH13
R3
Ln mesenteroides subsp. cremoris
91,66%
SH15
R3
75%
SH16
R3
Ln mesenteroides subsp. cremoris
83,33%
SH18
R3
Ln mesenteroides subsp. mesenteroides
91,66%
SH20
L-ch « Tiaret »
Souche
Ln paramesenteroides
4. Caractérisations biotechnologiques :
4.1. La cinétique d’acidification :
La production de l’acide lactique à été suivie en fonction du temps en utilisant les
cultures pures de souches sélectionnées. Cette activité acidifiante est souvent utilisée dans le
choix des souches pour l’industrie laitière.
Le suivi de la quantité d’acide produite et l’évolution du pH
dans des conditions
mésophiles nous à permis de bien conclure que le temps d’incubation à influencer
positivement sur le rendement de nos souches. Nos résultats sont présentés sous forme de
diagrammes (Fig12, Fig13, Fig14) et les valeurs du pH ainsi que la quantité d’acide lactique
produite sont présenté dans les tableaux 6 et 7. De ces résultats en remarque que la quantité
d’acide produite change selon le stade de vie de la bactérie, cette différence de production est
peu être expliqué par une déficience dans le système du transport des substances
fermentescibles du milieu vers le cytoplasme cellulaire (Albenzino et al.,2001).
-Nous remarquant aussi que la production d’acide lactique chez nos souches était moins
importante on explique ceci par leur métabolisme hétérofermentaires et donc produisent
d’autre composé organique tel que l’acide acétique, le glyceraldehyde, l’éthanol et le CO2 en
plus de l’acide lactique (Kihal et al ., 2006).
-La variabilité dans la production d’acide lactique chez les différentes espèces de notre
collection était moins importante puisque il s’agit des souches qui appartiennent au même
genre mais ça nous à pas empêché de les répartir selon leur pouvoir acidifiant en trois groupe
distinct :
- Souche faiblement acidifiantes : SH4, SH8 et SH13. (Fig12)
- Souche moyennement acidifiantes : SH16, SH18 et SH3. (Fig13)
-Souche fortement acidifiantes : SH20, SH15 et SH1. (Fig14)
Tableau 6 : Illustre la cinétique d’acidité (°D) chez les neuves souches en fonction du
temps (h)
0h
2h
4h
6h
8h
10h
12h
14h
16h
18h
24h
48h
SH20
0
1
4
8
12
16
21
23
27
32
40
44
SH15
0
0
4
9
13
17
22
26
29
33
38
42
SH1
0
2
6
9
13
17
21
25
29
34
39
43
SH4
0
0
1
2
5
8
11
13
15
18
27
29
SH8
0
0
0
1
3
11
14
18
23
27
30
31
SH13
0
0
0
2
3
7
12
16
21
26
29
30
SH16
0
0
0
3
5
8
19
22
28
30
34
35
SH18
0
0
0
1
4
11
15
18
24
30
33
36
SH3
0
1
3
8
13
16
20
24
27
31
35
39
Tableau 7 : Illustre la variation du pH chez les neuves souches en fonction du temps(h).
0h
2h
SH20 6,55 6,41
4h
6,3
6h
8h
10h
12h
14h
16h
18h
24h
48h
6,22 6,15 6,03 5,75 5,63 5,55 5,37 5,22 4,98
SH15 6,55 6,54 6,33 6,21 6,05 5,86 5,75 5,68 5,43 5,31 5,19 5,04
SH1
6,54 6,34 6,18 6,01 5,91 5,61 5,39 5,28 5,21 5,05 4,98 4,97
SH4
6,57 6,55 6,54 6,46 6,33 6,28 6,12 5,97 5,88 5,71 5,54
5,3
SH8
6,61
5,2
6,6
6,59 6,56 6,41 6,25 6,11 5,96 5,72
5,6
5,41
SH13 6,57 6,42 6,41 6,39 6,29 6,22 5,84 5,65 5,51
5,4
5,31 5,28
SH16 6,54 6,53
6,5
6,38 6,21
6,3
SH18 6,52 6,45
6,4
6,35
6,15 6,08 5,85 5,63 5,46 5,31 5,09
SH3
6,35 6,14 6,04 5,81 5,51 5,32 5,24
6,55
6,4
6,3
6,15 5,84 5,62 5,47 5,22 5,11
5,2
5,11 5,04
Figure 12 : Représente la cinétique d’évolution du pH (En haut) et de l’acidité Dornic
(En bas) chez les souches pures (SH4, SH8 et SH13) en milieu lait
Figure13 : Représente la cinétique d’évolution du pH (En haut) et de l’acidité Dornic
(En bas) chez les souches pures (SH16, SH18 et SH3) en milieu lait
Figure14 : Représente la cinétique d’évolution du pH et de l’acidité Dornic chez les souches
pures (SH20, SH15 et SH1) en milieu lait
On peut expliquer la variation dans la cinétique d’acidification par plusieurs facteurs, le
facteur le plus important est l’aptitude des souches a possédé une activité protéolytique qui est
codé par un matériel extra-chromosomique (Juillard et al., 1998).
Nos observation on porté également sur le temps de coagulation, toutes nos souches ont
coagulé le lait après 24h d’incubation.
Le suivi du pH montre une diminution progressive pour toutes les souches isolées. La
souche s’avère la plus performante c’est la SH20 avec un pH de 4,98 et une quantité de 4,4
mg d’acide lactique par 10ml de milieu de culture après 48h d’incubation.
La stabilité de la production de l’acide lactique par quelque souche de Leuconostoc à
partir de la 48 ème heure explique la diminution de leurs populations après 48 heures et donc
le déclanchement de la phase de latence. Cette disparition résulte du pH d’acidification du
milieu incompatible avec le pH optimum de croissance des Leuconostoc situé entre 5,0-6,3
(Carr et al.,2002). La sensibilité des leuconostocs serait liée à leur incapacité à maintenir un
gradient de pH entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule bactérienne en présence de fortes
concentrations d’acétate et de lactate (Carr et al.,2002).
Figure15 : Coagulation du lait par les leuconostocs après 24h d’incubation à 30°C, la
formation des ouvertures dans le coagulum.
4.2. Effet inhibiteur des Leuconostoc sur les germes pathogènes:
4.2.1. Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur :
Après l’étude du pouvoir acidifiant des isolats, nous nous somme intéressés à d’autre
propriété technologique de nos souches, qui a consisté à tester leurs action sur la croissance
de deux bactéries pathogène « Staphylococcus aureus ATCC 25923 et
Bacillus cereus
ATCC 11778 » avec trois répétitions.
Au cour de la chaine de fabrication et de la conservation, les produits fermenténe sont
jamais à l’abri des contaminations par les
bactéries
indésirables pathogène et
de
détérioration (Castano et al.,2005), Clostridium Sp., Bacillus cereus, Listeria monocytogenes
et Staphylococcus aureus sont parmi les germe pathogènes majeurs impliqué dans les toxiinfections alimentaires (Benhamouche., 2005; Guessas., 2007). Comme d’autres bactéries
lactiques les leuconostocs produisent une variété de composés antimicrobiens, tels que les
acides organiques, peroxyde d'hydrogène, les phages lysogènes, le diacétyle et les
bactériocines (Castano et al.,2005) .
Les tests d’interactions entre les bactéries pathogènes confronté avec les neufs souches de
Leuconostoc isolées dans la première parties de notre travail nous ont permis de conclure que
le diamètre d’inhibition varis selon les espèces.
Les résultats obtenue par la mesure des zones d’inhibition après plusieurs essaie ont
montré que le diamètre des zone d’inhibition varie de 0 à 7 mm. Il était plus grand vis-à-vis
le Staphylococcus aureus ATCC 25923, par contre aucune inhibition n’a été détecté sur
Bacillus cereus ATCC 11778.
Les tableaux 8 et 9 illustre les diamètres des zones d’inhibition de la croissance des
bactéries pathogène par les neuf isolats de Leuconostoc correspondant à la moyenne de trois
répétitions.
Pour rechercher si la cause des inhibitions est due à une substance de nature protéique ou
au moins dont la parties portante cette activité est protéique on a éliminé deux cause
d’inhibitions : L’acidification du milieu et la lysogénie.
-L’acidification du milieu :
Les leuconostocs produisent des acides organiques ; notamment de l’acide lactique
et
acétique (Kihal et al.,2006) qui se libèrent dans le milieu de culture ce qui conduit a
l’acidification et qui peuvent être une cause principale d’inhibition des souches pathogène.
L’utilisation d’un tampon phosphate nous a permis de stabilisé le pH et donc d’exclure l’effet
de l’acidité qui présente un pouvoir antimicrobien. Des travaux similaire ont été réalisés par
Labioui et al, (2005) lorsqu’ils ont neutralisé le surnageant pour éliminer le facteur acidifiant
lors des études faites sur la sélection de bactéries lactiques antimicrobiennes.
Les souches inhibitrices observées en milieu non tamponné étaient plus importantes que
celles observé en milieu tamponné.Le tableau 9 montrent clairement la réduction du diamètre
des zone d’inhibition en milieu tamponné chez quelque souches et la disparition des zones
dans d’autres souches, ainsi trois souches seulement (SH1, SH8 et SH20) ont produit des
inhibitions considérables
sur milieu tamponné. Tandis que, la zone d’inhibition de la
croissance du germe cible « Staphylococcus aureus » a été presque nulle chez les souches
(SH13, SH15, SH16 et SH4), en revanche, aucune zone d’inhibition n’a été décelée par les
souches de : Ln lactis (SH3) et Ln. mesenteroides
subsp. cremoris (SH18) en milieu
tamponné. Ceci suggère que l’activité antimicrobienne chez l’ensemble de ces souches était
probablement due à l’acidité, ainsi selon Ammor et al, (2005) une bonne acidification lactique
provoque l’inhibition des germes pathogènes et plus particulièrement les espèces de
Staphylococcus aureus.
-Les attaques des phages lysogènes :
Le test des phages s’est révéler négative pour l’ensemble des souches, par conséquent
aucune des inhibitions observé dans notre travail n’étaient due à une lysogénie.
-La sensibilité du filtrat antagoniste à l’action des enzymes et sa résistance à la température:
Les bactériocines sont des substances qui existent dans la partie extracellulaires de la
bactéries (Hugas et al.,2003).L’absence de la zone d’inhibition dans le puits 1 contenant le
culot bactérien qui correspond à la fraction cellulaire
et sa présence dans les puits
contenants le surnageant bactérien représentant la fraction extracellulaire indique que le culot
bactérien ne présente aucun effet sur la croissance de la souche test et donc confirme que la
substance inhibitrice est localisée dans le milieu de culture de la bactérie productrice,
explique que l’activité antimicrobienne est due à une substance extracellulaire qui se libère
dans le surnageant . Ces résultats sont comparables a ceux trouvé par Labioui et al.,(2005)
lors de leurs études sur la sélection des souches lactiques productrices de substances
antibactériennes et qui ont constaté que l’activité bactéricide de la souche lactique BLh5 du
genre Streptococcus se trouve uniquement dans le milieu de culture ; suggère la formation de
substance extracellulaire.
Les bactériocine des Leuconostoc font partie de la classe II étant connues pour être des
peptides non lantibiotiques résistant à des températures élevées (Lachance 2000, Labioui et
al.,2005), les figures 17 et 18 et le tableau 10 illustrent les résultats obtenues après traitement
du filtrat antagoniste issu des souches inhibitrices par des enzymes protéolytiques
( -
chymotrypsine et la trypsine) et par la chaleur et confirme la localisation de la substance
inhibitrice :
-La figure 17 montre la disparition totale de la zone d’inhibition de la croissance de la souche
test Staphylococcus aureus en présence de la trypsine ceci indique que l’agent inhibiteur
contenant dans le filtrat issu de la souche inhibitrice SH20 est sensible à la protéase utilisée.
Le traitement thermique à 100°C a démontré que la substance inhibitrice à un caractère
thermostable, le surnageant reste active et l’activité antimicrobienne persiste et le diamètre de
la zone d’inhibition avoisine le témoin ; Ces résultats se concordent avec ceux qui ont été
observés par Benhammouche., (2005), Labioui et al.,(2005) et
Guessas.,(2007) qui ont
travaillé sur différent genre de bactéries lactiques y compris Leuconostoc et sont aussi arrivés
à confirmer que l’activité antibactérienne chez les genres appartenant au groupe de bactéries
lactique est peut être due à une substance extracellulaire de nature protéique et thermolabile.
-Le tableau 10 récapitule les résultats qui ont été trouvé dans la recherche de la nature de la
substance inhibitrice chez tous les isolats. La figure18 montre aussi la persistance de la zone
d’inhibition de la croissance du Staphylococcus aureus par la souche Ln mesenteroides
subsp cremoris SH18 dans le puits 3 contenant l’enzyme protéolytique et sa disparition dans
le puits 5 indique que la SH18 a été résistantes à la trypsine donc elle est loin d’être de nature
protéique. Ce résultat ainsi que le résultat obtenue dans la recherche de l’acidité en milieu
tamponnée présument et confirment que l’inhibition visualisé par cette souche été due à
l’acidité.
Les résultats obtenus après le traitement thermique du surnageant contenant la substance
inhibitrice et les tests des enzymes protéolytiques ainsi que les tests supplémentaires à savoir ;
l’élimination de l’acidité et l’attaque des phages,
nous ont permis de sélectionner
probablement les souches productrices de bactériocines qui est une substance de nature
protéique et
thermostable (Hugas et al.,2003), on a pu remarquer que parmi les cas
d’inhibition mentionnées dans le tableau9, deux souches seulement SH1 et SH20 permettent
de suggérer que l’activité antagoniste vis à vis Staphylococcus aureus soit due à une
substance de nature protéique. L’inhibition qui a été rencontré chez la souche de Ln
mesenteroides subsp dextranicum (SH8) est loin d’être due a la production de bactériocine ou
à l’acidité d’après la persistance des inhibitions en éliminant ces deux facteurs.
On remarque que seules les souches qui ont étaient considérées comme performantes pour
leur pouvoir acidifiant SH20 etSH1 dans l’étude de la cinétique d’acidification, ont donné les
plus grandes zones d’inhibition et donc ont été considérées comme souches performantes
pour leur pouvoir inhibiteur. Labioui et al.,(2005) ont constaté la même observation lors de
leurs études sur le pouvoir bactéricide de bactéries qui appartiennent au différent genre
lactique « Streptococcus , Enterococcus et Lactobacillus » visé contre la même bactéries
pathogène Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Les résultats concordent des travaux antérieurs réalisés par Hamama et al (2002), Ananou
et al., (2005), Guessas., (2007), González et al., (2007) montrant que les bactéries lactiques
y compris Leuconostoc possèdent une activité antimicrobienne dirigée essentiellement contre
des espèces taxonomiquement proche de ces bactéries productrices de bactériocine .
Tableau 8: Résultats des interactions entre souches productrices « Leuconostoc » et les
souches tests
« Staphylococcus
aureus
et Bacillus cereus » (la zone d’inhibition est
mesurée en mm), les résultats présentent correspondant a la moyenne des trois essais.
Souche lactique
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
SH1
4
0
SH4
2
0
SH3
2
0
SH8
5
0
SH13
2
0
SH15
4
0
SH16
2
0
SH18
SH20
3
7
0
0
Tableau 9: Résultats des interactions entre
souches productrice « leuconostoc » et les
souches tests « Staphylococcus aureus » sur milieu tamponné et non tamponné (la zone
d’inhibition est mesurer en mm), les résultats présentent correspondant a la moyenne des trois
essais.
Souche lactique
SH1
SH4
SH3
SH8
SH13
SH15
SH16
SH18
SH20
Milieu non tomponné
4
2
2
5
2
3
2
1
7
Milieu tomponné
3
1
0
3
1
1
1
0
6
-A
SH13
-B
SH8
SH4
SH18
SH1
SH15
SH3
SH20
SH16
-C
Figure16 : .L’activité antimicrobienne des isolats de Leuconostoc diriger contre
Staphyloccocus aureus ATCC 25923 et Bacillus cereus ATCC 11778
(A) : Contre St.aureus sur milieu tamponné.
(B) : Contre Bacillus cereus sur milieu tamponné.
(C) : Contre St.aureus sur milieu non tamponné.
4
6
5
3
1
2
3
4
Figure17 : l’action des enzymes protéolytique sur l’activité antimicrobienne de la souche
SH20 et sa résistance à la température
5
2
3
4
Figure18 : l’action des enzymes protéolytique sur l’activité antimicrobienne de la souche
SH18
1- Le culot bactérien
2-Surnageant bactérien non traité
3- Surnageant bactérien +trypsine
4- Surnageant bactérien + -chymotrypsine
5-Surnageant bactérien pH7
6-Surnageant bactérien chauffé (100°C/30min)
Tableau 10: Résultats de la nature de l’agent inhibiteur des interactions entre souches
productrice « Leuconostoc » et la souche test « Staphylococcus aureus »
1
2
3
4
5
6
SH1
-
+
-
+
+
+
SH3
-
+
+
+
-
SH4
-
+
+
+
-
SH8
-
+
+
+
+
SH13
-
+
+
+
-
SH15
-
+
+
+
-
SH16
-
+
+
+
-
SH18
-
+
+
+
-
SH20
-
+
-
+
+
1- Le culot bactérien
2-Surnageant bactérien non traité
3- Surnageant bactérien +trypsine
4- Surnageant bactérien + -chymotrypsine
5-Surnageant bactérien pH7
6-Surnageant bactérien chauffé (100°C/30min)
(-)- Absence d’inhibition
(+)- Présence d’inhibition
-
+
4.2.2. Etude de l’évolution du pH, l’acide lactique et la cinétique de croissance en culture
pure et mixte de la souche test Staphyloccocus aureus et la souche productrice SH20 :
4.2.2.1. L’évolution du pH et de l’acide lactique :
En se basant sur les résultats obtenus dans l’étude de l’interaction entre la souche
inhibitrice et la souche test on a remarqué que la souche SH20 « Ln mesenteroides subsp.
mesenteroides » a donné la meilleur zone d’inhibition « 7mm de diamètre » avec la souche
test « Staphyloccocus aureus » et donc a été considéré comme la souche la plus performante
de notre collection.
L’étude de l’évolution du pH de la souche inhibitrice la plus performante « SH20 »et la
souche test « Staphyloccocus aureus » en culture mixte et en culture pure a montré une
différence significative entre ces deux milieux ; en culture pure le pH a pu atteindre 5,25
pour la souche lactique Ln mesenteroides subsp. mesenteroides et 5,40 pour la souche
pathogène Staphylococcus aureus (Tableau 12). En revanche pour la culture mixte le pH était
égale à 6,06 après 24h d’incubation ce qui explique la présence d’un antagonisme entre
souche productrice et souche test, même résultats ont été remarqué par Benhamouche (2005)
le pH été de 4,53pour la souche lactique productrice, 5,2 pour Staphyloccocus aureus et 6 en
culture mixte après 24h d’incubation, reste à confirmé la souche inhibitrice par la production
de l’acide lactique et l’évolution de la croissance de ces deux souches en culture pure et
mixte.
Les résultats obtenus dans l’étude de l’évolution de la production de l’acide lactique
(Tableau 11), montre clairement que la quantité d’acide lactique produite se diffère entre les
deux biotopes, on a noté 3,5 g pour Staphylococcus aureus et 3,9 g pour la souche productrice
Ln mesenteroides subsp. mesenteroides après 24h d’incubation en culture pure, en revanche
la production d’acide lactique été moins importante en culture mixte (20g),on explique cette
défaillance par l’existence d’un antagonisme entre les deux souches, Hamama et al.,(2002)
ont conclu la même remarque pendant les travaux réalisé sur l’étude de l’inhibition de
Staphyloccocus aureus par la nisine produite par des souches de Lactococcus lactis durant
la fabrication du jben (fromage traditionnel)
4.2.2.2. Dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et en culture mixte :
L’étude de la croissance de la souche pathogène Staphyloccocus aureus à été réalisé en
culture pure et en culture mixte (Tableau 13). Le nombre des colonies est exprimé en ufc /ml.
On note qu’il n’ya pas une différence importante pour la souche productrice SH20 que se soit
en culture pure ou mixte, le nombre d’unité logarithmique était presque identique 9,98 log
ufc /g et 10,12 log ufc /g respectivement, le résultat était différent pour la souche test une
diminution du nombre logarithmique a été bien remarqué de
9,11 log ufc /g en culture
pure à 7,55 log ufc /g en culture mixte après 24h d’incubation. Ces résultats peuvent être
comparés aux études similaires réalisées par Rodrigues et al. (2005) sur la croissance et
l’inhibition de Staphyloccocus aureus en culture mixte avec d’autre genre de bactéries
lactique « Lactoccocus lactis » en fromagerie
qui ont montré que le nombre de
Staphyloccocus aureus a été de 0,40 log ufc /g après 24h d’incubation comparé au témoin qui
été de 5,16 log ufc /g.
Mise à part les Leuconostoc et les Lactococcus, il existe d’autres
bactéries appartiennent aussi au groupe lactiques qui sont capable d’inhibé le Staphyloccocus
aureus et d’autres germe pathogènes qui ont fait l’objet des axes de recherche, Héquet et
al.,(2007)
ont caractérisé de nouvelles
bactériocines de bactéries lactique qui stimule
l’inhibition de Listeria monocytogenes ; Leuconostoc pseudomesenteroides 2733 a produit
une nouvel bactériocine qui a été purifié et partiellement caractérisé, la croissance de Listeria
monocytogenes a été ainsi inhibé par Lactobacillus sakei 2521.
Tableau 11: L’acidité Dornic (°D) en culture pure et mixte en fonction du temps (h) de la
souche inhibitrice SH20 et le Staphyloccocus aureus
Temps
SH20
St. aureus
Culture mixte
0h
0
0
0
3h
3
2
3
6h
7
6
8
9h
13
13
12
12h
17
15
14
15h
20
23
16
18h
30
29
18
24h
39
35
20
48h
45
40
25
72h
46
40
22
96h
46
37
20
Figure19 : Evolution de l’acidité Dornic en culture pure et mixte en fonction du temps de la
souche inhibitrice SH20 et le Staphyloccocus aureus
Tableau 12:Evolution du pH d’une culture pure et mixte de la souche inhibitrice SH20 et le
Staphyloccocus aureus en fonction du temps
Temps
SH20
St aureus
Culture mixte
0h
6,58
6,60
6,61
3h
6,42
6,55
6,58
6h
6,30
6,41
6,41
9h
6,25
6,32
6,32
12h
5,96
6,10
6,24
15h
5,75
5,80
6,15
18h
5,63
5,68
6,11
24h
5,25
5,40
6,06
48h
4,99
4,98
5,79
72h
4,98
4,95
5,71
96h
4,91
4,94
5,59
Figure20 : Evolution du pH d’une culture pure et mixte (SH20, St. aureus).
Tableau 13:Evolution de la croissance de la souche inhibitrice SH20 et le Staphyloccocus
aureus en une culture pure et mixte en fonction du temps
Temps(h)
SH20
SH20 mixte
St. aureus
St. mixte
0h
5,92
5,93
5,83
5,52
3h
6,15
6,11
5,98
5,64
6h
6,20
6,28
6,10
5,68
9h
6,45
6,47
6,85
5,90
12h
6,51
6,77
6,93
5,94
15h
7,03
7,10
7,35
6,09
18h
7,58
7,67
7,51
6,39
24h
9,98
10,12
9,11
7,55
48h
10,28
10,27
8,53
7,48
72h
10,26
9,12
8,08
6,47
96h
9,30
8,08
7,55
5,87
Figure 21 : Evolution de la croissance de la souche inhibitrice SH20 et le Staphyloccocus
aureus en une culture pure et mixte en fonction du temps
Figure 22 : Croissance de Staphyloccocus aureus en culture pure et mixte sur milieu
Shapman après 96h d’incubation à 37°C.
Conclusion
Les espèces de Leuconostoc sont des bactéries lactiques exigeantes sur le plan
nutritionnel, qui se caractérisent
par la production du CO2 et l’incapacité d’hydrolysé
l’arginine. Leur utilisation est apparue empiriquement dans la fabrication des aliments
fermentés divers comme les fromages les charcuteries, les boissons fermentées, l’ensilage, les
saumures etc. Leur aptitude de produire les exopolysaccharides
« Le dextrane » et le
diacetyle leur donne un rôle important dans la modification de la saveur et la texture des
aliments.
Les principaux objectifs de ce travail ont été réalisés avec succès, des informations de
base sur les caractéristiques ont été conclues. Toutefois, beaucoup de travail reste à réaliser
avant de comprendre et de maitriser totalement ces bactéries.
Nous avons entamé notre travail par l’isolement et la constitution d’un souchier de
Leuconostoc isolé du lait cru de chèvre et d’un produit fermenté « fromage Roquefort »
L’utilisation des milieux sélectifs MSE et MRS à 30µg/ml de vancomycine
nous à
permis d’éliminer les autre bactéries lactique qui peuvent se confondre avec les leuconostocs.
On note que neufs souches de Leuconostoc ont été isolées dont 30% du lait de chèvre et
70%du fromage Roquefort.
Par la suite les isolats ont fait l’objet des tests d’inhibition vise à vis de Staphylococcus
aureus et de Bacillus cereus. Seulement Staphylococcus aureus a été inhibé par contre
aucune inhibition n’a été détecté sur Bacillus cereus ATCC 11778.
Il apparaît alors
dans les résultats que plusieurs cas d’activité antagonistes ont été
décelés, ainsi la recherche de la nature de l’agent inhibiteur, ce composé antimicrobien qui
constituer une arme efficace contre les germes d’altération ou les pathogènes, nous a permis
de constater que l’inhibition peut être due à :
-La production d’acide lactique ce qui été le cas des souches (SH4, SH3, SH13, SH15, SH16
et SH18)
- La synthèse d’un agent inhibiteur de nature protéique (bactériocine) cas des souchesSH1 et
SH20
On a remarqué aussi que la bactériocine produite par la souche SH20 a donné des inhibitions
importantes vis-à-vis de Staphylococcus aureus.
Les résultats apportés par notre travail nous ont permis de mettre en valeur plusieurs
aspects technologiques des leuconostocs et d’observer que même au sein du même genre et de
la même espèce il existe de grande variation autant au niveau de l’aptitude acidifiante que
l’activité antimicrobienne. La détermination de ces deux fonctions est cependant un bon outil
pour la prédiction de la capacité des souches testés à donné un bon produit fermenté ayant les
qualités désirer.
Les tests utilisés pour évaluer les différentes activités sont simples et rapides pour le
développement d’un modèle prédictif et également un bon outil pour la sélection et le
développement de nouveau ferment ayant de très bonnes aptitudes fermentaire. Une meilleure
caractérisation des activités enzymatiques des souches bactériennes est donc une approche
simple qui peut être très utile à l’industrie, car la qualité des produits fermentés reflète la
bonne connaissance des activités métaboliques des levains utilisés.
Enfin, en extension à ces perspectives, notre ambition porte maintenant sur un autre
volet de recherche plus vaste ; nous suggérons l’utilisation des techniques moléculaires afin
de confirmer l’identification de nos souches, l’extraction de l’ADN plasmidique et le clonage
des gènes responsables des propriétés technologiques. Nous espérons ainsi donner suite à
l’étude de la substance inhibitrice de l’isoler, là purifiée et l’identifiée avec précision pour
permettre sont exploitation dans la bio-préservation d’aliment ou d’ensilage et dans la
biothérapie.
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