Gestion du sexe du produit en élevage bovin THESE
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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année 2011 - Thèse n° Gestion du sexe du produit en élevage bovin THESE Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 14 octobre 2011 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par CHEVALIER Marie, Eva Née le 16 mars 1986 à Domont (95) 2 3 4 Au Professeur Jean –François Guérin, Pour avoir accepté la présidence de ce jury de thèse, remerciements respectueux. Au Professeur Pierre Guérin Pour m’avoir suivie pendant la réalisation de cette thèse. Sincères remerciements. Au Docteur Marie-Anne Arcangioli, Pour avoir accepté de faire partie de ce jury de thèse. Sincères remerciements. 5 A Paniout et Maniout. Pour les Chocapics et les Princes qui m’attendent toujours dans le placard quand je rentre trop rarement à la maison. Pour les voyages que vous nous avez offerts. Pour les discussions de fin repas. Merci pour votre soutien et votre présence sans faille tout au long de ces années d’études. Avec tout mon amour. A Benjigaï. Parce que toute famille devrait avoir son baroudeur philosophe. Je ne sais pas si vous le saviez déjà mais mon frère est génial. A toute ma famille. A ceux qui nous ont quittés trop tôt. J’aurais aimé partagé ce moment avec vous. 6 A un groupe de clinique qui déchire. Pour le savoir encyclopédique de Popol, les jupes invisibles de Sno et les siestes de Frankoi quand il « surveille » le réveil des chiens. A nos fous rire, nos craquages et nos engueulades. Parce que sans vous, ses cliniques n’auraient pas eu la même saveur. A SNO. Que dire ? Parce qu’on est tellement différente qu’on peut tout se dire. Merci de me supporter depuis la prépa ! Pour nos séances racontage de vie, les Matsuri et les weekends auvergnats. A Popol. Pour son courage fou dans un aussi petit bout de femme. Mais sans rire, les furets, ca pue! A Frankoi. Un premier voisin haut en couleur. Pour ses révisions de dernières minutes et pour feu sa crotte. A Patou et Maria, mes colocs. La Spermophile me manque ! Merci pour les fous rire devant le miroir de la salle de bain, les poules non pondeuses, les tartes aux fraises et les salades fond de frigo. A Adeuh pour sa bonne humeur en clinique, les courses de Tagadaaaaaaa dans le couloir du D. Amuse toi bien au Laos !! A Guérome pour son amour des éléphants, en peluche ou en chair et en os. Et pour être aussi en retard que moi la plupart du temps ! A Dono pour ses blagues et son accent africain. Ton humour me manque. A Scrat pour les barbeuks au fond du jardin. Pour les interécoles oragnisées de mains de maitre. Et vive les fonctionnaires ! A Slanie et Kouet pour leur blondeur qui ensoleille mes journées. A Sami le rockeur fou. Pour avoir essayé de maintenir un semblant de savoir-vivre dans cette école. Attention à la couleur des chaussettes messieurs ! A Claire T-A-B-O-U-R-E-T, on a crevé le petit écran! Mo-mo-motus. A Grégou l’homme à vêlage facile. A Lilou et Pierre, nos internes en bleu. A Pilip l’interne en vert. A Marix ma co-charolaise. Même pas peur… A JB pour le courage dont tu as fait preuve durant l’épreuve que tu as traversée. Tu vas tout déchirer à Lons le Saunier ! A Chacha, allez, encore 6 ans ! A Doude le nouveau Nantais, j’espère que ton exil se passera bien. A Zouzou pour avoir mis Frankoi enceinte cette année! Vivement ton mariage en rose et t’inquiète pas, la Jerseyaise t’attends ! Et à tous les autres… En votre compagnie, ces 5 années sont passées comme l’éclair. Les booms, les partiels, les cours et la Kfet, la Revue, l’accueil et les présoirées. Tout ca va me manquer. 7 A mon Momo, Amandine, Paul et Bicou. On se voit moins mais je ne vous oublie pas. A Marmotte, on se suit depuis la maternelle, c’est fou non ? A Rapé, un Ancien qui fait rêver! Merci pour avoir été là pendant ses années d’école. Les futurs étudiants sont chanceux ! Pour ses discussions mémorables et interdites au moins de 18ans… A mes Poulots Tancrède et Jean-Romain. Je n’ai pas été une Ancienne très présente… A Maylis et Eloïse mes Hypopoulottes, la relève est assurée !! A mes maîtres de stage, pour m’avoir transmis leur amour du métier. Au docteur Delepoulle et au docteur Descotes pour m’avoir fait confiance et pour m’avoir jetée dans le grand bain. Au docteur Lebastard pour avoir tenté de me former au sexage échographique. Aux enseignants qui m’ont entourée tout au long de ma scolarité, des bancs de l’école Bois du Val aux amphithéâtres de l’ENVL. A ceux qui m’ont marquée et ceux que j’ai oubliés. A ceux que j’ai adorés et ceux que j’ai détestés. Grâce à vous je vais pratiquer le métier dont j’ai toujours rêvé. 8 Table des matières Liste des illustrations ....................................................................................................................... 13 Listes des tableaux ........................................................................................................................... 15 Liste des annexes .............................................................................................................................. 18 Introduction ...................................................................................................................................... 19 PARTIE I : RAPPELS ................................................................................................................. 21 I) Détermination chromosomique du sexe. ....................................................................................... 21 A) Le cycle cellulaire................................................................................................................. 21 1) La mitose .......................................................................................................................... 22 2) La méiose ......................................................................................................................... 24 a) Première division de méiose : division réductionnelle .................................................. 24 b) Deuxième division de méiose : la division équationnelle [LODISH(1997)] ................. 25 B) Le déterminisme primaire ..................................................................................................... 27 C) Déterminisme secondaire...................................................................................................... 28 II) La gamétogenèse ......................................................................................................................... 29 A) La spermatogenèse ............................................................................................................... 29 B) L’ovogenèse ......................................................................................................................... 31 III) Embryologie ............................................................................................................................... 33 A) La migration des cellules sexuelles primordiales .................................................................. 33 B) La formation de la gonade non différenciée ......................................................................... 33 C) La différenciation du testicule .............................................................................................. 34 D) La différenciation de l’ovaire ............................................................................................... 37 E) La différenciation des voies génitales ................................................................................... 38 1) Voies génitales mâles ....................................................................................................... 38 2) Les voies génitales femelles ............................................................................................. 39 F) La mise en place des organes génitaux externes. .................................................................. 40 1) Organes génitaux externes non différenciés...................................................................... 40 2) Différenciation des organes génitaux externes .................................................................. 41 a) Chez le mâle ................................................................................................................. 41 b) Chez la femelle ............................................................................................................. 43 G) La mise en place des glandes mammaires............................................................................. 44 PARTIE II : LES DIFFERENTES TECHNIQUES PERMETTANT DE MAITRISER LE SEXE DU PRODUIT CHEZ LES BOVINS ................................................................................................... 47 I) Les observations préliminaires...................................................................................................... 47 A) Influence de la durée entre l’œstrus et la saillie ou l’insémination ....................................... 47 B) Influence de la technique de synchronisation des chaleurs ................................................... 48 C) Influence de la technique d’insémination ............................................................................. 48 D) Influence de la gestion du troupeau ...................................................................................... 48 9 E) Influence des techniques de reproduction assistées .............................................................. 49 II) Le sexage de la semence .............................................................................................................. 50 A) Techniques .............................................................................................................................. 50 1) La cytométrie de flux ........................................................................................................ 50 a) Le principe .................................................................................................................... 50 b) Intérêt et limites du sexage de la semence par cytométrie de flux ................................. 52 i) Fiabilité du résultat ................................................................................................... 52 ii) Influence sur la qualité de la semence ....................................................................... 53 iii) Influence sur la fécondation ...................................................................................... 55 iv) Influence de la technique d’insémination .................................................................. 56 Influence sur l’embryon ............................................................................................ 57 v) vi) Influence sur le veau ................................................................................................. 57 vii) Influence sur le taux d’avortement ........................................................................ 58 viii) L’impact de la congélation .................................................................................... 58 ix) Le coût ...................................................................................................................... 59 2) Autres techniques envisagées ........................................................................................... 59 a) Association anticorps/protéine de surface ..................................................................... 59 i) Les antigènes H-Y .................................................................................................... 59 ii) Les protéines spécifiques (SSP) ................................................................................ 60 b) Tri morphologique ........................................................................................................ 64 c) Autres ........................................................................................................................... 64 III) Le sexage de l’embryon ............................................................................................................. 65 A) Les étapes préliminaires ....................................................................................................... 65 B) Sexage par caryotypage ........................................................................................................ 66 1) Le caryotypage historique ................................................................................................. 66 a) La technique ................................................................................................................. 66 b) Les limites de la technique de caryotypage ................................................................... 67 Caryotypage associé à l’hybridation in situ (FISH : Fluorescence In Situ Hybridation) ... 67 2) C) Le sexage immunologique : l’utilisation d’antisérum H-Y ................................................... 71 D) Le sexage par PCR (Polymerase Chain Reaction) classique ................................................. 74 1) La polymérisation en chaine ............................................................................................. 75 2) La lecture .......................................................................................................................... 76 3) Intérêts et limites du sexage par PCR ............................................................................... 77 L’efficacité ................................................................................................................... 77 a) i) L’influence de la technique de prélèvement des cellules embryonnaires .................. 77 ii) L’influence du nombre de cellules embryonnaires utilisées. ..................................... 78 iii) L’influence du stade de développement de l’embryon à tester.................................. 79 b) 10 L’exactitude .................................................................................................................. 80 c) Les taux de gestation obtenus ....................................................................................... 81 i) Influence de la manipulation ..................................................................................... 81 ii) Influence de la congélation ....................................................................................... 81 iii) Influence de la mère .................................................................................................. 82 iv) Influence stade de l’embryon .................................................................................... 82 v) Influence du nombre de cellules prélevées par biopsie ............................................. 82 vi) Influence de la technique de transfert ....................................................................... 83 4) Le sexage par PCR (Polymerase Chain Reaction) sans électrophorèse : une variante de la PCR classique ........................................................................................................................... 83 E) a) Le risque de faux positifs du sexage de l’embryon par PCR (polymerase chain reaction) 84 b) Le risque de faux négatifs lors de sexage de l’embryon par PCR ................................. 84 Le sexage par la technique LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ................... 84 1) Le principe ........................................................................................................................ 84 2) La lecture .......................................................................................................................... 85 3) La technique de LAMP appliquée au sexage des embryons bovins .................................. 86 F) Les autres techniques envisagées .......................................................................................... 87 1) Le sexage par dosage de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) ...................... 87 2) La détermination du sexe en fonction de la vitesse de segmentation embryonnaire ......... 87 3) La glucosamine ................................................................................................................. 88 IV) Détermination du sexe du fœtus par échographie....................................................................... 89 A) Technique ............................................................................................................................. 89 1) Phase préparatoire ............................................................................................................ 89 a) Préparation de l’animal ................................................................................................. 89 b) Le matériel .................................................................................................................... 89 2) Les pré-requis ................................................................................................................... 90 a) Le plan de coupe ........................................................................................................... 90 b) Age du fœtus................................................................................................................. 91 3) Le sexage .......................................................................................................................... 92 L’anatomie fœtale ......................................................................................................... 92 a) i) Fœtus mâle................................................................................................................ 94 ii) Fœtus femelle ........................................................................................................... 95 b) Les périodes de sexage. ................................................................................................ 96 B) Intérêts et limites .................................................................................................................. 97 1) Exactitude ......................................................................................................................... 97 2) Les risques d’erreur .......................................................................................................... 98 L’interprétation des images .......................................................................................... 98 a) i) Les vertèbres coccygiennes....................................................................................... 98 11 ii) Le cordon ombilical .................................................................................................. 99 iii) Le corps du pénis et le raphé médian ...................................................................... 100 b) 3) Les autres facteurs de risques ..................................................................................... 100 L’innocuité ..................................................................................................................... 100 PARTIE III : DISCUSSION....................................................................................................... 101 I) Les intérêts de la gestion du sexe des veaux ........................................................................... 101 A) L’accélération de l’amélioration génétique du troupeau ..................................................... 101 1) Les troupeaux producteurs .............................................................................................. 101 2) Les sélectionneurs .......................................................................................................... 101 B) L’augmentation de la productivité ...................................................................................... 102 1) En élevage laitier ............................................................................................................ 102 2) En élevage allaitant ......................................................................................................... 103 C) Une plus grande fluidité dans le processus de renouvellement de l’effectif ........................ 103 II) Applications pratiques ............................................................................................................ 104 A) Production laitière .............................................................................................................. 104 1) Elevage Prim’Holstein .................................................................................................... 104 a) Elevage traditionnel=Elevage Holstein : 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein (Annexe1) ............................................................................. 104 b) Elevage Holstein : insémination en semence sexée X sur les génisses et en semence Holstein non sexée sur les vaches (Annexe 2) .................................................................... 105 c) Elevage Holstein composé de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et de 20 génisses inséminées en semence sexée X Holstein................................................ 107 2) Elevage Montbéliard....................................................................................................... 109 a) Elevage Montbéliard composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées avec de la semence Montbéliarde non sexée (Annexe 4)..................................................................... 109 b) Elevage Montbéliard composé de 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et de 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 5) 110 c) Elevage Montbéliard composé de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et de 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde ...................... 112 3) Conclusion ...................................................................................................................... 113 B) Production allaitante : élevage Charolais ............................................................................ 113 1) Elevage Charolais composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Charolaise non sexée (Annexe 7) ........................................................................................... 114 2) Elevage Charolais avec insémination en semence sexée Charolaise X des génisses et insémination en semence non sexée Charolaise des vaches .................................................... 115 3) Elevage Charolais avec insémination en semence sexée X des génisses et en semence sexée Y des vaches ................................................................................................................. 116 4) Conclusion ...................................................................................................................... 117 Bibliographie .................................................................................................................................. 128 12 Liste des illustrations Figure 1 : Le cycle cellulaire [d’après LODISH(1997)] ....................................................................... 21 Figure 2 : Les différentes phases de la mitose [McGEADY(2006)] ..................................................... 23 Figure 3: La première division de méiose [McGEADY(2006)] ........................................................... 25 Figure 4: La deuxième division de méiose [McGEADY(2006)] .......................................................... 26 Figure 5: La fécondation : le retour à la diploïdie................................................................................. 27 Figure 6: La spermatogenèse [GILBERT (2) (1996) d’après Bloom et Fawcett (1975)]...................... 30 Figure 7: Coupe dans un tube séminifère : schéma de la production des spermatozoïdes [GILBERT (2) (1996) d’après Dym (1977)]................................................................................................................. 31 Figure 8: La production d’ovocyte par l’ovaire [MacGEADY et al. (2006)] ....................................... 32 Figure 9: Migration des cellules sexuelles primordiales [MacGEADY et al. (2006)] .......................... 33 Figure 10: Schéma d’une gonade au stade indifférencié [McGEADY et al. (2006)]............................ 34 Figure 11: La différenciation du testicule [McGEADY et al. (2006)] .................................................. 35 Figure 12: Descente des testicules chez les bovins [McGEADY et al. (2006)] .................................... 36 Figure 13: La différenciation de l’ovaire [McGEADY et al. (2006)] ................................................... 37 Figure 14: Les voies génitales au stade indifférencié [McGEADY et al. (2006)] ................................ 38 Figure 15: Les voies génitales mâles [McGEADY et al. (2006)] ......................................................... 39 Figure 16: Les voies génitales femelles [McGEADY et al. (2006)] ..................................................... 40 Figure 17: Organes génitaux externes non différenciés [McGEADY et al. (2006)] ............................. 41 Figure 18: Différenciation des organes génitaux externes mâles [MacGEADY et al. (2006)] ............. 42 Figure 19: Formation de l’urètre [McGEADY et al. (2006)]................................................................ 42 Figure 20: Abouchement de l’urètre pénien à l’extrémité du pénis [MacGEADY et al. (2006)] ......... 43 Figure 21: La différenciation des organes génitaux externes femelles [McGEADY et al. (2006)]....... 43 Figure 22: La formation des mamelles [MacGEADY et al. (2006)]..................................................... 44 Figure 23: Mise en place de l’organisation interne de la mamelle [McGEADY et al. (2006)] ............. 45 Figure 24: Schéma du montage de sexage de la semence par cytométrie du flux [SEIDEL(2007)] ..... 51 Figure 25: Montage [SEIDEL(2002)] .................................................................................................. 52 Figure 26: Analyse par l’ordinateur de la fluorescence émise : sexage du spermatozoïde en fonction de l’intensité de la fluorescence enregistrée. [SEIDEL(2002)] ................................................................ 53 Figure 27: Principe de l’isolement des SSP à partir de protéines de spermatozoïdes non sexés (phase 2) d’après BLECHER et al. (1999)........................................................................................................... 62 Figure 28 : Stade de développement de l’embryon [Datation : TAINTURIER, BENCHARIF, BRIAND(2006), Image : BALAS source internet] .............................................................................. 65 Figure 29: Caryotype bovin [www.cytogenetique.envt.fr] ................................................................... 66 Figure 30: Principe de la fluorescence in situ hybridation (www.lookfordiagnosis.com)..................... 68 Figure 31: Lecture de l’hybridation in situ avec une sonde du chromosome Y [LEE et al. (2004)] ..... 69 Figure 32: Morula avant traitement [RAMALHO et al. (2004)] .......................................................... 73 Figure 33: Embryons au stade morula compacte après traitement à l’antisérum H-Y et classé comme mâles [RAMALHO et al. (2004)] ........................................................................................................ 73 Figure 34: Embryons au stade blastocyste après traitement à l’antisérum H-Y et classés comme femelles [RAMALHO et al. (2004)] .................................................................................................... 74 Figure 35: Les différentes étapes de la PCR [www.inrp.fr] .................................................................. 75 Figure 36: représentation schématique de la lecture d’un résultat de sexage par PCR d’après NIBART et THIBIER (1995) .............................................................................................................................. 76 Figure 37: Les étapes de la technique de LAMP [site internet du Journal of Microbiology] ................ 85 Figure 38: Tube positif et tube négatif après une LAMP [HIRAYAMA et al. (2004)] ........................ 85 Figure 39: LEBASTARD (2003) ......................................................................................................... 90 13 Figure 40: Développement des organes génitaux externes dans l’espèce bovine [BARONE (2001)] .. 92 Figure 41: Visualisation échographique des organes génitaux de l‘embryon mâle en fonction du stade de gestation en jours d’après TAINTURIER (2001) ............................................................................ 93 Figure 42: Visualisation échographique des organes génitaux de l’embryon femelle en fonction du stade de gestation en jours d’après TAINTURIER (2001) ................................................................... 93 Figure 43: fœtus mâle de 55 jours, coupe frontale [CROS ; UCRA(2005)] ......................................... 94 Figure 44: Fœtus mâle de 68 jours, coupe longitudinale [CROS ; UCRA (2005)] ............................... 94 Figure 45: fœtus mâle de 83 jours, coupe transversale [CROS ; UCRA(2005)] ................................... 94 Figure 46: fœtus femelle 56 jours, coupe frontale [CROS ; UCRA(2005)] .......................................... 95 Figure 47: fœtus femelle 96 jours, coupe transversale, [CROS ; UCRA (2005)] ................................. 95 Figure 48: Image échographique d’un fœtus femelle de 67 jours en coupe transversale [TAINTURIER (2001)] ................................................................................................................................................. 98 Figure 49: Image échographique d’un fœtus femelle de 68 jours en coupe frontale [TAINTURIER (2001)] ................................................................................................................................................. 99 Figure 50: Coupe transversale d’un fœtus mâle de 63 jours [TAINTURIER (2001)] .......................... 99 Figure 51: Coupe frontale d’un fœtus femelle de 67 jours [TAINTURIER (2001)] ........................... 100 Figure 52: Schéma de sélection classique des nouveaux taureaux reproducteurs ............................... 102 14 Listes des tableaux Tableau 1: Résumé des interactions entre SRY et Dax-1 [GILBERT (1) (1996), d’après MAC ELREAVEY et al. (1993)] ................................................................................................................... 28 Tableau 2: Influence de la synchronisation des chaleurs chez la vache sur le sexe ratio de la progéniture [XU et BURTON (1999)] ................................................................................................. 48 Tableau 3: Influence du temps de co-incubation sur le sexe ratio des embryons lors de fécondation in vitro [IWATA et al. (2008)] ................................................................................................................. 49 Tableau 4: Influence du moment de mise en présence de l’ovocyte avec la semence par rapport à l’expulsion du premier globule polaire [DOMINKO et al. (1997)] ...................................................... 49 Tableau 5 : Influence de la vitesse de tri sur la pureté de la semence [JOHNSON et WELCH (1999)]52 Tableau 6:Effets du diamètre de l’aiguille et de la pression sur la semence en sexage par cytométrie de flux [SUH et al. (2005)] ....................................................................................................................... 54 Tableau 7 : Influence de la pression de sortie du cytomètre de flux sur le taux de gestation [SCHENK et al. (2009)]......................................................................................................................................... 55 Tableau 8: Influence du sexage par cytométrie de flux de la semence sur les taux de clivage et de formation de blastocystes d’après ZHANG et al. (2003) et LU et al. (1999) ....................................... 55 Tableau 9: Influence de l’état d’involution utérine sur les taux de gestation réciproquement en semence sexée et non sexée. D’après SEIDEL (1999) ......................................................................... 56 Tableau 10: Les anomalies chromosomiques des embryons obtenus à partir de sperme sexé [GARCIA (2010)] ................................................................................................................................................. 57 Tableau 11: Caractéristiques des veaux nés de semence sexée [SEIDEL et al. (2002)] ....................... 57 Tableau 12: Influence de la congélation sur la qualité du sperme sexé et non sexé [CARVALHO (2010)] ................................................................................................................................................. 58 Tableau 13: Influence du temps entre la collecte et la congélation sur la viabilité et la mobilité des spermatozoïdes sexés [SCHENK et al. (2009)] .................................................................................... 58 Tableau 14: Différents sérums mis au point pour l’expérience d’après BLECHER et al. (1999) ......... 60 Tableau 15: Résultats des embryons obtenus par fécondation avec de la semence sexée par antisérum femelle d’après BLECHER et al. (1999) .............................................................................................. 63 Tableau 16: Le sexage par caryotypage [HARE et al. (1976) ; WINTERBERGER et POPESCU (1980)] ................................................................................................................................................. 67 Tableau 17: Exactitude du sexage d’un blastomère unique par hybridation in situ par rapport au sexage par hybridation in situ de l’embryon entier [LEE et al. (2004)] ........................................................... 70 Tableau 18: Influence des différents traitements utilisant les anticorps H-Y sur le développement [GARDON et al. (2004)]...................................................................................................................... 72 Tableau 19: Séquences nucléotidiques d’amorces Y spécifiques ......................................................... 74 Tableau 20: Influence de la technique de prélèvement sur l’efficacité du sexage................................. 77 Tableau 21: Influence du nombre de blastomères sur l’efficacité du sexage d’après PARK et al. (2001) ................................................................................................................................................... 78 Tableau 22: Influence du stade de développement de l’embryon sur l’efficacité du sexage par PCR (SHEA (1998) et LOPATAROVA et al. (2008) .................................................................................. 79 Tableau 23: Exactitude du sexage par PCR [THIBIER et NIBART (1995)] ........................................ 80 Tableau 24: Taux de gestation après sexage selon les études ............................................................... 81 Tableau 25: L’influence du stade de l’embryon au moment du transfert sur le taux de gestation [LACAZE et al. (2008)] ....................................................................................................................... 82 Tableau 26: L’influence du nombre de cellules prélevées lors de la biopsie sur le taux de gestation [LACAZE et al. (2008)] ....................................................................................................................... 82 15 Tableau 27: Influence de la méthode de transfert sur le taux de gestation [LOPATAROVA et al. (2008)] ................................................................................................................................................. 83 Tableau 28: Efficacité et exactitude du sexage par la méthode de LAMP [HIRAYAMA et al. (2004)] ............................................................................................................................................................. 86 Tableau 29: Sexage par dosage de la glucose-6-phosphate déshydrogénase [WILLIAMS (1986)] ...... 87 Tableau 30: Répartition des embryons mâles et femelles suivant la vitesse de segmentation [AVERY et al. (1989)]......................................................................................................................................... 88 Tableau 31: Eléments de détermination de l’âge du fœtus [DESCOTEAUX et al. (2009)] ................. 91 Tableau 32: Critères majeurs de diagnose du sexe du fœtus en fonction de la période de sexage, d’après [TAINTURIER (2001), LEBASTARD (2003)]....................................................................... 96 Tableau 33: Exactitudes du sexage échographique obtenues suivants les auteurs ............................... 97 Tableau 34: Elevage Holstein: 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein (Annexe 1) ........................................................................................................................... 105 Tableau 35: Bilan économique de la saison de reproduction d’un élevage Holstein : 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein (Annexe 2)............................................. 105 Tableau 36: Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence Holstein non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 2) ........................................................................ 106 Tableau 37: Bilan économique de la saison de reproduction, Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence Holstein non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 2) ........................................................................................................................................................... 106 Tableau 38: Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence charolaise non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 3) ........................................................................ 107 Tableau 39: Bilan économique de la saison de reproduction, Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence charolaise non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 3) ........................................................................................................................................................... 108 Tableau 40: Elevage Montbéliard avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Montbéliarde non sexée (Annexe 4) ................................................................................................... 110 Tableau 41: Bilan financier de la saison de reproduction d’un élevage Montbéliard avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Montbéliarde (Annexe 4) ................................ 110 Tableau 42 Elevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 5) .................................................. 111 Tableau 43: Bilan financier de la saison de reproduction d’un élevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 5) ................................................................................................................... 111 Tableau 44: Elevage Montbéliard composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 6) ........................ 112 Tableau 45: Bilan de la saison de reproduction d’un élevage Montbéliard composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 6) ................................................................................................................... 112 Tableau 46: Elevage Charolais composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Charolaise non sexée (Annexe 7) ....................................................................................................... 114 Tableau 47: Bilan financier de la saison de reproduction d’élevage Charolais composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Charolaise non sexée (Annexe 7) .................................... 114 Tableau 48: Elevage Charolais composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 8) .............................................. 115 Tableau 49: Bilan financier de la saison de reproduction d’un élevage Charolais composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 8) ........................................................................................................................ 115 Tableau 50: Elevage Charolais composé de 80 vaches inséminées en semence sexée Y charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 9) ...................................................... 116 16 Tableau 51: Bilan financier d’un élevage Charolais composé de 80 vaches inséminées en semence sexée Y Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 9) .............. 117 17 Liste des annexes Annexe 1: Elevage Holstein avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein .............................................................................................................................................. 119 Annexe 2: Elevage Holstein avec 80 vaches inséminées en semence Holstein non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X ........................................................................................... 120 Annexe 3: Elevage Holstein avec 80 vaches inséminées en semence charolaise non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X ............................................................................. 121 Annexe 4: Elevage Montbéliard : 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Montbéliarde ...................................................................................................................................... 122 Annexe 5 : Elevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde ..................................................................... 123 Annexe 6: Elevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde ..................................................................... 124 Annexe 7: Elevage charolais avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Charolaise .......................................................................................................................................... 125 Annexe 8: Elevage Charolais avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolais et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolais ........................................................................... 126 Annexe 9: Elevage Charolais avec 80 vaches inséminées en semence sexée Y Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise ......................................................................... 127 18 Introduction La reproduction du cheptel est une des principales problématiques de l’éleveur bovin, qu’il soit laitier ou allaitant. Le rendement de son troupeau dépend des capacités de production des animaux ainsi que de la qualité de son troupeau de renouvellement. Les techniques de reproduction assistées des bovins a permis une évolution des systèmes d’élevage, notamment avec la démocratisation de l’insémination artificielle et du transfert embryonnaire. Les éleveurs ont maintenant la possibilité de choisir le sexe de la progéniture grâce à la commercialisation de semence sexée ou par sexage des embryons transférés. Après des rappels sur la définition génétique et phénotypique du sexe de l’embryon, nous nous intéresserons aux différentes techniques permettant de sexer la semence et les embryons bovins. Nous nous pencherons également sur la possibilité de sexer le fœtus par échographie. Enfin, nous tenterons de définir si ces techniques sont utilisables sur le terrain en prenant l’exemple de l’emploi de semence sexée dans différents schémas d’élevage. 19 20 PARTIE I : RAPPELS I) Détermination chromosomique du sexe. A) Le cycle cellulaire Figure 1 : Le cycle cellulaire [d’après LODISH(1997)] Le cycle cellulaire désigne l’ensemble des phases par lesquelles passent les cellules au cours de leur vie. Suivant le type cellulaire pris en compte, l’enchainement des ces phases est plus ou moins rapide. La phase G0 La phase G0 représente la phase de quiescence cellulaire. La cellule peut quitter cet état G0 pour l’état G1, prélude du cycle cellulaire [LODISH(1997)]. La phase G1 La phase G1 est la phase d’activité métabolique de la cellule. Durant cette phase, la cellule effectue les fonctions définies par l’expression de son génome. C’est également une période de croissance cellulaire. Durant cette phase, le génome de la cellule est constitué de 2n chromosomes [LODISH(1997)]. La phase S C’est la phase pendant laquelle le génome cellulaire est répliqué. La cellule passe alors de 2n chromosomes à 4n chromosomes [LODISH(1997)]. 21 La phase G2 C’est l’équivalent de la phase G1 mais d’une durée habituellement plus courte associé à une phase de régulation [LODISH (1997)]. Ces régulations concernent les conditions intra et extracellulaires. Ces régulations bloquent le passage à la mitose ou la méiose si les conditions extérieures ne sont pas favorables ou si la réplication n’est pas achevée. La phase M Elle désigne la mitose ou la méiose. 1) La mitose La mitose peut être découpée en plusieurs étapes [LODISH(1997)] : La prophase Elle correspond à la période de condensation du matériel génomique. Celui-ci passe d’un aspect de chromatine diffuse à celui de chromosomes condensés. Les deux chromatides sont reliées par leur centromère. Dans le cytoplasme, le cytosquelette se met en place et des microtubules relient les deux centrioles répliqués. Ces centrioles commencent leur migration et délimitent alors deux pôles à la cellule. La métaphase Durant la pro-métaphase, la membrane nucléaire disparait. Les centromères, sont reliés aux centrioles via les kinétochores et les microtubules. Au cours de la métaphase, les mouvements des microtubules amènent les centromères au niveau du plan équatorial de la cellule. L’anaphase Les chromatides jumelles sont séparées et migrent chacune vers un pôle de la cellule, grâce au raccourcissement des microtubules. La télophase Elle consiste en l’étranglement de la cellule dans son plan médian. La membrane nucléaire se reconstitue. 22 Figure 2 : Les différentes phases de la mitose [McGEADY(2006)] Conclusion : la mitose permet la création de deux cellules filles génétiquement identiques entre elles et à la cellule-mère. 23 2) La méiose Comme précédemment, plusieurs phases peuvent être observées lors d’une méiose [LODISH(1997)]. a) Première division de méiose : division réductionnelle La prophase I Elle correspond, comme dans la mitose, à condensation du matériel génétique. Durant cette phase, des échanges de matériel chromosomique sont possibles entre chromosomes homologues grâce au phénomène de « crossing-over » au niveau des chiasmas. A la fin de ces échanges, les chromosomes homologues sont alors formés de chromatides recombinées. La métaphase I Comme dans la mitose, les chromosomes sont reliés aux centrioles via des microtubules accrochés aux centromères par les kinétochores. Ils sont positionnés au niveau du plan équatorial de la cellule. Cependant contrairement à la mitose, les chromosomes sont appariés par paires homologues. L’anaphase I Durant l’anaphase I, un exemplaire de chromosome de chaque paire migre vers un des pôles cellulaires. Contrairement à la mitose, les centromères ne sont pas divisés en deux. La télophase I De même que dans la mitose, l’étranglement progressif de la membrane cellulaire conduit à la formation de deux cellules filles. Le cytoplasme est séparé de façon plus ou moins équitable suivant le type de cellule. (Spermatozoïde/ovocyte) 24 Figure 3: La première division de méiose [McGEADY(2006)] b) Deuxième division de méiose : la division équationnelle [LODISH(1997)] La prophase II Idem que pour la prophase 1. La métaphase II Les chromosomes sont placés au niveau du plan équatorial de la cellule via leur kinétochore. L’anaphase II Les centromères sont divisés et les chromatides jumelles migrent vers un des pôles cellulaires. 25 La télophase II Le cytoplasme est séparé en deux par l’étranglement de la membrane cellulaire. Figure 4: La deuxième division de méiose [McGEADY(2006)] Conclusion : La méiose permet le passage d’une cellule mère diploïde à quatre cellules filles haploïdes. Le matériel génétique des quatre filles n’est pas strictement identique, du fait des recombinaisons apparues en prophase I. 26 B) Le déterminisme primaire La fécondation permet la création d’un zygote diploïde à partir de deux gamètes haploïdes. Individu femelle Individu mâle Gamètes produits X X Zygotes XX X XY XX Y XY Figure 5: La fécondation : le retour à la diploïdie D’après ce schéma, tout individu XY est un mâle et tout individu XX est une femelle. Or, on trouve dans les populations mammifères des individus phénotypement femelles et génotypement XY ou encore des individus mâles de génotypes XX [McGEADY(2006)]. NB : Dans ce paragraphe, nous appellerons « femelles » les individus à gonades femelles et « mâles » les individus à gonades mâles. Des expériences d’hybridation ont montré que les individus XX possédant le bras cours du chromosome Y par translocation avaient des gonades mâles, alors que les individus XY privés du bras cours du Y avaient des gonades femelles [GILBERT (a) (1996)]. Le gène déterminant le sexe gonadique semble donc se trouver sur le bras cours du chromosome Y. Il a par la suite été localisé plus spécifiquement et appelé le gène SRY. Ce gène fonctionne notamment comme un facteur de transcription car il possède un domaine de liaison à l’ADN : la boite HMG (High Mobility Group). Le peptide codé par SRY a été appelé TDF pour Testicule Determination Factor. KOOPMAN et al. (1991) ont montré que l’insertion de SRY dans les pronucléi de zygotes de souris femelles juste fécondées provoque la formation de testicules chez les embryons XX. Si le gène SRY est indispensable, il n’est pas suffisant pour la formation d’individus mâles. En effet on retrouve de façon rare des individus femelles XY, SRY+ et des individus mâles XX, SRY-. Cela indique que d’autres gènes, placés sur les chromosomes autosomes sont impliqués dans le déterminisme sexuel. Ainsi, la présence d’un gène Z inhibant la différenciation des testicules a été suspectée. Le gène Dax-1 responsable de la formation d’un récepteur nucléaire pourrait être ce gène inhibiteur. La différenciation du testicule ne peut avoir lieu que si le gène Dax-1 est inhibé par SRY [McGEADY(2006)]. 27 SRY Gène Dax-1 Gonade XY, SRY+ mâles Actif Inhibé Testicule XX, SRY- femelles Inactif Actif Ovaire XX, SRY- mâles Absent Inactif (Muté) Testicule XY, SRY+ femelles Actif Actif (muté) Ovaire Tableau 1: Résumé des interactions entre SRY et Dax-1 [GILBERT (1) (1996), d’après MAC ELREAVEY et al. (1993)] C) Déterminisme secondaire Le déterminisme primaire que nous venons de décrire induit la différenciation des gonades mais pas le phénotype sexuel. La détermination sexuelle secondaire, c’est-à-dire la formation des organes génitaux externes et les caractéristiques sexuelles secondaires est déterminée par des hormones. Ainsi, les œstrogènes entraînent la mise en place d’un phénotype femelle alors que les androgènes entraînent l’apparition d’un phénotype mâle. Le phénotype mâle est sous la dépendance de deux hormones produites par les testicules : l’AMH (Anti Mullerian Hormone) produite par les cellules de Sertoli et la testostérone produite par les cellules de Lyedig. L’AMH entraine la régression des canaux de Muller alors que la testostérone induit le développement des canaux de Wolff en épididyme, canaux déférents et glandes séminales. La formation des organes génitaux externes est également dépendante de cette hormone sous sa forme 5dihydrotestostérone (5αDHT). Ici encore, certaines pathologies peuvent entrainer des phénotypes en désaccord avec le génotype. Par exemple, le syndrome d’insensibilité aux androgènes explique l’existence d’individus aux testicules fonctionnels mais au phénotype femelle [GILBERT (1) (1996)]. 28 II) La gamétogenèse A) La spermatogenèse Lors de l’embryogenèse et de la croissance, un stock de cellules germinales primaires se met en place à partir de l’endoderme et migre dans les gonades en formation. Une fois dans les cordons séminifères, ces cellules primaires restent en état de quiescence jusqu’à la puberté. Une fois réactivées elles subissent des mitoses répétées. Les cellules filles, reliées entre elles par des ponts cytoplasmiques forment alors des spermatogonies de type A puis des spermatogonies de type B. De ces spermatogonies B vont dériver les spermatocytes primaires diploïdes qui subissent la première division de méiose. De cette division naissent les spermatocytes secondaires. La seconde division de méiose fait apparaitre les spermatides haploïdes. Les spermatides subissent alors la spermatogenèse qui les mène à se différencier en spermatozoïdes. D’une cellule comportant un cytoplasme abondant et les organites usuels (noyau, appareil de Golgi, mitochondrie, réticulum endoplasmique), la spermatide passe à une cellule hyper différenciée, le spermatozoïde. Le cytoplasme est réduit, le cytosquelette est réorganisé et forme une queue de filaments axiaux centrés sur les centrioles. Les mitochondries sont regroupées au niveau du corps de la cellule. A ce stade, la cellule sexuelle est toujours attachée à un corps résiduel. Durant toutes ces transformations, elle maintient un lien étroit avec les cellules de Sertoli qui assurent sa nutrition. A ce stade, à l’occasion de contractions du muscle lisse contenu dans les parois de la membrane du conduit spermatique, les spermatozoïdes se détachent et sont acheminés dans l’épididyme où ils subissent une maturation qui les rend aptes à la fécondation. Ils sont alors stockés dans la queue de l’épididyme en attente d’une éjaculation. Le transport vers la queue de l’épididyme met environ 12 jours mais ce délai peut être réduit lors d’éjaculations rapprochées. Ils restent viables jusqu’à trois semaines chez les mammifères domestiques [GILBERT(2) (1996)]. 29 Figure 6: La spermatogenèse [GILBERT (2) (1996) d’après Bloom et Fawcett (1975)] 30 Figure 7: Coupe dans un tube séminifère : schéma de la production des spermatozoïdes [GILBERT (2) (1996) d’après Dym (1977)] B) L’ovogenèse Comme la lignée germinale mâle, les ovocytes dérivent de la lignée endodermique. Durant l’embryogenèse, les cellules germinales primordiales subissent de nombreuses mitoses en forment alors la population d’ovogonies. Aux alentours de la naissance de l’individu, ces cellules subissent la première division de méiose sans subir la seconde. Ils deviennent des ovocytes primaires diploïdes qui restent quiescents en prophase de méiose I jusqu’à la puberté de l’individu. Cette population d’ovocytes primaires forme le stock de cellules sexuelles pour toute la vie de l’animal, la prolifération des ovogonies stoppant durant le péri-partum. Au sein de l’ovaire, les ovocytes primordiaux et primaires sont initialement entourés d’une unique couche de cellules. Durant les multiples vagues folliculaires, de nombreux ovocytes primaires vont s’atrésier. Un des ovocytes, sous l’influence de l’hormone FSH achève alors la première division de méiose. Il devient un follicule secondaire haploïde. Autour de l’ovocyte sélectionné, une épaisse couche de cellules stratifiées se met en place. De nombreuses jonctions Gap se créent et assurent la 31 nutrition de l’ovocyte. Un antrum se développe. On est en présence d’un follicule pré-ovulatoire haploïde, bloqué en métaphase de méiose II [GILBERT (2) (1996)]. Figure 8: La production d’ovocyte par l’ovaire [MacGEADY et al. (2006)] Lors de la fécondation, le contact entre le spermatozoïde et l’ovocyte entraine l’achèvement de la deuxième division de méiose. La pénétration du spermatozoïde permet la restauration de la diploïdie. Le zygote formé possède une copie du génome de ses deux parents. 32 III) Embryologie A) La migration des cellules sexuelles primordiales Les cellules sexuelles primaires sont détectables dans le cordon ombilical à un stade précoce du développement embryonnaire. Elles migrent vers les zones destinées à se différencier en gonade. Elles y parviennent dès le 28ème jour chez les bovins [McGEADY et al (2006)]. Ces cellules primordiales sont ensuite stockées dans les prémices des gonades embryonnaires. Figure 9: Migration des cellules sexuelles primordiales [MacGEADY et al. (2006)] Les cellules germinales primaires qui ne rejoignent pas à temps les gonades embryonnaires subissent une apoptose. Si ce n’est pas le cas, elles peuvent être à l’origine de structures anormales qui associent des cellules des trois couches embryonnaires et présenter au final des structures très différenciées (peau, poil, dent….) [McGEADY et al. (2006)]. B) La formation de la gonade non différenciée L’origine exacte des cellules somatiques formant les gonades n’a pas été clairement élucidée. L’hypothèse principale propose une triple origine avec des cellules dérivant du tissu mésenchymateux local, de l’épithélium cœlomique et des tubules mésonéphriques. La mise en place des gonades commence par l’apparition de deux crêtes qui se développent médialement au mésonéphros. Elles font saillie dans la cavité cœlomique et sont ensuite recouvertes par de l’épithélium. Les cellules d’origine mésonéphrique forment ensuite un système de tubules (le futur rete testis ou rete ovarii). Les gonades prennent ensuite un aspect globulaire. Le caractère mâle ou femelle n’est pas différentiable à ce stade [McGEADY et al. (2006)]. 33 Figure 10: Schéma d’une gonade au stade indifférencié [McGEADY et al. (2006)] C) La différenciation du testicule Les cellules mésonéphriques situées en périphérie de la gonade se différencient en cordons spermatiques qui contiennent les cellules germinales primordiales. Ces cordons fusionnent en partie centrale de la gonade avec le rete testis via des canaux de connections. La couche périphérique des cordons spermatiques est composée de cellules mésonéphriques qui se différentient en cellules de Sertoli. Ensuite, les cellules mésodermiques présentent entre les cordons se différencient en cellules de Leydig, produisant la testostérone [McGEADY et al. (2006)]. En même temps, le tissu conjonctif du testicule se met en place. Les cellules mésenchymateuses présentes sous l’épithélium forment l’albuginée. Celles présentes entre les cordons spermatiques forment des cloisons qui divisent le testicule en lobules [McGEADY et al. (2006)]. 34 A ce stade, le testicule est différencié et présente son anatomie finale mais il ne produit pas de spermatozoïde. La production de testostérone par les cellules de Leydig est inhibée jusqu’à l’adolescence. Lors de la levée de l’inhibition, (autour de 6-8 mois chez les bovins) la production de testostérone entraine la transformation des cordons spermatiques en tubules séminifères, aptes à la production de spermatozoïdes [McGEADY et al. (2006)]. Figure 11: La différenciation du testicule [McGEADY et al. (2006)] La descente des testicules dans le scrotum intervient chez les bovins environ au 4ème mois de gestation. Les testicules sont tirés vers le bas par le gubernaculum qui relie le pôle caudal du mésonéphros à la région inguinale. Le gubernaculum est présent dès les premiers temps du développement embryonnaire, avant la mise en place de la musculature abdominale. Lorsque les muscles se mettent en place, un passage pour le gubernaculum est laissé vacant à travers les muscles obliques internes et externes : l’anneau inguinal. Le mécanisme de rétractation du gubernaculum n’est pas connu et plusieurs hypothèses sont émises : contraction de cellules musculaires, réorganisation du gubernaculum, augmentation de la pression intra-abdominale…Une évagination du péritoine est emportée également dans la descente et forme la vaginale. Lorsque le testicule est en place, le gubernaculum se différencie. La partie proximale dégénère. La partie distale forme le ligament scrotal. Le muscle crémaster dérive du muscle oblique interne [McGEADY et al. (2006)]. 35 Figure 12: Descente des testicules chez les bovins [McGEADY et al. (2006)] 36 D) La différenciation de l’ovaire Les cellules qui forment les ovaires sont d’origine mésothéliale [McGEADY et al. (2006)]. Elles se différencient en une corticale dense et une médulla plus lâche. Au sein de cette corticale, les ovogonies s’entourent d’une couche de cellules somatiques différenciées en cellules de la thèque et cellules de la granulosa et forment les follicules primordiaux. Les tubules sexuels primitifs dégénèrent [GIBERT (1) (1996)]. Figure 13: La différenciation de l’ovaire [McGEADY et al. (2006)] Comme chez les mâles, les gonades des individus femelles migrent dans la cavité abdominale grâce au gubernaculum. Chez la vache, cette migration est importante en direction caudale et la place finale des ovaires est située à l’entrée du bassin. Quand les ovaires ont atteint leur place définitive, le gubernaculum se différencie en ligament propre de l’ovaire en le ligament rond de l’utérus [McGEADY et al. (2006)]. 37 E) La différenciation des voies génitales Au départ, l’embryon contient à la fois les canaux de Wolff d’origine mésonéphrique et les canaux Muller d’origine paramésonéphrique. Suivant le genre de l’embryon, un des types de canaux va régresser [McGEADY et al. (2006)]. Figure 14: Les voies génitales au stade indifférencié [McGEADY et al. (2006)] 1) Voies génitales mâles Les canaux de Müller s’atrophient à l’exception d’une petite zone craniale du testicule qui forme l’apex du testicule (appendix testis). Les canaux mésonéphriques en regard du testicule perdent leur glomérule et forment alors la connexion entre le conduit mésonéphrique et les canaux intra gonadiques. Ils évoluent jusqu’à former les canaux efférents. Les canaux mésonéphriques ne se trouvant pas en regard du testicule dégénèrent et forment alors le paradidyme et l’apex de l’épididyme (appendix epididymis) [McGEADY et al. (2006)]. Le conduit mésonéphrique persiste depuis le pôle craniale du testicule jusqu’au sinus urogénital. Au niveau de l’abouchement des canaux efférents, il s’élargit et forme l’épididyme. La partie caudale au testicule se renforce d’une paroi contenant des cellules musculaires et forme alors le conduit déférent. 38 Au niveau du sinus urogénital, le conduit mésonéphrique s’évagine et forme les glandes séminales [McGEADY et al. (2006)]. Au niveau du sinus urogénital l’épithélium endodermique forme l’urètre et ses expansions vers les glandes bulbo-urétrales et la prostate [McGEADY et al. (2006)]. Figure 15: Les voies génitales mâles [McGEADY et al. (2006)] 2) Les voies génitales femelles La partie craniale des canaux paramésonéphriques évolue en oviductes et la partie caudale se différencie en corne, en corps et en col de l’utérus. Cette étape de l’organogenèse intervient aux alentours du 34ème jour chez les bovins. La partie la plus craniale des oviductes ainsi formés reste ouverte et permet une communication entre la lumière des oviductes et la cavité cœlomique. Il persiste chez l’individu adulte un passage entre la lumière de l’oviducte et la cavité péritonéale. Cette communication n’existe pas chez l’individu mâle [McGEADY et al. (2006)]. La partie caudale des canaux paramésonéphriques s’élargit et s’épaissit pour former les cornes utérines. Les deux canaux fusionnent caudalement à ses cornes sur le plan médian pour former le corps et le col de l’utérus. La fusion plus ou moins craniale explique les différentes conformations utérines qui se retrouvent chez les mammifères. L’unique canal résultant progresse caudalement et fusionne avec le sinus urogénital. Ce contact entraine la prolifération de l’endoderme du sinus qui 39 forme alors le plancher du vagin. La fusion entre l’utérus et le sinus urogénital a lien le 50ème jour chez le bovin [McGEADY et al. (2006)]. Le vagin dérive donc à la fois de l’endoderme du sinus urogénital et des canaux paramésonéphriques. La lumière du vagin est primairement séparée du vestibule du sinus urogénital par l’hymen qui disparaitra au cours de la vie de l’animal [McGEADY et al. (2006)]. Des vestiges des canaux mésonéphriques persistent chez l’individu femelle au sein du mésovarium [McGEADY et al. (2006)]. Figure 16: Les voies génitales femelles [McGEADY et al. (2006)] F) La mise en place des organes génitaux externes. 1) Organes génitaux externes non différenciés Dans les premiers temps de l’embryogenèse, les cellules issues de la couche mésenchymateuses migrent vers la membrane cloacale et forment alors deux replis qui, en fusionnant ventralement délimitent le tubercule génital. Au fur et à mesure du développement embryonnaire, la membrane cloacale est subdivisée en une membrane anale et une membrane urogénitale. Ces membranes 40 disparaissent ensuite et une communication se crée entre l’extérieur et le tractus urogénital ainsi qu’avec le rectum [McGEADY et al. (2006)]. L’urètre se forme par la multiplication de cellules issues de l’endoderme au sein du tissu mésodermique. Une prolifération de cellules mésodermiques forme un tubercule génital et deux replis génitaux [McGEADY et al. (2006)]. Figure 17: Organes génitaux externes non différenciés [McGEADY et al. (2006)] 2) Différenciation des organes génitaux externes a) Chez le mâle Le tubercule génital s’allonge rapidement en direction ventro-craniale et les deux replis génitaux fusionnent pour former un conduit : l’urètre pénien. Cependant cet urètre ne débouche pas à l’extrémité du pénis. L’abouchement à l’extérieur se fait par invagination de l’ectoderme de l’apex pénien qui va ensuite fusionner avec l’urètre précédemment mis en place. Le scrotum dérive de deux crêtes qui fusionnent au niveau du raphé scrotal. Sa position diffère suivant l’espèce depuis une position sous anale à une position inguinale [McGEADY et al. (2006)]. 41 Figure 18: Différenciation des organes génitaux externes mâles [MacGEADY et al. (2006)] Figure 19: Formation de l’urètre [McGEADY et al. (2006)] 42 Figure 20: Abouchement de l’urètre pénien à l’extrémité du pénis [MacGEADY et al. (2006)] b) Chez la femelle Le vestibule du vagin dérive du sinus urogénital. Les deux replis génitaux ne fusionnent pas contrairement au mâle. Ils forment alors les lèvres de la vulve. Le tubercule génital qui se situe sur le plancher du vestibule se différencie en clitoris à l’endroit où les lèvres vulvaires se rejoignent [McGEADY et al. (2006)]. Figure 21: La différenciation des organes génitaux externes femelles [McGEADY et al. (2006)] 43 G) La mise en place des glandes mammaires Chez les bovins, dès le 30ème jour de gestation, des lignes mammaires se mettent en place à partir de l’aine jusqu’au bourgeon des membres antérieurs. Ces lignes sont dues au développement du mésoderme sous-jacent. Deux crêtes épidermiques, se forment sur ces lignes en arrière de l’ombilic à droite et à gauche. Ces crêtes continuent leur développement et l’épiderme s’insinue dans le mésoderme et forment les bourgeons mammaires. Le mésoderme continue à se développer et un trayon primaire commence à être visible. Une colonne de tissu épidermique se met en place dans le mésoderme, depuis le bout du trayon. Un bulbe se développe sur son extrémité proximale. Vers le quatrième mois de gestation, la colonne se canalise et forme alors le canal du trayon. Le sinus lactifère se développe. Des canaux secondaires partent de celui-ci vers le corps de la mamelle avant de se canaliser à leur tour. L’ostium du canal se kératinise [McGEADY et al. (2006)]. Figure 22: La formation des mamelles [MacGEADY et al. (2006)] 44 Le mésoderme se différencie en glandes lactifères regroupées en acini, en tissu adipeux, en tissu conjonctif et en tissu musculaire pour former le corps de la mamelle. Initialement deux mamelles sont présentes, une à droite et une à gauche du plan médian. Elles fusionnent ensuite médialement [McGEADY et al. (2006)]. Figure 23: Mise en place de l’organisation interne de la mamelle [McGEADY et al. (2006)] 45 46 PARTIE II : LES DIFFERENTES TECHNIQUES PERMETTANT DE MAITRISER LE SEXE DU PRODUIT CHEZ LES BOVINS I) Les observations préliminaires Différentes observations ont été faites sur les critères qui influencent le sexe ratio de la progéniture. A) Influence de la durée entre l’œstrus et la saillie ou l’insémination Certaines études tendent à montrer que la durée séparant l’œstrus de la saillie ou de l’insémination influence le sexe ratio de la progéniture. Ainsi en 1970, VERME et OZOGA cités par RORIE (1999) ont mené une étude sur une population de cerfs. Les biches ayant été saillies précocement après l’œstrus (moins de 36h) ont mis au monde 27,1% de faons mâles (16 pour 59) alors que les faons nés de biches ayant été saillies tardivement après l’œstrus (plus de 36h) sont à 69,7% des mâles. Des expériences ulérieures pour mettre en évidence une influence du moment de saillie ou d’insémination ont été menées sur le bétail. Les résultants ne sont pas aussi clairs. Certaines études concluent à une influence non significative [BALLINGER(1970), FOOTE (1977), JOBST (1998), RORIE (1999) ROELOFS(2006)] alors que d’autres concluent à une influence significative [WEHNER et al (1997), GUTIEREZ ADAN et al (1999)]. Il est donc difficile de conclure en ce qui concerne le bétail [RORIE (1999)]. 47 B) Influence de la technique de synchronisation des chaleurs Xu et BURTON (1999) ont montré que les femelles synchronisées par des protocoles utilisant des prostaglandines et de la progestérone ont tendance à donner naissance à plus de veaux femelles que mâles (P < 0,01). Groupe Nombre de veaux nés Nombre de veaux femelles Génisses synchronisées par protocole progestérone (CIDR) + PGF2a 781 420 (53,8%)a Témoins 737 337(45,7%)b a,b : P < 0,01 Tableau 2: Influence de la synchronisation des chaleurs chez la vache sur le sexe ratio de la progéniture [XU et BURTON (1999)] Ces résultats sont compatibles avec l’hypothèse émise par JAMES en 1992 : chez la femme, un taux élevé de progestérone et de gonadotropines favoriserait la naissance de filles alors qu’un taux élevé en œstrogène et testostérone favoriserait la naissance de garçons. C) Influence de la technique d’insémination ZOBEL et al. (2010) ont montré que la zone de dépose du sperme a une influence sur le sexe ratio de la progéniture. Deux groupes de vaches ont été formés. Pour le premier groupe, la semence est déposée dans le corps de l’utérus (318 vaches). Pour le second groupe, la semence est déposée dans la corne utérine ipsilatérale à l’ovaire porteur du follicule dominant (289 vaches). Le taux de gestation est plus grand dans le premier groupe que dans le second. Le sexe ratio est significativement plus en faveur des mâles dans le premier groupe (23% plus de mâles que de femelles) et en faveur des femelles dans le deuxième groupe (18% plus de femelles que de mâles) avec P < 0,005. D) Influence de la gestion du troupeau Selon SKJERVOLD (1979) cité par GARNER et SEIDEL (2008), la qualité de la gestion du troupeau a une influence sur le sexe ratio de la descendance. Lorsque la gestion du troupeau est de mauvaise qualité, les veaux mâles représentent 49% des naissances. Si la gestion est bonne, les mâles représentent alors 53% des naissances. D’après le même auteur, les vieilles vaches donnent naissance majoritairement à des mâles (53%). 48 E) Influence des techniques de reproduction assistées Ces influences ont été étudiées par IWATA et al. en 2008. Différentes tendances ont pu être mises en évidence : - Lors de fécondation in vitro, une mise en présence courte de l’ovocyte et des spermatozoïdes influe le sexe ratio en faveur des mâles : a Temps de coincubation 1h 5h 18h Proportion d’embryons mâles 64,4%a 67,3%a 52,3 : significativement différent de 50% Tableau 3: Influence du temps de co-incubation sur le sexe ratio des embryons lors de fécondation in vitro [IWATA et al. (2008)] En pratique, les spermatozoïdes sont laissés en présence de l’ovocyte environ 5h afin d’avoir un taux acceptable de polyspermie. - Séparer le cumulus de l’ovocyte entraine un déplacement du sexe ratio en faveur des mâles pour une co-incubation de 5h [IWATA et al. (2008)]. - Effectuer la co-incubation dès l’expulsion du globule polaire favorise le développement d’embryons femelles alors que retarder la co-incubation de l’ovocyte de 8h par rapport à l’expulsion du 1er globule polaire décale le sexe ratio en faveur des mâles [DOMINKO et al. (1997)]. Moment de la co-incubation Nombre d’embryons à deux cellules Nombre d’embryons sexés Nombre d’embryons mâles Nombre d’embryons femelles Ratio mâle/femelle Immédiate 192 (58%) 186 (97%) 61 125 1 : 2a Retardée de 8h 321 (80%) 300 (93%) 206 94 2,2 : 1b Significativement plus petit (a) ou plus grand (b) que 1 : 1 Tableau 4: Influence du moment de mise en présence de l’ovocyte avec la semence par rapport à l’expulsion du premier globule polaire [DOMINKO et al. (1997)] Ces résultats sont compatibles avec ceux de GUTIEREZ-ADAN et al (1999). 49 II) Le sexage de la semence A) Techniques Les spermatozoïdes X et Y diffèrent non seulement par le chromosome sexuel qu’ils contiennent mais aussi potentiellement par d’autres critères : la quantité d’ADN, le volume de la tête et les protéines de surface [CHASTANT-MAILLARD(2004)]. 1) La cytométrie de flux a) Le principe C’est la méthode utilisée actuellement pour la production de paillettes sexées. Son fonctionnement est basé sur le fait que les spermatozoïdes X des bovins contiennent environ 3,8% de quantité d’ADN en plus par rapport aux spermatozoïdes Y. Après récolte, les spermatozoïdes sont incubés pendant une heure dans un colorant spécifique de l’ADN, le Hoechst 33342. Ce colorant traverse la membrane nucléaire et se fixe au niveau des paires adénine-thymine [PETERS (2004)]. Soumis à un rayonnement ultraviolet, le colorant émet une fluorescence bleue. Les spermatozoïdes X, contenant plus d’ADN, le nombre de paires adéninethymine est plus grand et la fluorescence attendue est donc supérieure à celle des spermatozoïdes Y. Les spermatozoïdes marqués sont ensuite injectés dans une gaine sous pression et sont acheminés vers une fine aiguille, d’un diamètre tel qu’ils progressent alors en file indienne. Chaque spermatozoïde passe alors au travers d’un faisceau laser à forte énergie et l’intensité de la fluorescence qu’il émet est mesurée par un détecteur puis analysée par un ordinateur [CHASTANT-MAILLARD (2004) ; SEIDEL (2007)]. A la sortie du cytomètre, après lecture, la vibration d’un cristal piézoélectrique permet la formation de fines gouttelettes au rythme de 70 000 à 80 000 gouttes/sec. Un tiers d’entre elles contient un gamète. Cette gouttelette est ensuite soumise à une impulsion électrique et se retrouve chargée positivement ou négativement selon qu’elle contient respectivement un spermatozoïde Y ou X. Si le type n’a pas pu être déterminé, la gouttelette ne reçoit pas de charge. Les gouttelettes passent enfin entre deux électrodes qui attirent les gouttes de charge opposée et assurent le tri. Les gouttelettes non chargées ne sont pas attirées par les électrodes et sont éliminées [CHASTANT-MAILLARD (2004)]. 50 Figure 24: Schéma du montage de sexage de la semence par cytométrie du flux [SEIDEL(2007)] 51 Figure 25: Montage [SEIDEL(2002)] b) Intérêt et limites du sexage de la semence par cytométrie de flux i) Fiabilité du résultat NB : nous appellerons « pureté de la semence » le pourcentage de spermatozoïdes correctement sexés dans la semence finale. SEIDEL (2007) estime que seuls 40% à 50% des spermatozoïdes de l’éjaculat total sont sexables. Les 50% à 60% restant sont rejetés. L’efficacité du processus sur les spermatozoïdes effectivement sexés est de 90% [JOHNSON et WELCH (1999), SEIDEL (2007)]. Le problème majeur en pratique n’est pas d’obtenir une semence finale parfaitement triée mais plutôt d’obtenir assez de spermatozoïdes pour produire une paillette d’insémination. De plus, plus la vitesse de tri augmente, plus la pureté de la semence finale diminue : Vitesse de tri des spermatozoïdes 9x106 10,8x 106 12,6x106 14,4x106 16,2x106 18x106 84 86 81 80 78 73 (spz/heure) Pureté de la semence sexée X (%) Tableau 5 : Influence de la vitesse de tri sur la pureté de la semence [JOHNSON et WELCH (1999)] 52 La plupart des erreurs qui se produisent pendant le tri vient d’une mauvaise lecture de la fluorescence du spermatozoïde du fait de la position de celui-ci ou du fait des caractéristiques même des courbes de fluorescence des spermatozoïdes X et Y (voir graphique ci-après): Figure 26: Analyse par l’ordinateur de la fluorescence émise : sexage du spermatozoïde en fonction de l’intensité de la fluorescence enregistrée. [SEIDEL(2002)] Ce graphique montre bien la zone dans laquelle la fluorescence lue ne peut être interprétée par l’ordinateur du montage. Cette zone est donc source d’erreur dans la séparation entre spermatozoïdes Y et spermatozoïdes X. ii) Influence sur la qualité de la semence Les multiples manipulations que subissent les spermatozoïdes entraînent une mortalité élevée de ceuxci. La plus grande perte de viabilité a lieu lors de l’utilisation du Hoechst 33342. La mortalité due au passage dans le rayon laser est plus faible [GARNER et SUH (2002)]. Les manipulations répétées induisent une capacitation précoce des spermatozoïdes et la formation de radicaux libres, entrainant des altérations de leurs protéines de surface. Seuls 20 à 25% des spermatozoïdes présents dans l’éjaculat initial sont effectivement présents dans les paillettes sexées. En pratique, les cytomètres de 53 flux permettent le sexage de 107 spermatozoïdes/heure pour chaque sexe. Ce rendement ne permet pas la commercialisation de paillettes contenant le nombre classique de spermatozoïdes (20 millions). Les paillettes sexées commercialisées ne contiennent que 2 millions de spermatozoïdes [SEIDEL (2007)]. Cette concentration semble être la limite inférieure pour maintenir un taux de gestation correct [SEIDEL (1997) ; BODMER et al. (2005)]. La faible concentration des paillettes sexées est en partie contrebalancée par l’absence de spermatozoïdes morts lors de la mise sous paillette car ils ont été éliminés lors du tri. Un colorant « alimentaire » est ajouté à la semence. Si la membrane cellulaire du spermatozoïde est intacte, elle ne retient pas le colorant. Cependant, si la membrane est lésée, elle retient le colorant et la fluorescence du matériel génétique est « étouffée » par cette coloration. Le degré de fluorescence ne peut donc pas être lu et le spermatozoïde est déclaré non sexable [SEIDEL (2007)]. En plus de la viabilité, la qualité des spermatozoïdes est également évaluée. On peut visualiser la perte de qualité par des modifications anatomiques, notamment au niveau de l’acrosome : 87,9% des spermatozoïdes sont intègres, les autres présentent des dommages ou même une absence d’acrosome ou une perte de cape acrosomique. [JOHNSON et WELCH (1999)]. L’intégrité membranaire est détériorée lors du sexage ainsi que la fonction mitochondriale du spermatozoïde [CABALLERO et al. (1999) (1)]. Cette étude met également en évidence l’intérêt d’utiliser de la semence de taureaux reconnus très fertiles afin de minorer la perte de qualité de la semence. Plus la concentration en spermatozoïdes initiale est grande et plus la mobilité est grande, plus le sexage par cytométrie de flux est efficace [CABALLERO et al. (1999) (2)]. La haute pression ainsi que le diamètre de l’aiguille ont une influence sur la mobilité des spermatozoïdes. Traitement du sperme Viabilité (%) Mobilité à +30min Mobilité à +2h (%) (%) Taille de Pression l’aiguille (μm) 70 50psi= 3,45bar 30,7+/-1,0 a 70 30psi=2,07bar 100 30psi=2,07bar Sperme non sexé 40,5+/-0,6 a 30,0+/-0,7 a 37 ,3+/-1,2 b 48+/-0,6 b 40,2+/-0,6 b 40+/-1,2 c 47,6+/-0,6 b 37,5+/-0,8 c 39,8+/-1,1 46,4+/-0,7 37,6+/-0,8 Si les lettres a, b, c, en index sont différentes, alors les valeurs sont significativement différents entre elles NB : 1bar=14,51psi Tableau 6:Effets du diamètre de l’aiguille et de la pression sur la semence en sexage par cytométrie de flux [SUH et al. (2005)] 54 Cet effet sur la qualité de la semence a une influence sur les taux de gestation obtenus après insémination : Semence utilisée : Sexée Non sexée Taux de gestation général 49% (67/136) 43% (16/37) Taux de gestation en fonction 30 PSI 50 PSI NA de la pression utilisée pour le 82%(55/67) sexage 18%(12/67) Tableau 7 : Influence de la pression de sortie du cytomètre de flux sur le taux de gestation [SCHENK et al. (2009)] L’association pression-diamètre idéale a été définie pour une pression de 40psi et un diamètre de 70μm. Avec cette configuration, le rendement, l’efficacité du sexage et le taux de gestation final sont les meilleurs [SUH et al. (2005) ; SEIDEL et al. (2002) ; SCHENK et al. (2009)]. iii) Influence sur la fécondation Les études de fécondation in vitro avec du sperme sexé montrent que le taux de clivage suite à la fécondation de l’oocyte est significativement plus faible pour les spermatozoïdes sexés que pour les non sexés (cf. tableau suivant) [ZHANG et al. (2003) ; LU et al. (1999)]. Cependant, le taux de formation de blastocystes est lui encore sujet à discussion. Certaines études laissent penser qu’il est affecté par l’utilisation du sperme sexé [LU et al. (1999)] alors que d’autres n’observent pas de différence significative [ZHANG et al. (2003)]. Taux de formation de Etudes Sperme utilisé Taux de clivage blastocystes (blastocystes/oocytes) Sexé 53,1% a 20,3%c Non sexé 69,7%b 22,3%c Sexé 66%a 16%a Non sexé 76%b 24%b ZHANG et al (2003) LU et al (1999) (a,b :différence significative par χ², P<0,05 ; c : différence non significative) Tableau 8: Influence du sexage par cytométrie de flux de la semence sur les taux de clivage et de formation de blastocystes d’après ZHANG et al. (2003) et LU et al. (1999) 55 SEIDEL (1999) a observé sur une étude portant sur 1000 génisses inséminées en sperme sexé et 370 génisses de contrôle, que le taux de gestation avec du sperme sexé représente de 70% à 90% du taux de gestation obtenu avec du sperme non sexé. Cette étude montre également que le taux de gestation n’est pas significativement différent entre des femelles inséminées avec 1,5 106 ou avec 3,0.106 spermatozoïdes sexés. Il faut noter que les génisses utilisées dans cette étude se trouvent dans un système d’élevage très technique avec une bonne détection des chaleurs, un apport nutritif idéal et des inséminateurs expérimentés [SEIDEL et al. (1999)]. Ces résultats sont compatibles avec ceux obtenus par DEJARNETTE et al. en 2007. Tout problème de gestion de l’élevage pouvant influer sur la fécondité des génisses entraine une chute du taux de gestation général et à fortiori du taux de gestation obtenu avec du sperme sexé. Dans l’étude de SEIDEL (1999), un groupe de génisses à involution utérine imparfaite présente un taux de gestation globalement bas et un faible taux de gestation obtenu avec de la semence sexée. Groupe étudié Semence utilisée Taux de gestation à 30 jours Primipares sans problème d’involution Semence sexée 50% Semence non sexée 65% utérine Primipares avec problème d’involution Semence sexée 33% utérine Semence non sexée 47% Tableau 9: Influence de l’état d’involution utérine sur les taux de gestation réciproquement en semence sexée et non sexée. D’après SEIDEL (1999) iv) Influence de la technique d’insémination La technique d’insémination utilisée n’a pas d’incidence sur le taux de gestation. Il n’y a pas d’intérêt à déposer le sperme dans la corne de l’utérus au lieu du corps. La technique de dépose dans la corne peut même s’avérer délétère car plus compliquée et ayant donc tendance à engendrer des traumatismes de la matrice [SEIDEL (1999)]. 56 v) Influence sur l’embryon Les embryons issus de fécondation par du sperme sexé ne présentent pas plus d’anomalies chromosomiques que les embryons obtenus par du sperme non sexé [GARCIA (2010)]. Anomalie Embryons atteints issus Embryons atteints issus Embryons atteints issus chromosomique de spermatozoïdes X de spermatozoïdes Y de spermatozoïdes non étudiée sexés mosaïcisme 66% 93% 80% poplyploïdie 1,64% 5,62% 6,0% P>0,05 Tableau 10: Les anomalies chromosomiques des embryons obtenus à partir de sperme sexé [GARCIA (2010)] Il est intéressant de remarquer que le mosaïcisme est répandu chez tous les embryons, issus de sperme sexé ou non. vi) Influence sur le veau Toutes les études montrent que les veaux issus de semence sexée ne présentent aucune malformation et ne diffèrent pas des veaux nés de semence non sexée [SEIDEL et al. (2002) ; TUBMAN et al. (2007)]. Durée Semence Poids Sexe du Nombre moyenne Morts moyen à la veau d’individus de néonatales naissance gestation Sexée1 Male 59 281,0+/- (kg) 2 (3,4%) 0,72 Sexée1 Femelle 64 280,3+/- Mâle 48 280,1+/- 6 (9,4%) Femelle 34 280+/-0,70 avant moyen au sevrage sevrage 3 (5,1%) 267+/-3,4a 30,6+/- 8 (12,5%) 259+/-3,8b 8 (16,7%) 267+/-4,8a 3 (8,8%) 261+/-5,9b 0,63b 4(8,3%) 0,61 Non sexée Poids a 0,65 Non sexée 33,5+/-0,72 morts 34,4+/0,74a 3 (8,8%) 31,2+/0,87b 1 : efficacité du sexage des mâles = 95% ; efficacité du sexage pour les femelles = 97% a,b : différences significatives des poids des veaux mâles et femelles à la naissance et au sevrage Tableau 11: Caractéristiques des veaux nés de semence sexée [SEIDEL et al. (2002)] 57 vii) Influence sur le taux d’avortement DEJARNETTE et al. (2007) ont montré sur un large échantillon que le taux d’avortement des génisses inséminées par du sperme sexé n’est pas significativement différent de celui des génisses inséminées par du sperme non sexé (respectivement 1,4% et 1,9%). viii) L’impact de la congélation Il faut cependant noter que dans les conditions de terrain, les paillettes sont congelées, ce qui entraîne une baisse de qualité de la semence [CHASTANT-MAILLARD (2004) ; SCHENK et al. (2009), CARVALHO (2010)]. Cette diminution de la qualité et de la viabilité du sperme après la congélation se retrouve également pour le sperme non sexé mais elle est plus importante pour le sperme sexé. Sperme Non Mobilité Morphologie (%) normale (%) Têtes agglutinées (%) Spermatozoïde Capacitation Membrane vivant à (%) intacte (%) acrosome intact Chromatine intacte(%) (%) 70,4 92,8 2,6 30,5 65,9 61,0 98,7 Sexé X 37,1 94,9 27,2 34,7 39,6 37,8 98,7 Sexé Y 43,4 93,5 25,1 32,4 41,3 40,4 98,5 sexé Tableau 12: Influence de la congélation sur la qualité du sperme sexé et non sexé [CARVALHO (2010)] Temps entre collecte et Viabilité (%) Mobilité (%) 8,5 43 44,6 15,5 42 42,4 32,5 35,1 42,3 37,5 32,6 36,4 congélation (h) Tableau 13: Influence du temps entre la collecte et la congélation sur la viabilité et la mobilité des spermatozoïdes sexés [SCHENK et al. (2009)] 58 Cette perte de viabilité en cas d’attente entre récolte et congélation pose des problèmes logistiques au niveau des centres de reproduction. En effet, il faut que la semence soit sexée rapidement après récolte mais il existe peu de centres de sexage. L’acheminement doit donc être très rapide. Quelques fois, c’est le taureau lui-même qui est envoyé au centre disposant de la technique. ix) Le coût Le matériel nécessaire au sexage est onéreux : environ 350 000 US$. A ceci s’ajoutent les charges d’entretien et de maintenance. Il faut ajouter à cela les frais de formation du personnel. Cela entraine un surcoût pour l’éleveur lors de l’achat des paillettes (Cf. Partie III Discussion). 2) Autres techniques envisagées a) Association anticorps/protéine de surface La technique de tri par cytométrie de flux permet la séparation des spermatozoïdes X et Y après lecture individuelle de l’intensité de la fluorescence. La lecture se faisant spermatozoïde par spermatozoïde, le rendement est faible. Pour améliorer la vitesse de sexage, des recherches ont été menées pour trouver s’il existait des protéines de surface spécifiques des spermatozoïdes Y ou des spermatozoïdes X. Si de telles protéines existent, alors on peut imaginer la mise au point d’anticorps contre ses protéines, qui permettraient la sélection rapide des gamètes d’un même genre dans un échantillon donné [CHASTANT-MAILLARD (2004)]. i) Les antigènes H-Y En 1993, HENDRIKSEN étudie la présence d’antigènes H-Y sur la membrane des spermatozoïdes, via l’utilisation d’anticorps anti H-Y. L’antigène H-Y a été décrit par EICHWALD et SILMER en 1955 [AVERY et SCHMIDT (1989) (2)] et est exprimé uniquement sur la membrane des cellules d’individus mâles. Il est exprimé dès les plus jeunes stades embryonnaires [GARDON et al. (2004)]. HENDRIKSEN a étudié la répartition de ces antigènes à la surface des spermatozoïdes X et Y pour savoir si ces protéines sont ou non exprimées préférentiellement par les spermatozoïdes Y. Les résultats obtenus montrent que les anticorps se lient à environ 20% à 50% des spermatozoïdes, qu’ils 59 soient X ou Y. Ils ne semblent donc pas être utilisables pour sexer la semence [HENDRIKSEN et al. (1993)]. ii) Les protéines spécifiques (SSP) Une expérience effectuée par BLECHER et al. (1999) tend à montrer l’existence de protéines spécifiques des spermatozoïdes porteurs du chromosome Y et des spermatozoïdes porteurs du chromosome X. Les hypothèses de départ de l’équipe sont les suivantes : Les chromosomes sexuels codent pour des protéines spécifiques (SSP) qui sont exprimées à la surface des cellules somatiques et germinales. Ces protéines sont hautement conservées au cours de l’évolution. Cela implique que deux individus de même sexe mais d’espèces différentes reconnaissent leurs SSP comme du « soi ». Les protéines non SSP ne sont pas reconnues et il y a production d’anticorps anti-nonSSP (AcNSSP). L’expérience utilise différents sérums comme décrits ci après : Receveurs Lapin femelle Structures implantées en Nom donné Anticorps supposés Nom donné Anticorps sous cutanée Membranes au sérum de Lapin mâle cellules α présents au sérum AcNSSP+AcSSPm δ supposés présents AcNSSP fœtales bovines mâles Membrane de cellules β γ AcNSSP+AcSSPf AcSSPm+AcNSSP δ AcSSPf+AcNSSP AcNSSP fœtales bovines femelles Membranes de ε spermatozoïdes bovins non sexé AcNSSP=Anticorps anti protéines Non SSP AcSSPm=anticorps anti protéine SSP mâle AcSSPf= anticorps anti protéine SSP femelle Tableau 14: Différents sérums mis au point pour l’expérience d’après BLECHER et al. (1999) 60 1ère phase Des chromatographies sur colonne sont réalisées en utilisant les immunoglobulines contenues dans les sérums β et δ comme ligands. On introduit ensuite la solution de protéines membranaires de cellules fœtales bovines. Cette opération permet la récupération des phases non liées contenant les hypothétiques SSPm et SSPf. Les phases non liées obtenues sont purifiées et les protéines qu’elles contiennent sont séparées en fonction de leur taille. L’analyse par électrophorèse montre alors que deux types distincts de protéines sont obtenus. Ces deux types de protéines peuvent correspondre aux SSPm et SSPf. 2ème phase L’étape suivante est la purification des SSP mâle et des SSP femelle supposées présentes dans les membranes des cellules germinales. Pour cela on utilise également la chromatographie sur colonne. Une solution de membranes de spermatozoïdes non sexés est introduite dans deux colonnes, « anti-X» et « anti-Y», les anticorps provenant respectivement des sérums ε et δ servant de ligands. La fraction non liée récupérée après le premier passage est introduite dans l’autre colonne. Après ces deux passages, les fractions non liée récupérée sont supposées contenir les protéines SSPm et SSPf. Ces phases finales non liées sont purifiées et analysées par électrophorèse. 61 FRACTION LIEE : NSSP Figure 27: Principe de l’isolement des SSP à partir de protéines de spermatozoïdes non sexés (phase 2) d’après BLECHER et al. (1999) 62 Résultats préliminaires Les protéines obtenues dans ces deux phases montrent des profils d’électrophorèse identiques. L’existence de protéines spécifiques du genre mâle et du genre femelle présentes sur les membranes des cellules germinales et somatiques (phase 1 et phase 2) est confirmée. Ces protéines ont été conservées au cours de l’évolution car reconnues comme du Soi par des individus d’espèces différentes (Phase 1). Leur existence implique une transcription post méiose et qu’elles ne passent pas par les ponts cytoplasmiques présents au stade spermatide. 3ème phase Du sperme non sexé de bovin est mis en présence de sérum γ (anti SSPf et anti NSSP) et mis à incuber. Environ 50% des spermatozoïdes déposés s’agglutinent. Les spermatozoïdes non agglutinés sont récupérés par aspiration à l’aiguille de verre. Les spermatozoïdes ainsi récupérés sont utilisés pour la fécondation in vitro d’ovocytes. Les blastocystes résultant de la fécondation sont récupérés après 7 jours de développement et sexés. (Cf. Deuxième partie, III) Aucune agglutination n’est observée sur les spermatozoïdes mis à incuber avec du sérum α (anti SSPm et anti NSSP) Résultats : Embryons Embryons mâles obtenus femelles Non sexables nb % Nb % nb 70 92 6 8 30 16 66 8 34 5 135 47 150 53 10 avec du sperme traité au sérum γ puis sexés par caryotypage Embryons contrôle sexés par caryotypage Embryons contrôle sexés par PCR Tableau 15: Résultats des embryons obtenus par fécondation avec de la semence sexée par antisérum femelle d’après BLECHER et al. (1999) 63 On peut voir une augmentation du rapport embryons mâles/embryons femelles avec l’utilisation du sperme traité par le sérum anti SSPf. Cette expérience est en faveur de l’existence de protéines spécifiques des spermatozoïdes X. Cette nouvelle approche est prometteuse mais son application pratique n’est pas encore au point [HEINDRIKSEN (1999)]. b) Tri morphologique La quantité d’ADN contenue dans un spermatozoïde X étant plus grande que celle contenue dans un spermatozoïde Y, le volume de sa tête est plus grand. VAN MUNSTER et al. (1999) a mis en évidence une différence de taille de la tête du spermatozoïde par mesure optique. Les résultats de cette étude mettent en évidence une différence de volume de 5,9% en faveur du spermatozoïde X. Par régression linéaire, VAN MUNSTER estime que cette différence de taille pourrait théoriquement permettre une pureté des paillettes ainsi sexées de l’ordre de 80%. Cependant, aucune technique n’a encore été mise au point dans ce domaine [CHASTANT-MAILLARD (2004)]. c) Autres D’autres techniques ont été essayées sans ou avec peu de succès : Sexage par gradient de Percoll [IWAKASI et al. (1988) ; UPRETI et al. (1988) KABAYASHI et al. (2004)], répartition par gradient d’albumine, électrophorèse, centrifugation [GLEDHILL (1988)] … La seule méthode aujourd’hui efficace est la cytométrie de flux dont nous avons étudié les avantages et inconvénients. 64 III) Le sexage de l’embryon A) Les étapes préliminaires Le sexage de l’embryon, quelque soit la méthode employée commence par quelques étapes préliminaires. La première consiste à sélectionner les embryons parmi ceux produits. Seuls les embryons de plus haut grades sont retenus afin d’assurer une qualité maximale à la procédure. L’étape suivante est la récupération de cellules embryonnaires. Différentes techniques sont possibles. - Par section : l’embryon est coupé en deux parties grâce à un micro bistouri. Quelques cellules sont alors prélevées sur l’une des deux moitiés obtenues. Ces deux hémi-embryons peuvent alors être transférés, individuellement ou les deux en même temps dans une receveuse. -Par aspiration : une ou plusieurs cellules sont aspirées après avoir retiré une portion de la membrane pellucide. - Par biopsie : une petite quantité de cellules est retirée de l’embryon grâce à une aiguille. Figure 28 : Stade de développement de l’embryon [Datation : TAINTURIER, BENCHARIF, BRIAND(2006), Image : BALAS source internet] 65 B) Sexage par caryotypage 1) Le caryotypage historique a) La technique Cette technique est celle de référence car elle permet de visionner directement les chromosomes sexuels. La technique suppose d’avoir des cellules en mitose, ce qui est théoriquement le cas dans les embryons à tester. Les cellules en mitose sont bloquées en métaphase grâce à la colchicine. Cette substance bloque le fuseau de division et empêche ainsi la poursuite de la mitose. L’étape suivante est un choc hypotonique réalisé à l’aide d’alcool et de l’acide acétique. Sous la pression osmotique, les cellules gonflent et les chromosomes s’étalent. Ils sont ensuite marqués selon différentes techniques. La coloration au GIEMSA permet une coloration totale et homogène de tous les chromosomes. Ils ne sont plus reconnaissables entre eux que par leur forme et leur taille, ce qui peut être insuffisant pour établir le caryotype. Pour pouvoir les reconnaitre les uns des autres, on applique la technique du « banding » qui permet la coloration spécifique de zone de chromatine. Les chromosomes homologues sont alors plus facilement reconnaissables. On peut ainsi utiliser la trypsine (banding-G), la chaleur (banding-R) ou encore le sulfate de baryum (banding-C) ou le nitrate d’argent moins souvent utilisés [Site internet Hôpital Cochin-université Paris5]. Figure 29: Caryotype bovin [www.cytogenetique.envt.fr] 66 L’équipe de HARE et al. en 1976 et celle de WINTERBERGER-TORRES et POPESCU en 1980 ont étudié la possibilité de réaliser le sexage par PCR sur les embryons bovins. Les résultats de leurs études sont résumés dans le tableau suivant : Etude Embryons Embryons sexés avec sexés avec certitude incertitude 34 20 3 11 58,8% 174 104 - - 60% Age des Nombre embryons d’embryon HARE et al. 14 à 15 (1976) jours Embryons non sexés Efficacité WINTERBERGER et POPESCU 13 jours (1980) Tableau 16: Le sexage par caryotypage [HARE et al. (1976) ; WINTERBERGER et POPESCU (1980)] La faible efficacité du sexage est due en grande partie au faible pourcentage de cellules en division. Les taux de gestation obtenus dans ces deux études étaient faibles (21,8% pour HARE et 21% pour WINTENBERGER). Ces faibles taux sont expliqués par la forte mortalité embryonnaire due aux dégâts occasionnés par le sexage sur les embryons, la mauvaise synchronisation de l’œstrus de la donneuse et de la receveuse. b) Les limites de la technique de caryotypage L’inconvénient principal de cette technique est qu’elle est invasive. Il faut prélever assez de blastomères pour obtenir assez des cellules aptes au sexage. En effet, si les mitoses sont présentes dans les embryons, le taux de mitose n’est que de 9% à 6 jours, date de sexage des embryons. 2) Caryotypage associé à l’hybridation in situ (FISH : Fluorescence In Situ Hybridation) La technique de FISH est une technique qui permet de repérer une séquence de nucléotides (ADN monobrin ou ARN) connue. Elle a été étudiée par LEE en 2004 en association avec la technique de caryotypage. Dans cette étude, un blastomère unique est prélevé d’un blastocyste et subit un blocage en métaphase par du sulfate de vinblastine. Il est ensuite mis à incuber avec de la formamide qui dénature les brins d’ADN et des 67 sondes ADN spécifiques des chromosomes Y. Ces sondes sont biotinées. Après rinçage, de l’avidine est ajoutée au milieu réactionnel. Cette molécule se fixe à la biotine. Des anticorps anti-avidine porteurs de groupements fluorescents verts sont introduits. L’ajout d’iodure de propidium, agent intercalant, permet la coloration de l’ensemble des chromosomes en rouge. Les portions d’embryons restant subissent également une incubation dans un milieu réactionnel d’hybridation (formamide, sondes biotinées, iodure de propidium, avidine et anticorps anti-avidine fluorescents). Figure 30: Principe de la fluorescence in situ hybridation (www.lookfordiagnosis.com) L’observation se fait au microscope capable de détecter les fluorescences. Sur le blastomère observé, bloqué en métaphase de mitose par le sulfate de vinblastine, on peut observer directement le chromosome. Y. Si la cellule est n’est pas en métaphase, la fluorescence peut également être observée (notamment en interphase) mais les chromosomes Y ne sont pas visualisables. 68 (A)Noyaux de blastomères supposés « mâles »en interphase. (B)Noyaux de blastomères supposés « mâles » en métaphase (C)Noyaux de blastomères supposés « femelles » en métaphase (D) Noyaux de lymphocyte « mâle » témoins. Figure 31: Lecture de l’hybridation in situ avec une sonde du chromosome Y [LEE et al. (2004)] L’exactitude de la technique d’hybridation in situ sur un petit nombre de blastomères caryotypés a été comparée à l’hybridation in situ du reste de l’embryon. 69 Sexage du blastomère unique Sexage de l’embryon (FISH) Effectif (FISH) Exactitude Fluorescence Pas de fluorescence Mâle 56 55 1 98,2% Femelle 44 3 41 93,2% Total 100 58 42 96,0% Tableau 17: Exactitude du sexage d’un blastomère unique par hybridation in situ par rapport au sexage par hybridation in situ de l’embryon entier [LEE et al. (2004)] On peut voir que l’exactitude totale de la technique mise au point par l’équipe de LEE est bonne (96%). Les faux positifs (3%) peuvent être rapportés à un manque de spécificité de la sonde Y utilisée. Les faux négatifs sont eux à relier à un défaut de sensibilité de la sonde. 70 C) Le sexage immunologique : l’utilisation d’antisérum H-Y L’antigène H-Y est un antigène exprimé uniquement sur la membrane des cellules d’individus mâles. Il a été décrit par EICHWALD et SILMER en 1955 [AVERY et SCHMIDT (1989) (2)]. Il est exprimé dès les plus jeunes stades embryonnaires [GARDON et al. (2004)]. Ces caractéristiques ont été utilisées dans plusieurs études afin d’explorer de possibles méthodes de sexage [HARE et al. (1976), WINTERBERGER TORRES et POPESCU (1980) ; ANDERSON (1987)] Une méthode de sexage développée par GARDON et al. (2004) utilise cette particularité afin de sexer des embryons bovins obtenus par fécondation in vitro (FIV). Elle n’est pas utilisée en pratique et relève encore du domaine expérimental. 1ère phase De l’antisérum H-Y est produit par des injections de cellules spléniques de rats mâles dans la cavité péritonéale de rattes. 2ème phase Des zygotes sont obtenus par fécondation in vitro d’ovocytes récupérés en abattoir. Les embryons sont ensuite cultivés sur une plus ou moins longue période de façon à les diviser en trois catégories : embryons de 4 à 8 cellules, embryons de moins de 32 cellules, embryons de plus de 32 cellules. 3ème phase Les embryons des trois catégories sont ensuite répartis en quatre groupes et cultivés dans des milieux différents : Groupe contrôle : milieu de culture embryonnaire (ECM) +cellules épithéliales de l’oviducte bovin (BOEC) Groupe C’ : ECM+BOEC+ sérum de cobaye (GPS) Groupe HY : ECM+BOEC+antisérum H-Y Groupe C’HY : ECM+BOEC+GPS+ antisérum H-Y Après 24h dans ce milieu, les embryons sont observés puis classés en « affecté » (A) ou « non affecté »(NA) après observation au microscope. Ils sont ensuite sexés par caryotypage. 71 Résultats Réponses à Nombres l’antisérum HY Ratio Sexage par caryotypage mâle/femelle Traitements d’embryons subis testés catégories Affectés (%) Non affecté Mâles (%) Femelles (%) (%) A NA A NA A NA Contrôle 123 15,4a 84,6b 53,8 52,2 46,2 48,0 1,16/1 1,01/1 C’ 123 20,3a 79,7b 53,3 52,8 46,7 47,2 1,14/1 1,11/1 4à8 cellules HY 123 22,0a 78,0b 52,7 55,1 47,3 44,9 1,11/1 1,22/1 C’+HY 124 21,8a 78,2b 55,6 54,3 44,4 45,7 1,25/1 1,18/1 Contrôle 189 14,2a 85,8b 55,0a 53,0a 45,0a 47,0a 1,22/1a 1,12/1a C’ 189 < 32 21,1a 78,9b 56,7a 53,3a 43,3a 46,7a 1,30/1a 1,14/1a Cellules HY 190 21,6a 78,4b 53,6a 53,7a 46,4a 46,3a 1,15/1a 1,16/1a C’+HY 190 58,4c 41,6d 81,9b 22,6c 18,1b 77,4c 4,53/1b 0,29/1c Contrôle 207 28,6a 71,4b 53,4a 52,9a 46,6a 47,1a 1,15/1a 1,12/1a C’ 205 >32 31,8a 68,2b 52,1a 52,1a 47,9a 47,9a 1,09/1a 1,08/1a cellules HY 206 34,0a 66,0b 54,1a 52,1a 45,9a 47,9a 1,18/ 1a 1,08/1a C’+HY 207 59,4c 40,6d 81,7b 24,0c 18,3b 76,0c 4,44/1b 0,31/1c Si les indices (a, b, c) diffèrent, alors les valeurs sont significativement différentes. Tableau 18: Influence des différents traitements utilisant les anticorps H-Y sur le développement [GARDON et al. (2004)] On peut voir que pour les embryons contenant moins de 32 cellules ou plus de 32 cellules, une incubation avec du sérum de cobaye et de l’antisérum H-Y de rat, la croissance embryonnaires des embryons mâles est significativement affectée. Le rapport mâle/femelle tend dans ces deux cas en faveur des embryons femelles. L’antisérum H-Y de rat semble donc bien affecter la croissance des embryons mâles et ce à partir d’un stade embryonnaire contenant plus de 8 cellules. Les embryons contenant entre 4 et 8 cellules ne semblent pas affectés par l’antisérum H-Y. Pourtant, l’expression en surface des cellules des antigènes H-Y a été démontrée [NATALE et al. (2001)]. 72 Il a alors été avancé que l’expression des antigènes H-Y était retardée chez les embryons produits par fécondation in vitro. Ces résultats sont compatibles avec les études précédentes et avec les résultats de l’équipe de RAMALHO et al. (2004) qui en plus ont transféré les embryons obtenus suite au traitement par l’antisérum H-Y sur des vaches receveuses. Les taux de gestation obtenus sont de 71,4% pour les embryons classés comme mâle et de 68,8% pour les embryons classés femelle. La sensibilité finale du sexage après naissance des veaux est de 80,9%. [RAMALHO et al. (2004)]. Figure 32: Morula avant traitement [RAMALHO et al. (2004)] Figure 33: Embryons au stade morula compacte après traitement à l’antisérum H-Y et classé comme mâles [RAMALHO et al. (2004)] 73 Figure 34: Embryons au stade blastocyste après traitement à l’antisérum H-Y et classés comme femelles [RAMALHO et al. (2004)] En conclusion, cette technique de sexage est très prometteuse et présente l’avantage d’être non invasive. D) Le sexage par PCR (Polymerase Chain Reaction) classique La méthode la plus employée aujourd’hui pour sexer un embryon est le sexage par PCR (Polymerase chain reation). Cette méthode consiste à identifier une zone spécifique du génome d’une cellule via une sonde d’acide nucléique complémentaire et à l’amplifier. Dans le cadre du sexage, cette sonde est spécifique d’une portion du chromosome Y. Il en existe de plusieurs types commercialisés. Amorces sens spécifiques du chromosome Y bovin Amorces anti-sens spécifiques du chromosome Y bovin TCC AAT CCC AAA GAA AGG C GAT CAC TAT ACA TAC ACC ACT AGCTATGTGGCATGTGGAT CCTTCCCTGGAAATGTTTAA GTG AGCCAAGAAGTGGATGAAT C TGT CAT CCA CAC AGT CAA AAC C GCT ATG CTA ACA CAA ATT CTG TAAAGCCAGACACAGAGGTC ACTTTTGCTTCTCTTTCCTGC TTC GGGATGAAACTGTGCAT CCCTTCCAGCTGCAGTGTC A GCAGTGCATTTCCTCCTC ATTGCATGTGGAAGAACTGT AG GATCTGTAACTGCAAACCTG GC Tableau 19: Séquences nucléotidiques d’amorces Y spécifiques 74 Sources EKICI et al. (2006) PARK et al. (2000) HIRAMAYA et al. (2004) HIRAMAYA et al. (2004) HIRAMAYA et al. (2004) MACHATI et al. (1993) 1) La polymérisation en chaine Le matériel génétique de la cellule est dénaturé par chauffage à 94°C. Les deux brins homologues se retrouvent alors séparés. Les sondes sont introduites. Elles sont constituées des deux fragments d’ADN complémentaires à la zone nucléique à amplifier. Les sondes s’hybrident alors aux brins d’ADN et l’enzyme ADN polymérase, la TAQ polymérase, entre alors en action. Elle permet l’extension de la sonde en utilisant les nucléotides présents dans le milieu réactionnel. A la fin de ce premier cycle, le fragment d’ADN recherché se trouve dupliqué. Ce cycle est alors recommencé jusqu’à obtention d’une quantité de fragment suffisante pour être utilisée. ADN à analyser Figure 35: Les différentes étapes de la PCR [www.inrp.fr] Lors du sexage, en plus des sondes spécifiques du chromosome Y, des sondes communes aux deux sexes sont utilisées afin de vérifier l’amplification effective du matériel génétique. 75 2) La lecture Le matériel amplifié est récupéré et une électrophorèse est réalisée. La lecture s’effectue sous lumière ultraviolette. Figure 36: représentation schématique de la lecture d’un résultat de sexage par PCR d’après NIBART et THIBIER (1995) 76 3) Intérêts et limites du sexage par PCR a) L’efficacité Dans ce chapitre, nous appellerons efficacité le nombre d’embryons effectivement sexés par rapport au nombre d’embryons testés. i) L’influence de la technique de prélèvement des cellules embryonnaires Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, il existe différentes façons de prélever quelques cellules des embryons. THIBIER et NIBART (1995) ainsi que SHEA (1999) ont étudié l’influence de ses techniques sur l’efficacité du sexage par PCR. Leurs résultats sont résumés dans le tableau suivant : Nombre d’embryons Technique de concernés prélèvement Nombre d’embryons sexés THIBIER SHEA et Efficacité (%) THIBIER SHEA NIBART et THIBIER SHEA NIBART et NIBART Par section 230 1160 188 1098 81 94,7 Par aspiration 1148 145 987 84 86 57,9 Par biopsie 2805 - 2599 - 92 - Tableau 20: Influence de la technique de prélèvement sur l’efficacité du sexage. On peut voir que pour les techniques par section et par aspiration, l’efficacité observée est très différentes d’une étude à l’autre. THIBIER et NIBART (1995) ont étudié deux techniques d’aspiration différentes, l’une sans rinçage au KCl et une avec rinçage. Les efficacités trouvées sont respectivement de 51,0% et 72,3%. La technique d’aspiration sans rinçage est caractérisée par une quantité non négligeable de sexage douteux (18,4%). L’efficacité relevée dans les différentes études est d’environ 90% et plus. LOPEZ et al. (2001): 92% à 94% ; LOPATAROVA et al. (2008): 89,4% à 92% ; THIBIER et NIBART (1995): 95%; LACAZE et al. (2008) : 96% 77 ii) L’influence du nombre de cellules embryonnaires utilisées. La polymérisation en chaine est une technique sensible. Dès 1990, BRADBURY et al. montre que le diagnostic de sexe en employant un unique blastomère est possible. PARK et al. (2001) a étudié l’influence du nombre de cellules embryonnaires utilisées sur l’efficacité du sexage chez les bovins. Nombres de Nombre de cycles Nombres d’embryons Nombres d’embryons blastomères utilisés PCR sexés non sexés 8 20 20 (100%) 0 4 27 26(96,3%) 1 2 53 50(94,3%) 3 1 38 35(92,1) 3 Tableau 21: Influence du nombre de blastomères sur l’efficacité du sexage d’après PARK et al. (2001) Il semble alors que l’efficacité reste bonne même avec un faible nombre de blastomères utilisés (92%). Cette efficacité est en accord avec celle trouvée par HEYMAN et al. quelques années plus tôt (1994). Cette grande efficacité est utilisée dans le clonage bovin afin d’obtenir des clones du sexe désiré. En effet, lors de la dissociation de la morula donneuse, un blastomère est conservé afin de définir son sexe [HEYMAN et al. (1995)]. Une autre étude menée par l’UNCEIA (Union Nationale des Coopératives Agricoles d'Elevage et d'Insémination Artificielle) et MIDATEST montre elle que pour un nombre de cellules biopsiées inférieur à 3, l’efficacité chute à 86,5% [LACAZE et al. (2008)]. Les valeurs d’efficacité pour un nombre plus élevé de cellules biopsiées sont compatibles avec les résultats de PARK et al. Pour permettre une efficacité maximale, LACAZE et al recommande de biopsier au moins 4 cellules embryonnaires. 78 L’influence du stade de développement de l’embryon à tester iii) Chez les bovins, l’implantation de l’embryon après le transfert embryonnaire n’est possible que si le stade morula ou blastocyste est atteint. C’est à dire environ 5 à 7 jours après la fécondation [GUERIN et al. (1996)]. SHEA en 1998 puis LOPATAROVA et al. en 2008 se sont penchés sur l’influence du stade de développement de l’embryon sur l’efficacité du sexage. Nombre d’embryons étudiés Stade SHEA LOPATAROVA Morula 100 2438 Blastocyste 123 1745 Survie après section SHEA LOPATAROVA 100 a (100%) 123 b (100%) - - Nombre d’embryons effectivement sexés SHEA LOPATAROVA 92 2212 (91%)e (92%)c 110 d (89,4%) 1562 (90%)f (a:b ; c:d ; e:f = P>0,05) Tableau 22: Influence du stade de développement de l’embryon sur l’efficacité du sexage par PCR (SHEA (1998) et LOPATAROVA et al. (2008) D’après ces résultats, on peut conclure que le stade de développement des embryons n’a pas d’incidence sur l’efficacité du sexage. 79 b) L’exactitude Dans ce chapitre, nous appellerons exactitude le nombre de veaux dont le sexe à été correctement déterminé par rapport au nombre de veaux total. THIBIER et NIBART (1995) ont étudié l’exactitude de la méthode sur les embryons ayant subi une section et un sexage par PCR. Sexe Veau Veau mâle femelle 38 37 1 97% Sûr 149 2 147 98% Mâle Douteux 1 0 1 0% Femelle Douteux 21 8 13 61% Certitude Nombre Mâle Sûr Femelle déterminé Exactitude Tableau 23: Exactitude du sexage par PCR [THIBIER et NIBART (1995)] On peut voir que pour des diagnostics de sexe définis comme « sûrs », l’exactitude des résultats varie entre 97% et 98%. Cependant, quand le diagnostic n’est pas sûr, l’exactitude est nettement moins bonne (0% et 61%). L’exactitude totale (diagnostics corrects/ veaux nés) est néanmoins bonne avec une valeur de 94%. Lopez et al. trouve des résultats équivalents avec une exactitude globale de 90% à 100% en 2001. 80 c) Les taux de gestation obtenus i) Influence de la manipulation Lors de transfert d’embryon frais sans manipulation, le taux de gestation attendu est compris entre 53% et 69% [LOPEZ et al. (2001); GUERIN et al. (1996)]. Les résultats des taux de gestations obtenus après sexage sont résumés dans le tableau suivant Taux de gestation avec Etude Année THIBIER et NIBART (1995) 1995 48% LOPEZ et al. (2001) 2001 50% à 60% PONSART et al. (2004) 2004 56% LACAZE et a. l(2008) 2005-2006 65% LOPATAROVA et al. (2008) 2008 49% à 57% sexage Tableau 24: Taux de gestation après sexage selon les études ii) Influence de la congélation En routine, la congélation des embryons permet une plus grande souplesse de la mise en place du transfert. Les embryons peuvent être conservés plus longtemps. Le taux de gestation associé au transfert d’embryons congelés varie selon les études de 40,4% à 62,3% [PONSART et al. (2004)]. Ces taux sont inférieurs aux taux de gestation obtenus à partir de transfert d’embryon frais (cf. paragraphe ci-dessus). Lorsque l’on associe congélation et sexage, les taux de gestation sont diminués : 56% pour les embryons frais et 42% pour les embryons congelés [UNCEIA, 1998 cité par LACAZE (2008)]. Cependant, avec l’amélioration des techniques, le taux de gestation obtenus sur embryons sexés et congelés s’améliore et est compris entre 45 et 50% [UNCEIA, 2001 cité par LACAZE (2008)]. Les meilleurs taux de gestation on été obtenus en 2004 avec une étude ayant obtenu 70% de réussite [PONSART et al. (2004)]. 81 iii) Influence de la mère La receveuse influe fortement sur les chances de réussite du transfert. Il faut que l’« âge utérin » de la receveuse soit compatible avec l’âge de l’embryon transféré. Pour cela on synchronise les chaleurs de la receveuse. La parité de la mère est également un facteur majeur. Les taux de gestation suite au transfert d’un embryon sexé sont significativement plus élevés chez les génisses (51,7%) que chez les vaches (26,3%) [LACAZE et al. (2008)]. iv) Influence stade de l’embryon D’après les données de l’UNCEIA [LACAZE et al. (2008)], le taux de gestation n’est pas influencé par le stade de l’embryon au moment du transfert en restant dans les limites physiologiques d’implantation embryonnaire, du stade morula au stade blastocyste. a Stade embryonnaire Effectif Taux de gestation Morula 167 47,3a Jeune blastocyste 39 48,7a Blastocyste 16 62,5a : différence non significative Tableau 25: L’influence du stade de l’embryon au moment du transfert sur le taux de gestation [LACAZE et al. (2008)] v) Influence du nombre de cellules prélevées par biopsie Le taux de gestation ne semble pas atteint par le nombre de cellules retirées à l’embryon au moment de la biopsie. Les données de l’UNCEIA compilées par LACAZE et al. (2008) vont dans ce sens : Nombre de cellules prélevées Effectif Taux de gestation ≤3 26 55,6a 3-7 65 47,8a ≥7 37 62,2a a : différence non significative Tableau 26: L’influence du nombre de cellules prélevées lors de la biopsie sur le taux de gestation [LACAZE et al. (2008)] 82 vi) Influence de la technique de transfert Lorsque la méthode de biopsie utilisée est la micro-section, on se retrouve avec deux hémi embryons transférables. LOPATAROVA et al. (2008) ont étudié l’influence de deux méthodes de transfert de ces hémi embryons. La première méthode consiste à réimplanter les deux hémi embryons dans la même corne utérine (transfert ipsilatéral). La seconde consiste à réimplanter un hémi embryon dans chaque corne (transfert bilatéral). Les résultats obtenus ne montrent pas de différence significative entre les deux méthodes de transfert. Méthode de transfert Nombre d’embryons transférés Nombre de receveuses Nombre de gestante Transfert bilatéral 46 46 26 (56,5%)a Transfert ipsilatéral 41 82 40 (48,8%)a (a : différence non significative) Tableau 27: Influence de la méthode de transfert sur le taux de gestation [LOPATAROVA et al. (2008)] 4) Le sexage par PCR (Polymerase Chain Reaction) sans électrophorèse : une variante de la PCR classique L’étape d’électrophorèse de la procédure PCR classique rallonge le temps de sexage et est propice à une contamination par de l’ADN de l’environnement après amplification. Pour essayer de pallier ce désavantage et pour diminuer le temps de sexage, des techniques de PCR sans électrophorèse ont été mises en place. BREDBACKA (1998) contribue à l’élaboration de cette technique. Pour cela, il utilise un intercalant, le bromure d’éthidium, marqueur fluorescent habituel de l’ADN lors des électrophorèses. Ce marqueur est ajouté au milieu réactionnel de la polymérisation en chaine. Le marquage a donc lieu directement dans le tube réactionnel sans qu’il y ait besoin de l’ouvrir. La lecture s’effectue sous lumière ultraviolette (≈300nm). L’échantillon est considéré comme « mâle » lorsqu’une fluorescence nette est visible. Lorsque aucune fluorescence n’est observée, l’échantillon est considéré comme femelle. Cette méthode ne permet pas de discriminer les tubes « femelle » des tubes dans lesquelles l’amplification n’a pas eu lieu. Cependant, l’exactitude obtenue dans cette étude est comprise entre 92% et 95%. Cette technique a été de nouveau expérimentée par HASLER et al (2002) en utilisant un milieu de PCR sans électrophorèse commercialisé par la firme FINNZYMES. L’exactitude trouvée est compatible avec celles trouvées par BREDBACK et est de 94,4%. 83 a) Le risque de faux positifs du sexage de l’embryon par PCR (polymerase chain reaction) Comme nous l’avons vu précédemment, la PCR est une réaction très sensible. Du fait de cette sensibilité, les résultats peuvent être faussés par la contamination de l’ADN à étudier avec de l’ADN de l’environnement. Ainsi, si des séquences extérieures viennent contaminer le milieu de réaction de la PCR, un échantillon « femelle » peut alors être interprété à tort en « mâle ».La manipulation des milieux réactionnels pré et post amplification doit se faire dans le milieu le plus propre possible [BREDBACKA (1998)]. b) Le risque de faux négatifs lors de sexage de l’embryon par PCR Dans certains cas, l’amplification du matériel génétique ne se fait pas correctement. Pour s’assurer qu’il a effectivement lieu, deux techniques sont employées. La première est de mettre en plus des amorces spécifiques du chromosome Y, des amorces d’ADN somatiques. Si l’amplification a effectivement lieu, la séquence somatique est amplifiée [THIBIER et NIBART (1995) ; SHEA (1999) ; LACAZE et al. (2008) ; MACHAZY et al. (1993)]. La seconde technique est d’amplifier dans les mêmes conditions de l’ADN de lymphocytes de bovins mâles ou femelles qui forme alors le témoin [LOPEZ et al. (2001) ; PARK et al. (2001)]. Lorsque ces témoins sont absents, comme dans la technique de PCR sans électrophorèse, le nombre de faux négatifs (échantillons « mâle » interprétés en « femelle ») augmente. E) Le sexage par la technique LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) 1) Le principe La technique de LAMP, mise au point par NOTOMI et al. en 2000 dérive de la technique de la PCR. Elle se déroule à température constante (environ 65°C) et utilise trois paires d’amorces différentes. La première paire comprend les amorces sens et antisens de la séquence cible. Les deux autres paires correspondent à des séquences extérieures et encadrent la séquence cible. Cette amplification est très spécifique du fait de l’utilisation de 6 amorces. Elle est également rapide car elle permet d’obtenir jusqu’à 109 copies en une heure [NOTOMI et al. (2000)]. Durant les réplications successives, les copies forment des boucles et prennent une conformation en « chou fleur ». Les étapes successives sont détaillées dans le schéma ci-après. Les sondes utilisées sont FIP BIP, F3 et B3. 84 Figure 37: Les étapes de la technique de LAMP [site internet du Journal of Microbiology] 2) La lecture Les différentes réactions qui s’enchaînent pendant la réplication par LAMP entrainent la production d’un coproduit, l’ion pyrophosphate. Cet ion, combiné à un ion métallique bivalent entraine la formation de sels insolubles [HIRAYAMA et al. (2004) ; NORIHINO et al. (2008)]. Ainsi la lecture est facile. Si un précipité se forme, la réaction a eu lieu. A l’ajout d’ion magnésium, le précipité est de couleur blanche [MORI et al. (2001)]. Figure 38: Tube positif et tube négatif après une LAMP [HIRAYAMA et al. (2004)] 85 3) La technique de LAMP appliquée au sexage des embryons bovins HIRAYAMA et al. (2004) étudient les possibilités de sexer les embryons bovins par cette technique. L’ADN de blastomères est prélevé. Deux LAMP sont menées de front sur l’échantillon, l’une utilisant des amorces spécifiques du chromosome Y, l’autre des amorces non spécifiques. Le résultat de la LAMP est considéré comme positif si l’absorbance du précipité est supérieur à 0,1. Si les deux tubes présentent un précipité d’absorbance supérieure à 0,1, l’embryon est considéré comme mâle. Si seul le tube contenant les amorces non spécifiques réagit, l’embryon est considéré comme femelle. Si aucun des deux tubes n’est positif, l’amplification n’a pas eu lieu. Nombre de Nombre Nombre d’échantillons Nombre d’échantillons blastomères prélevés d’embryons avec amplification correctement sexés 1 15 12 (80,0%) 9 (75,0%) 2 28 26 (92,9%) 23 (88,5%) 3 16 13 (81,3% 13 (100%) 4 16 16 (100%) 16 (100%) 5 17 17 (100%) 17 (100%) Tableau 28: Efficacité et exactitude du sexage par la méthode de LAMP [HIRAYAMA et al. (2004)] On peut voir que voir que l’efficacité de la méthode de LAMP est équivalente à la méthode PCR à partir de 2 blastomères. Son exactitude est équivalente à partir de 3 blastomères. Ces résultats en font une bonne alternative à la PCR. 86 F) Les autres techniques envisagées 1) Le sexage par dosage de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) WILLIAMS en 1986 se penche sur l’utilité de la G6PD dans le sexage d’embryon de souris. Cet enzyme est codé par le chromosome X. L’hypothèse de WILLIAMS est que la quantité de G6PD est deux fois plus grande dans les cellules d’embryons femelles que dans les cellules d’embryons mâles. Après dosage et sexage, les embryons sont transférés dans des mères porteuses. 35% (181/516) des gestations sont menées à terme (contrôle=46%). L’exactitude générale de la technique est de 64%. Sexe déterminé par dosage de Taux de naissance Exactitude la G6PD femelle 35% (86/240) 72% (62/86) Mâle 35% (95/269) 57%(54/95) Tableau 29: Sexage par dosage de la glucose-6-phosphate déshydrogénase [WILLIAMS (1986)] 2) La détermination du sexe en fonction de la vitesse de segmentation embryonnaire Les embryons obtenus après superovulation et insémination d’une donneuse sont souvent récupérés à des stades embryonnaires différents alors qu’ils sont récupérés le même jour. Différentes études se sont intéressées à cette évolution non synchrone et ont cherché à savoir si cette vitesse de segmentation embryonnaire était liée au sexe de l’embryon. TSONODA et al. (1985) a suspecté cette relation après avoir transféré sur des souris des embryons préalablement classés suivant le moment d’apparition du blastocœle. Le pourcentage de mâles parmi les souriceaux issus d’embryons « précoces » était plus élevé que pour les souriceaux issus d’embryons « intermédiaires » ou « tardifs » : respectivement 71%, 44%, 20%. Des résultats similaires ont été retrouvés par SELLER et PERKINS-COLE en 1987 toujours chez la souris. ITOH et GOTO (1986) suspectent une relation similaire chez les bovins. AVERY et al. (1989), cherche à mettre en évidence cette relation. 64 embryons sont récupérés à J6 après synchronisation et insémination de donneuses. Les embryons sont ensuite classés en trois groupes : segmentation rapide, intermédiaire ou lente. Les embryons sont ensuite sexés par caryotypage. 87 Classe Sexage Segmentation Segmentation rapide Non sexés Mâles Femelle Segmentation lente intermédiaire Non sexés Mâles Femelles Non sexés Mâles Femelles Effectif 13(59%) 7 2 9 3 8 13 1 8 Sexe ratio - 78% 22% - 27% 73% - 11% 89% Tableau 30: Répartition des embryons mâles et femelles suivant la vitesse de segmentation [AVERY et al. (1989)] Le sexe ratio mâle global (38%) des embryons sexés n’est pas significativement différent de 50%. Le faible nombre d’embryons effectivement sexés est à relier au faible nombre de métaphases observées. Au sein des différentes classes, le ratio mâle/femelle est significativement différent de 38% pour le groupe à segmentation rapide et lente. Au contraire, aucune différence significative n’est mise en évidence pour le groupe intermédiaire. Ces résultats, compatibles avec ceux de TOCHARUS et al. (1997) tendent à montrer que la détermination du sexe est possible par l’observation de la vitesse de segmentation embryonnaire. BREDBACKA et BREDBACKA (1996) modulent cette conclusion. Cette différence de vitesse de développement n’est valable que dans des milieux contenant du glucose. Cette conclusion est partagée par GUITTIEREZ et al. (2001). C’est la concentration en glucose qui entrainerait une inhibition du développement des embryons femelles [GUTTIEREZ et al. (2001), RHEINGANTZ et al. (2002)]. 3) La glucosamine La glucosamine est utilisée dans le métabolise des hexoses par l’enzyme Nacétylglucosamine transférase codé par le chromosome X. Aux premiers stades de développement de l’embryon femelle, certains gènes des deux chromosomes X sont actifs [DE LA FUENTE et al. (1999)], notamment ceux impliqués dans le métabolisme du glucose. L’embryon femelle est donc plus sensible aux modifications carbonnées du milieu. (Cf. paragraphe précédent). L’ajout de glucosamine au milieu de culture des embryons au stade 8 cellules entraine l’arrêt du développement des embryons femelles et une déviation du sexe ratio en faveur des mâles. (70% d’embryons mâles) [KIMURO (2008)]. Ce résultat est réversible si on ajoute au milieu un inhibiteur de la Nacétylglucosamine transférase. Avant le stade 8 cellules, l’ajout de glucosamine inhibe à la fois les embryons mâles et femelles car elle agit sur les cellules du cumulus et n’affectent qu’indirectement le zygote [SUTTONMACDOWALL et al. (2006)]. Une autre explication possible est que les gènes qui permettent son transport ne sont opérationnels qu’à partir de la transition génomique (à partir du stade 8 cellules). 88 IV) Détermination du sexe du fœtus par échographie Si les méthodes de sexage développées précédemment permettent à l’éleveur de décider du sexe du veau, le sexage par échographie ne permet, lui, que de déterminer le sexe du fœtus. Cette méthode est cependant moins coûteuse et est applicable dans les élevages utilisant la monte naturelle. Elle peut être intégrée dans un protocole de suivi de reproduction de troupeau [LEBASTARD (2003)]. A) Technique 1) Phase préparatoire a) Préparation de l’animal La détermination du sexe du fœtus demande plus de temps qu’un simple diagnostic de gestation. Il faut assurer une bonne contention de l’animal afin que le praticien puisse se concentrer sur l’image sans craindre pour sa sécurité. Une contention chimique peut être envisagée [LEBASTARD (2003) ; CROS (2005)]. En cas de nécessité de vidanger le rectum, il faut prendre garde à ne pas manipuler l’utérus. En effet cela risque de modifier la position du fœtus et rendre le sexage impossible. b) Le matériel L’échographe utilisé doit permettre l’obtention d’une image nette avec une définition suffisante pour pouvoir observer les détails de l’anatomie fœtale. Le choix du modèle est à la discrétion de chaque praticien selon ses préférences. Le choix d’une sonde linéaire semble la plus indiquée mais l’utilisation d’une sonde sectorielle n’est pas contre -indiquée. L’utilisation d’une fréquence de 5MHz semble offrir le meilleur compromis entre profondeur d’observation et résolution [LEBASTARD (2003) ; CROS (2005)]. 89 2) Les pré-requis Il est déconseillé de manipuler l’utérus avant l’échographie afin de ne pas faire basculer le fœtus dans le bassin de la mère surtout à partir du troisième mois de gestation [CROS (2005)]. a) Le plan de coupe Une fois la sonde introduite dans le rectum de la vache, il faut repérer l’emplacement du fœtus et surtout le plan de coupe selon lequel il est observé à l’écran. Pour cela, il faut repérer les éléments anatomiques clés : la tête, les membres antérieurs et postérieurs, le cordon ombilical… Trois grands plans de coupe majeurs sont généralement définis, mais en pratique, les plans observés sont souvent intermédiaires. 1 : Coupe longitudinale ou sagittale 2 : Coupe frontale 3 : Coupe transversale Figure 39: LEBASTARD (2003) 90 b) Age du fœtus Il est également intéressant de connaitre approximativement l’âge du fœtus afin de savoir si le fœtus est assez âgé pour être sexé et si oui quels éléments précis de l’anatomie génitale sont à rechercher. Eléments observables Taille du fœtus (mm) Stade de gestation (j) Battements cardiaques 3 20 Ébauches des membres 5-7 25 Ebauches 8-12 30 Doigts reconnaissables 13-17 35 Tubercule génital 17-24 40 Mouvements 23-26 45 Cotes+Début de différenciation 35-45 50 oculaires+colonne vertébrale du tubercule génital Ossification tête et vertèbres 60-70 60 Ossification des membres 140-150 90 250 120 Développement Basculement des dans dents+ la cavité abdominale de la mère Tableau 31: Eléments de détermination de l’âge du fœtus [DESCOTEAUX et al. (2009)] 91 3) Le sexage a) L’anatomie fœtale D’après le tableau précédent, le sexage du fœtus bovin peut se faire à partir du 50 ème jour jusqu’au 120ème jour. Avant le 50ème jour, le sexe du fœtus est indifférencié. Entre le 50ème et le 120ème jour le tubercule génital évolue en pénis ou clitoris. Les structures annexes telles que le scrotum ou encore les mamelles se mettent en place [TAINTURIER (2001) ; DECOTEAUX (2009)]. Figure 40: Développement des organes génitaux externes dans l’espèce bovine [BARONE (2001)] 92 Les différents éléments anatomiques utiles au sexage échographique ont été résumés dans les tableaux ci-après : NB : TG = Tubercule génital scrotum trilobé bourrelets scrotaux échogènes corps du pénis discontinu corps du pénis hyperéchogène et continu extrémité du pénis hyperéchogènre TG juste caudal au cordon ombilical migration du TG 0 20 40 60 80 100 120 140 Figure 41: Visualisation échographique des organes génitaux de l‘embryon mâle en fonction du stade de gestation en jours d’après TAINTURIER (2001) raphé médian échogène et continu bourgeons mammaires hyperéchogènes clitoris à la base de la queue TG à la base de la queue migration du tubercule génital 0 20 40 60 80 100 120 140 Figure 42: Visualisation échographique des organes génitaux de l’embryon femelle en fonction du stade de gestation en jours d’après TAINTURIER (2001) 93 i) Fœtus mâle NB : UCRA= Unité Clinique Rurale de l’Arbresle Figure 43: fœtus mâle de 55 jours, coupe frontale [CROS ; UCRA(2005)] Figure 44: Fœtus mâle de 68 jours, coupe longitudinale [CROS ; UCRA (2005)] Figure 45: fœtus mâle de 83 jours, coupe transversale [CROS ; UCRA(2005)] 94 ii) Fœtus femelle Figure 46: fœtus femelle 56 jours, coupe frontale [CROS ; UCRA(2005)] Figure 47: fœtus femelle 96 jours, coupe transversale, [CROS ; UCRA (2005)] 95 b) Les périodes de sexage. D’après ce que nous avons vu précédemment, on peut définir des périodes où l’examen est plus ou moins facile à interpréter : une période précoce, une période intermédiaire et une période tardive [TAINTURIER (2001) ; LEBASTARD (2003)]. Période Stade de gestation Critères principaux Critères secondaires Fœtus Fœtus Fœtus Fœtus femelle mâle femelle mâle Bourrelets Précoce 55-65 Position relative du Non tubercule génital visualisables scrotaux et corps du pénis Position Intermédiaire 65-80 relative du tubercule Scrotum génital Non visualisables Bourgeons Tardive 80-120 mammaires Absence de scrotum Scrotum Tubercule génital Pénis Tableau 32: Critères majeurs de diagnose du sexe du fœtus en fonction de la période de sexage, d’après [TAINTURIER (2001), LEBASTARD (2003)] 96 B) Intérêts et limites 1) Exactitude Différentes études ont été réalisées sur le sexage des fœtus bovins par échographie. L’exactitude des diagnostics posés varie beaucoup d’une étude à l’autre. Ses différentes valeurs sont répertoriées dans le tableau suivant. Nombre de Etude vaches échographiées Exactitude totale (%) Exactitude des Exactitude des diagnostics diagnostics « sûrs » (%) « douteux » (%) MULLER ET WITTKOWSKI 65 88 94 61 102 96 100 89 Nc 97 Nc Nc 100 81 92 63 127 77 84 48 (1986) CURRAN ET GINTHER O.J (1991) STROUD BK (1996) [TAINTURIER (2001)] CROS (2005) Tableau 33: Exactitudes du sexage échographique obtenues suivants les auteurs Les différences entre les valeurs obtenues peuvent s’expliquer par l’expérience des manipulateurs. STROUD (1996) décrit dans son article que les erreurs deviennent de plus en plus rares au fur et à mesure des examens réalisés. Il explique que l’exactitude de ses diagnostics est bonne du fait de sa grande expérience de l’examen. Au contraire, TAINTURIER (2001) et CROS (2005) interprètent leur exactitude totale relativement faible par leur manque d’expérience en la matière. Il faut également noter que les progrès technologiques dans le domaine des appareils échographiques tendent à améliorer la qualité de l’image obtenue. Les premiers diagnostics effectués notamment par MULLER ET WITTKOWSKI (1986) ont été effectués sur des appareils de moins bonne qualité que pour les autres études. On peut voir que d’une manière générale, les diagnostics « sûrs » ont une exactitude assez élevée, supérieure ou égale à 84% chez tous les manipulateurs. La comparaison des résultats par un test du χ² montre que le sexe du fœtus et le rang de lactation n’ont pas d’influence sur la fiabilité du résultat [CROS (2005); TAINTURIER (2001)]. 97 2) Les risques d’erreur Comme nous venons de le voir, le diagnostic de sexe par échographie est manipulateur-dépendant. Les risques d’erreur d’interprétation de l’image sont nombreux. Les erreurs d’interprétation ont souvent lieu dans les périodes précoces et intermédiaires de sexage. Ces erreurs sont le fruit de confusion entre les structures génitales du fœtus avec d’autres structures fœtales. a) L’interprétation des images i) Les vertèbres coccygiennes Le tractus génital peut être confondu avec les dernières vertèbres coccygiennes. En effet, ces vertèbres peuvent apparaitre à l’image échographique comme une structure hyperéchogène bilobée. Ainsi, si l’extrémité de la queue est placée entre les membres postérieurs du fœtus et que celui-ci est observé selon une coupe frontale, l’extrémité de la queue peut être interprétée à tort comme le tractus génital. Pour éviter cette confusion, il convient d’essayer de visualiser sur la même coupe, à la fois le tubercule génital et l’extrémité de la queue. Si cela s’avère impossible, il faut essayer de faire deux coupes distinctes du fœtus, pour pouvoir affirmer que la structure observée est bien le tractus génital et non pas les vertèbres coccygiennes [TAINTURIER (2001)]. Figure 48: Image échographique d’un fœtus femelle de 67 jours en coupe transversale [TAINTURIER (2001)] 98 Figure 49: Image échographique d’un fœtus femelle de 68 jours en coupe frontale [TAINTURIER (2001)] ii) Le cordon ombilical Les artères ombilicales sont situées en position caudale au niveau de l’implantation du cordon ombilical dans l’abdomen. Bien qu’elles donnent habituellement une image trilobée, elles peuvent être visualisées à l’image échographique comme une structure bilobée hyperéchogène. Il est alors facile de les confondre avec un tubercule génital mâle. Pour affirmer que le fœtus observé est bien de sexe mâle, il faut visualiser à la fois le tubercule génital et le cordon ombilical sur une même coupe frontale [TAINTURIER (2001)]. Figure 50: Coupe transversale d’un fœtus mâle de 63 jours [TAINTURIER (2001)] 99 Figure 51: Coupe frontale d’un fœtus femelle de 67 jours [TAINTURIER (2001)] iii) Le corps du pénis et le raphé médian Ces deux structures peuvent être confondues. Il ne faut pas se fier uniquement à elles pour le diagnostic de sexe. Ces structures ne peuvent être envisagées que comme des éléments de diagnose secondaire [TAINTURIER (2001)]. Il est important de noter que les erreurs précédemment citées n’ont lieu que pendant la période précoce et intermédiaire de sexage. Pendant la période tardive, le diagnostic de sexe se base sur l’observation des bourgeons mammaires ou du scrotum qui sont facilement reconnaissables. b) Les autres facteurs de risques La qualité du diagnostic du sexe fœtal dépend également de nombreux éléments extrinsèques : la position du fœtus, la contention de la mère, la gêne due au rumen maternel… [CROS (2005), TAINTURIER (2001)] 3) L’innocuité Le diagnostic du sexe du fœtus demande une manipulation de l’utérus plus longue que pour un simple diagnostic de gestation. Cette manipulation pourrait augmenter le risque d’avortement. TAINTURIER (2001) et CROS (2005) ont relevé respectivement un taux d’avortement de 2% et 3%. On est donc dans la fourchette haute des taux d’avortement dit « normaux ». 100 PARTIE III : DISCUSSION I) Les intérêts de la gestion du sexe des veaux A) L’accélération de l’amélioration génétique du troupeau 1) Les troupeaux producteurs L’amélioration génétique d’un cheptel, qu’il soit laitier ou allaitant, passe par l’entrée dans le troupeau producteur de nouveaux individus présentant un potentiel génétique supérieur à celui des bêtes déjà présentes. On peut pour cela soit acheter un nouvel animal soit produire soi-même son troupeau de renouvellement. Dans le cas des éleveurs qui produisent et élèvent leurs génisses, le choix du sexe du veau permet une accélération du progrès génétique du troupeau [HOHENBOKEN (1999)]. En effet, dans la gestion d’élevage classique, cette amélioration passe surtout par l’insémination des meilleures bêtes du troupeau par une semence de taureau de bonne qualité. Dans ce cas de figure, seules les génisses sont intéressantes du point de vue génétique pour l’éleveur. L’insémination des bêtes destinées à la production de génisses de renouvellement par de la semence sexée X permet de majorer le nombre de femelles de bonne composante génétique dans la descendance. L’utilisation d’embryons sexés entre dans la même optique en permettant d’assurer la descendance des vaches de hautes valeurs. Le sexage de l’embryon peut être associé à du génotypage et permet alors une grande progression du capital génétique du troupeau. 2) Les sélectionneurs De nombreuses étapes sont nécessaires à la mise sur le marché d’un nouveau taureau reproducteur. La sélection classique se déroule comme telle : un taureau et une vache d’élite possédant de bonnes composantes génétiques sont croisés. Les veaux mâles résultants de cette fécondation sont ensuite testés pour savoir si leurs caractéristiques se retrouvent bien dans la descendance. Pour cela, ces fils sont croisés avec des femelles « courantes ». On étudie alors les qualités bouchères, laitières, de vêlage, etc, d’au moins 50 filles finissant leur première lactation avant de pouvoir juger de la qualité du taureau. [HOHENBOKEN (1999)]. Le croisement entre les parents d’élite est le plus souvent effectué par collecte et transfert d’embryons. Le nombre d’embryons est en moyenne de 3 par récolte. La probabilité qu’il y est au moins un mâle parmi ces embryons est de 0,88. Si on utilise de la semence sexée en Y, pure à 90%, à 101 cette étape, la probabilité d’obtenir au moins un embryon mâle est de 99% [HOHENBOKEN (1999)]. L’intérêt d’utiliser de la semence sexée à cette étape est donc minime. Lors de la phase de testage sur la descendance, il faut en moyenne 6 inséminations en semence non sexée pour obtenir une fille terminant sa première lactation [HOHENBOKEN(1999)]. L’utilisation de semence sexée à cette étape pourrait réduire le nombre d’insémination nécessaire. La vente de semence sexée ou d’embryon sexée permet aux sélectionneurs et aux vendeurs de génétique d’élargir leur gamme en proposant des produits attractifs et recherchés par les éleveurs. Figure 52: Schéma de sélection classique des nouveaux taureaux reproducteurs B) L’augmentation de la productivité 1) En élevage laitier L’apport financier premier des élevages laitiers est le lait et sa transformation. L’utilisation de semence sexée ne permet pas d’influer sur cet aspect mais permet une meilleure valorisation des veaux. En effet, en inséminant les génisses avec de la semence sexée X afin d’assurer la naissance des futures génisses de renouvellement, on peut ensuite inséminer les autres bêtes avec de la semence de race allaitantes [HOHENBOKEN (1999)]. Les veaux croisés sont mieux valorisés sur le marché du veau à engraisser [www.office-elevage.fr]. Il faut cependant modérer cet avantage par les plus nombreuses difficultés de vêlage que l’on rencontre pour les veaux croisés. 102 2) En élevage allaitant Dans les élevages producteurs de bovins à viande, contrairement aux élevages laitiers, le produit recherché est le veau. L’utilisation de semence sexée permet, d’une part d’assurer le renouvellement du troupeau en inséminant les meilleures génisses avec de la semence sexée X. Les autres vaches peuvent alors être inséminées en semence sexée Y, les veaux mâles étant mieux valorisés sur le marché du veau pour engraissement. Attention cependant au surcoût du à la reproduction par insémination artificielle. En effet, un grand nombre d’élevages allaitants fonctionnent actuellement en monte naturelle. C) Une plus grande fluidité dans le processus de renouvellement de l’effectif Connaitre le sexe des fœtus permet une gestion facilité des mouvements d’animaux au sein de l’exploitation, que le sexe ait été décidé ou juste diagnostiqué par échographie. Connaitre le nombre de femelles et de mâles à naitre permet de prévoir les différents achats ou ventes d’animaux et d’établir un plan prévisionnel de gestion d’élevage. On peut ainsi décider à l’avance du nombre de génisses de renouvellement qu’il faudra acheter, du nombre que l’on pourra vendre. La connaissance du sexe du veau permet également d’apporter une valeur ajoutée dans le cadre de la vente d’une vache en cours de gestation. Une vache laitière pleine d’un veau mâle a ainsi moins de valeur qu’une vache laitière pleine d’une femelle. 103 II) Applications pratiques Nous venons de voir les intérêts potentiels que peut attendre l’éleveur d’une gestion d’élevage incluant l’utilisation de techniques de sexage des veaux. Dans cette partie, nous allons nous pencher sur la rentabilité effective de l’utilisation de sperme sexé dans différents type de production. A) Production laitière 1) Elevage Prim’Holstein Nous allons étudier le cas d’un élevage hypothétique de 100 têtes caractérisé comme suit : - 80 vaches et 20 génisses mises à la reproduction - Vaches nséminées jusqu’à 6 fois pour obtenir une gestation, génisses jusqu’à 5 fois - Taux de renouvellement= 20%, - L’éleveur produit lui-même ses génisses de renouvellement (20 par an) - Les génisses retenues pour le renouvellement sont les filles des meilleures vaches et ont une génétique meilleure que le reste du troupeau - Taux de d’avortement moyen = 1,7% (cf. : Deuxième partie, II, 1)b)vi)) - Reproduction en insémination artificielle sur l’ensemble du troupeau - Prix de vente des veaux pour l’engraissement [www.office-elevage.fr ; cotation, semaine du 06/12/2010] - o mâle pur 45-50kg=84€ o femelle pure 45-50kg= 48€ o mâle croisé viande =298,5€ o femelle croisée viande =260,5€ Tous les veaux sont vendus en veaux d’engraissement a) Elevage traditionnel=Elevage Holstein : 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein (Annexe1) - insémination en semence non sexée sur chaleurs observées. - Coût moyen d’une dose de semence Holstein non sexée : 21€ [Prix moyens issus de catalogues en ligne] - Taux de gestation sur insémination artificielle des vaches = 37% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] 104 - Taux de gestation sur insémination artificielle sur les génisses= 58% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] Animaux Vaches génisses Semence utilisée Non sexée Non sexée Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants Nombre total d’IA Veaux nés Veaux Veaux mâles femelles 80 75 203 74 37 37 20 20 34 20 10 10 Veaux commerci alisés 37M + 27F 10M Génisses de renouvell ement 10 10 NB : IA=Insémination artificielle Tableau 34: Elevage Holstein: 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein (Annexe 1) Au final, l’éleveur produit donc 38 mâles et 26 femelles pour l’engraissement. Le troupeau de génisses de renouvellement est composé de 10 génisses de bon niveau génétique (issues des génisses mises à la reproduction) et 10 génisses de niveau génétique moyen (issus des vaches). Seul 50% du troupeau de renouvellement est amélioré génétiquement. Entrées (€) Commercialisation des veaux 5244 4977 Doses de semences Total Sorties (€) +267 Tableau 35: Bilan économique de la saison de reproduction d’un élevage Holstein : 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein (Annexe 2) b) Elevage Holstein : insémination en semence sexée X sur les génisses et en semence Holstein non sexée sur les vaches (Annexe 2) - Insémination en semence non sexée sur chaleurs observées chez les vaches. - Insémination en semence sexée X sur chaleurs observées sur les génisses - Coût moyen d’une dose de semence Holstein sexée : 42€ [catalogues de semence en ligne] 105 - Coût moyen d’une dose de semence Holstein non sexée : 21€ [catalogues de semence en ligne] - Taux de gestation sur insémination artificielle non sexée des vaches = 37% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Taux de gestation sur insémination artificielle sexée sur les génisses= 50% [SEIDEL (1999)] - Sexe ratio mâle femelle par IA de sperme sexé : 10/90(cf. Deuxième Partie, II)A)1)B)i)) - Surcoût journalier d’élevage d’une génisse non fécondée =0,6€/jour [ARZUL (2006) (2)] Animaux Vaches Génisses Semence utilisée Non sexée Sexée X Nb d’ani- Nb d’ani- maux maux inséminés gestants 80 75 203 74 37 37 20 19 39 19 2 17 Nombre total d’IA Veaux nés Veaux Veaux mâles femelles Veaux commercialisés 37M + 34F 2M Génisses de renouvellement 3 17 Tableau 36: Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence Holstein non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 2) Au final, on obtient un troupeau de génisses de renouvellement composé à 85% de génisses ayant un potentiel génétique de bonne qualité. L’amélioration génétique est donc plus rapide que celle d’un troupeau traditionnel. Entrées (€) Commercialisation des veaux 4899,6 5901 Doses de semences Surcoût d’élevage Sorties (€) des 63 génisses Total -1064,4 Tableau 37: Bilan économique de la saison de reproduction, Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence Holstein non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 2) Le bilan financier de la saison de reproduction est largement déficitaire par rapport à celui du troupeau traditionnel. Ce surcoût s’explique non seulement par un coût plus élevé des doses de semences sexées 106 mais surtout par le plus grand nombre de doses nécessaires. A ceci s’ajoute le coût d’élevage des génisses qui tardent à être gestantes. Cette gestion d’élevage ne semble donc pas être appropriée en troupeau laitier Holstein. c) Elevage Holstein composé de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et de 20 génisses inséminées en semence sexée X Holstein - Insémination en semence non sexée sur chaleurs observées pour les vaches en utilisant de la semence de race à viande - Insémination en semence sexée X sur les génisses sur chaleurs observées. - Coût moyen d’une dose de semence Holstein sexée : 42€ [prix moyen observés sur les catalogues] - Coût moyen d’une dose de semence charolaise non sexée : 28€ [prix moyen observé sur les catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle des vaches = 37% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Taux de gestation sur insémination artificielle sur les génisses= 58% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Pureté des paillettes sexées X: 90% (Partie II, II)A)1)b)i) - Surcoût journalier d’élevage d’une génisse non fécondée : 0,6€/jour [ARZUL (2006) (2)] Animaux Vaches Semence utilisée Non Nb d’ani- Nb d’ani- maux maux inséminés gestants 80 75 Nombre Veaux Veaux Veaux total d’IA nés mâles femelles 203 74 37 37 sexée Génisses Sexée Veaux commerc ialisés Génisses de renouvellement 37M + 0 37F 20 19 39 19 2 17 2M 17 Tableau 38: Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence charolaise non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 3) On a donc a la fin de la saison, 17 génisses de renouvellement de bonne génétique. Cet effectif est insuffisant pour assurer le renouvellement complet. Il faut donc acquérir à l’extérieur trois génisses supplémentaires. 107 Entrées (€) Commercialisation des veaux 20832,5 5901 Doses de semences Surcoût d’élevage Sorties (€) des 63 génisses Total +14868,5 Tableau 39: Bilan économique de la saison de reproduction, Elevage Holstein: 80 vaches inséminées en semence charolaise non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X (Annexe 3) On voit ici que grâce à la valorisation des veaux croisés, le bilan financier semble beaucoup plus favorable. Il permet de plus de couvrir les frais de rachat des trois génisses manquantes (Environ 1000€ *3). Il convient de modérer ce résultat par la difficulté accrue que peuvent représenter des vêlages de veaux croisés (extractions forcées, césariennes). De plus, au lieu de l’insémination, l’éleveur peut choisir d’introduire dans son élevage un taureau à viande, plus facile à gérer qu’un taureau Holstein, ce qui permet une réduction des coûts de reproduction sur le long terme pour ses vaches. Cette solution peut être intéressante surtout dans un élevage Holstein dans lequel on trouve fréquemment de nombreuses chaleurs non exprimées. Conclusion : pour un élevage Holstein caractérisé par un déficit reproductif des vaches et un prix très bas de revente des veaux, l’intérêt de l’utilisation de semence sexée n’est viable pour l’élevage que dans le cadre de valorisation des veaux en veaux croisés. 108 2) Elevage Montbéliard Nous allons étudier le cas d’un élevage hypothétique de 100 têtes caractérisé comme suit : - 80 vaches et 20 génisses mises à la reproduction - Vaches inséminées jusqu’à 6 fois pour obtenir une gestation, génisses jusqu’à 5 fois - Taux de renouvellement= 20%, - L’éleveur produit lui-même ses génisses de renouvellement (20 par an) - Les génisses retenues pour le renouvellement sont les filles des meilleures vaches et ont une génétique meilleure que le reste du troupeau - Taux moyen d’avortement =1,7% (cf. Deuxième partie, II)A) 1)b)vi)) - Reproduction en insémination artificielle sur l’ensemble du troupeau - Prix de vente des veaux [www.office-elevage.fr ; cotation semaine du 06/12/2010] - o mâle (ou femelle) pur 45-50kg=108€ o mâle croisé viande =298,5€ o femelle croisée viande =260,5€ Tous les veaux sont vendus en veaux d’engraissement a) Elevage Montbéliard composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées avec de la semence Montbéliarde non sexée (Annexe 4) - Insémination en semence non sexée montbéliarde sur chaleurs observées pour les vaches et génisses - Coût moyen d’une dose de semence montbéliarde non sexée : 20€ [Prix moyen des catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle des vaches = 54% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Taux de gestation sur insémination artificielle sur les génisses= 60% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] 109 Animaux Vaches Semence utilisée Non Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants- 80 79 Nombre total d’IA 147 Veaux nés 78 Veaux Veaux mâles femelles 39 39 sexée Génisses Veaux commerci alisés Génisses de renouvellement 39M + 10 29F Non 20 20 33 20 10 10 10M 10 sexée Tableau 40: Elevage Montbéliard avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Montbéliarde non sexée (Annexe 4) Entrées (€) Commercialisation des veaux 8424 3600 Doses de semences Total Sorties (€) +4824 Tableau 41: Bilan financier de la saison de reproduction d’un élevage Montbéliard avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Montbéliarde (Annexe 4) On obtient donc un troupeau de renouvellement composé de 10 femelles de bonne génétique et 10 femelles de qualité moyenne. L’éleveur peut ensuite commercialiser 40 mâles et 28 femelles. Son bilan financier est positif. b) Elevage Montbéliard composé de 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et de 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 5) - Insémination en semence non sexée sur chaleurs observées chez les vaches. - Insémination en semence sexée X sur chaleurs observées chez les génisses - Coût moyen d’une dose de semence Montbéliarde non sexée : 20€ [Prix moyen des catalogues] - Coût moyen d’une dose de semence Montbéliarde sexée : 48€ [Prix moyen des catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle non sexée des vaches = 54% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] 110 Taux de gestation sur insémination artificielle sexée sur les génisses= 50% [SEIDEL (1999)] - Sexe ratio mâle femelle par IA de sperme sexé : 10/90(Deuxième partie, II)A)1)b)i)) - Surcoût journalier d’élevage d’une génisse non fécondée= 0,6€/jour [ARZUL (2006) (2)] Animaux Vaches Semence utilisée Non Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants 80 79 Nombre total d’IA 147 Veaux nés 78 Veaux Veaux mâles femelles 39 39 sexée génisses Sexée Veaux commerci alisés Génisses de renouvell ement 39M + 3 36F 20 19 40 19 2 17 2M 17 Tableau 42 Elevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 5) Entrées (€) Commercialisation des veaux 8316 4812 Doses de semences Surcoût d’élevage Sorties (€) des 75,6 génisses Total +3428,4 Tableau 43: Bilan financier de la saison de reproduction d’un élevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 5) Le troupeau de renouvellement est composé de 17 génisses de meilleure qualité que le troupeau initial et 3 génisses de qualité moyenne. Cependant si le bilan génétique est meilleur, le bilan financier est moins bon que dans le cas classique du fait du surcout engendré par l’utilisation de semence sexée plus couteuse. 111 c) Elevage Montbéliard composé de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et de 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde - Insémination en semence non sexée Charolais sur chaleurs observées chez les vaches. - Insémination en semence sexée Montbéliarde sur chaleurs observées chez les génisses - Coût moyen d’une dose de semence Charolais non sexée : 28€ [Prix moyen des catalogues] - Coût moyen d’une dose de semence Montbéliarde sexée : 48€ [Prix moyen des catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle non sexée des vaches = 54% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Taux de gestation sur insémination artificielle sexée sur les génisses= 50% [SEIDEL (1999)] - Sexe ratio mâle femelle par IA de sperme sexé : 10/90(deuxième partie, II)A)1)b)i)) - Surcoût journalier d’élevage d’une génisse non fécondée : 0,6€/jour [ARZUL (2006) (2)] Animaux Vaches Semence utilisée Non Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants 80 79 Nombre total d’IA 147 Veaux nés 78 Veaux Veaux mâles femelles 39 39 sexée Génisses Sexée Veaux commercialisés Génisses de renouvell ement 39M + 0 39F 20 22 39 19 2 17 2M 17 Tableau 44: Elevage Montbéliard composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 6) Entrées (€) Commercialisation des veaux 21997,5 4812 Doses de semences Surcoût d’élevage Sorties (€) des 75,6 génisses Total +17109,9 Tableau 45: Bilan de la saison de reproduction d’un élevage Montbéliard composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde (Annexe 6) 112 Comme dans l’exemple Holstein, cette gestion d’élevage permet une bonne amélioration génétique du troupeau de renouvellement en apportant 17 génisses de bonne génétique. L’achat des 3 génisses manquantes est largement couvert par la vente des veaux pour l’engraissement. Cette gestion d’élevage semble donc être celle la plus rentable du point de vue de la valorisation des veaux. 3) Conclusion L’intérêt génétique de l’utilisation de semence sexée doit être suffisamment important pour l’éleveur pour justifier le surcoût engendré (meilleure lactation, conformation, taux cellulaire….). Pour avoir un bénéfice financier réel, l’utilisation de semence sexée doit être couplée avec l’utilisation de semence de race allaitante. Cependant, les dystocies et les pathologies néonatales sont plus présentes chez les veaux croisés. B) Production allaitante : élevage Charolais Nous allons nous pencher sur l’intérêt de l’utilisation de la semence sexée dans le cadre de la production de veaux en élevage Charolais. Le troupeau que nous allons étudier est défini comme suit : - 80 vaches et 20 génisses mises à la reproduction - Vaches inséminées jusqu’à 6 fois pour obtenir une gestation, génisses jusqu’à 5 fois - Taux de renouvellement= 20%, - L’éleveur produit lui-même ses génisses de renouvellement (20 par an) - Les génisses retenues pour le renouvellement sont les filles des meilleures vaches et ont une génétique meilleure que le reste du troupeau - Taux moyen d’avortement =1,7% (cf. Deuxième partie) II)1)b)vi)) - Reproduction en insémination artificielle sur l’ensemble du troupeau - Prix de vente des veaux pour l’élevage [www.office-elevage.fr ; cotation semaine du 06/12/2010] - o mâle pur =350€ o femelle pure = 322€ Tous les veaux sont vendus en veaux d’élevage 113 1) Elevage Charolais composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Charolaise non sexée (Annexe 7) - insémination en semence non sexée sur chaleurs observées. - Coût moyen d’une dose de semence Charolais non sexée : 20€ [Prix moyen des catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle des vaches = 54,5% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Taux de gestation sur insémination artificielle sur les génisses= 55,8% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] Animaux Vaches Semence utilisée Non Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants 80 79 Nombre total d’IA 145 Veaux nés 78 Veaux Veaux mâles femelles 39 39 sexée Génisses Non Veaux commercialisés Génisses de renouvellement 39M + 10 29F 20 20 36 20 10 10 10M 10 sexée Tableau 46: Elevage Charolais composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Charolaise non sexée (Annexe 7) Entrées (€) Commercialisation des veaux 26488 3620 Doses de semences Total Sorties (€) +22868 Tableau 47: Bilan financier de la saison de reproduction d’élevage Charolais composé de 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence Charolaise non sexée (Annexe 7) Comme dans les exemples précédents, le troupeau de renouvellement issu de la saison de reproduction est composé à 50% de génisses de bonne qualité génétique et de 10% de génisses de qualité moyenne. 114 2) Elevage Charolais avec insémination en semence sexée Charolaise X des génisses et insémination en semence non sexée Charolaise des vaches - Insémination en semence non sexée Charolaise sur chaleurs observées chez les vaches. - Insémination en semence sexée X Charolaise sur chaleurs observées chez les génisses - Coût moyen d’une dose de semence Charolaise sexée : 35€ [prix moyen des catalogues] - Coût moyen d’une dose de semence Charolaise non sexée : 20€ [prix moyen des catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle non sexée des vaches = 54,5% [LE MEZEC et BARBAT(2008)] - Taux de gestation sur insémination artificielle sexée sur les génisses= 50% [SEIDEL (1999)] - Sexe ratio mâle femelle par IA de sperme sexé : 10/90 (Deuxième partie)II)A)1)b)i)) - Surcoût journalier d’élevage d’une génisse non fécondée : 0,6/jour [ARZUL (2006) (1)] Animaux Vaches Semence utilisée Non Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants 80 79 Nombre total d’IA 145 Veaux nés 78 Veaux Veaux mâles femelles 39 39 sexée Génisses Sexée Veaux commercialisés Génisses de renouvellement 39M + 3 36F 20 19 39 19 2 17 2M 17 X Tableau 48: Elevage Charolais composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 8) Entrées (€) Commercialisation des veaux 25942 4265 Doses de semences Surcoût d’élevage Sorties (€) des 37,8 génisses Total +21639,2 Tableau 49: Bilan financier de la saison de reproduction d’un élevage Charolais composée de 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 8) 115 On retrouve l’amélioration génétique déjà mise en évidence dans les exemples précédents (applications 2 et 5). Le bilan financier est inférieur à celui d’un élevage classique. 3) Elevage Charolais avec insémination en semence sexée X des génisses et en semence sexée Y des vaches En élevage allaitant, le bovin mâle est plus recherché que le bovin femelle pour ces capacités d’engraissement supérieures. On va donc se pencher sur le cas d’un élevage qui insémine ses vaches en semence sexée. Les différentes données bibliographiques donnent des taux de gestation en IA sexée uniquement sur les génisses. Chez celles-ci, la différence de taux de gestation entre une IA non sexée et une IA sexée est d’environ 6 points [SEIDEL(1999), LE MEZEC et BARBAT(2008)]. Nous allons donc définir le taux de gestation en IA sexée chez la vache charolaise comme étant de 6 points inférieur à celui espéré en IA non sexée. - Insémination en semence Charolaise sexée Y sur chaleurs observées pour les vaches - Insémination en semence Charolaise sexée X sur les génisses sur chaleurs observées. - Coût moyen d’une dose de semence Charolaise sexée : 35€ [Prix moyen des catalogues] - Taux de gestation sur insémination artificielle sexée des vaches = 48,5% - Taux de gestation sur insémination artificielle sexée sur les génisses= 50% [SEIDEL (1999)] - Pureté des paillettes sexées X: 90% (Deuxième partie, II)A)1)b)i)) - Surcoût journalier d’élevage d’une femelle non fécondée : 0,6€/jour [ARZUL (2006) (1)] Animaux Vaches Semence utilisée Sexée Nb Nb d’animaux d’animaux inséminés gestants 80 79 Nombre total d’IA 162 Veaux nés 78 Veaux Veaux mâles femelles 70 8 Y Génisses Sexée Veaux commercialisés Génisses de renouvellement 70M + 3 5F 20 19 39 19 2 17 2M 17 X Tableau 50: Elevage Charolais composé de 80 vaches inséminées en semence sexée Y charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 9) 116 Entrées (€) Commercialisation des veaux Sorties (€) 26810 Doses de semences 7035 Surcoût d’élevage 252 Total +19523 Tableau 51: Bilan financier d’un élevage Charolais composé de 80 vaches inséminées en semence sexée Y Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise (Annexe 9) Au final, le bilan financier est encore inférieur à celui de l’application 8 pour une même amélioration génétique. La plus value obtenue sur le prix de vente des veaux ne couvre pas le surcoût de l’achat des doses de semence sexée pour tout le troupeau. 4) Conclusion L’utilisation de semence sexée en élevage allaitant se justifie surtout sur l’amélioration génétique du troupeau. Sur un plan strictement financier, elle est défavorable à l’éleveur. Cependant, de nombreux éleveurs engraissent leurs veaux et ne sont pas strictement naisseurs. Dans ce cas, la plus-value finale peut être favorable à l’éleveur. 117 118 Annexe 1: Elevage Holstein avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Holstein Données: taux de gestation des vaches:37% Taux de gestation des génisses= 58% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =84€ Prix de vente des veaux femelles =48€ Prix dose de semence Holstein non sexée = 21€ Rang des chaleurs Nombre de vaches inséminées Nombres de vaches pleines Nombres de génisses inséminées (Nb de vaches inséminées*37%) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombres de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*58% 80 50 32 20 13 8 30 18 12 7 5 3 20 8 4 1 1 0 12 5 2 0 1 0 203 75 34 20 Avortements 1 0 74 37 20 10 37 10 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males (Veaux nés *0,5) Veaux femelles vendues:27 (veaux nés *0,5) valorisation des veaux 5244 (veaux mâles *84+veaux femelles*48 coût des doses de semence 4977 (nb de doses*21) TOTAL 267 119 Annexe 2: Elevage Holstein avec 80 vaches inséminées en semence Holstein non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X Données: taux de gestation des vaches:37% Taux de gestation des génisses= 50% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =84€ Prix de vente des veaux femelles =48€ Prix dose de semence Holstein non sexée=21€ Prix dose de semence Holstein sexée=42€ Surcoût d’élevage des génisses non gestantes=0,6€/jour Nombre de vaches inséminées Rang des chaleurs 1 2 3 4 5 6 Total Nombres de vaches pleines Nombres de Nombres de génisses génisses pleines inséminées (Nb de vaches inséminées*37%) (Nb de génisses inséminées*50%) 80 50 32 20 13 8 30 18 12 7 5 3 20 10 5 3 1 10 5 2 2 0 203 75 39 19 Doses suppl.=5 Avortements 1 0 74 37 19 2 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males veaux nés*0,1 (Veaux nés *0,5) Veaux femelles 37 (veaux nés *0,5) vendues:34 valorisation des veaux 4899,6 (veaux mâles *84+veaux femelles*48 coût des doses de semence (doses sexées*42+doses non sexées*21) Surcoût d’élevage (Nb de doses suppl*0,6*21) TOTAL 120 5901 63 -1064,4 17 (veaux nés*0,9) Annexe 3: Elevage Holstein avec 80 vaches inséminées en semence charolaise non sexée et 20 génisses inséminées en semence Holstein sexée X Données: Taux de gestation des vaches:37% Taux de gestation des génisses= 50% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles croisés =298,5€ Prix de vente des veaux femelles croisées=260€ Prix dose semence Holstein sexée=42€ Prix dose semence Charolais non sexée=21€ Surcoût d’élevage d’une génisse non gestante=0,6€/jour Rang des chaleurs Nombre de vaches inséminées Nombres de génisses inséminées Nombres de vaches pleines (Nb de vaches inséminées*37%) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombres de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*50%) 80 50 32 20 13 8 30 18 12 7 5 3 203 75 20 10 5 3 1 10 5 2 2 0 39 19 Nb de doses suppl=5 Avortements 1 0 74 37 19 2 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males veaux nés*0,1 (Veaux nés *0,5) Veaux femelles 37 (veaux nés *0,5) 17 (veaux nés*0,9) vendues:37 valorisation des veaux 20832,5 (veaux mâles croisés *298,5+veaux femelles croisés*260+veaux mâles purs*84) coût des doses de semence (doses sexées*42+doses non sexées*21) Surcoût d’élevage des génisses (doses suppl*0,6*21) TOTAL 5901 63 14868,5 121 Annexe 4: Elevage Montbéliard : 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Montbéliarde Données: Taux de gestation des vaches:54% Taux de gestation des génisses= 60% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =108€ Prix de vente des veaux femelles =108€ Prix dose de semence Montbéliarde non sexée = 20€ Nombre de vaches inséminées Rang des chaleurs Nombres de vaches pleines Nombre de génisses inséminées (Nb de vaches inséminées*0,54) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombres de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*0,6) 80 37 17 8 4 1 43 20 9 4 3 0 20 8 3 1 1 0 12 5 2 0 1 0 147 79 33 20 Avortements 1 0 78 39 20 10 39 10 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males (Veaux nés *0,5) Veaux femelles vendues:29 (veaux nés *0,5) valorisation des veaux 8424 (veaux mâles *84+veaux femelles*48 coût des doses de semence (nb de doses*21) TOTAL 122 3600 4824 Annexe 5 : Elevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Montbéliarde et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde Données: Taux de gestation des vaches:54% Taux de gestation des génisses= 50% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =108€ Prix de vente des veaux femelles =108€ Prix dose de semence Montbéliarde non sexée= 20€ Prix dose de semence Montbéliarde sexée X = 48€ Surcoût d’élevage d’une génisse non gestante=0,6€/jour Nombre de vaches inséminées Rang des chaleurs Nombres de vaches pleines Nombre de génisses inséminées (Nb de vaches inséminées*0,54) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombre de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*0,5) 80 37 17 8 4 1 43 20 9 4 3 0 20 10 5 3 1 10 5 2 2 0 147 79 39 19 Doses suppl=6 Avortements 1 0 78 39 19 2 39 17 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males (Veaux nés *0,5) Veaux femelles (veaux nés *0,5) vendues36 valorisation des veaux 8316 (veaux mâles *84+veaux femelles*48 coût des doses de semence 4812 (nb de doses*21) Surcoût d’élevage des génisses (doses suppl*0,6*28) 75,6 TOTAL 3428,4 123 Annexe 6: Elevage Montbéliard avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Montbéliarde Données: Taux de gestation des vaches:54% Taux de gestation des génisses= 50% Prix de vente des veaux mâles croisés=298,5€ Prix de vente des veaux femelles croisés=260€ Surcoût d’élevage d’une génisse non gestante=0,6€/jour Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =108€ Prix de vente des veaux femelles =108€ Prix dose de semence Montbéliarde non sexée= 20€ Prix dose de semence Montbéliarde sexée X = 48€ Nombre de vaches inséminées Rang des chaleurs Nombres de vaches pleines Nombre de génisses inséminées Nombres de génisses pleines (Nb de vaches inséminées*0,54) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi (Nb de génisses inséminées*0,5) 80 37 17 8 4 1 43 20 9 4 3 0 20 10 5 3 1 10 5 2 2 0 147 79 39 19 Doses suppl=6 Avortement 1 0 78 39 19 2 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males (Veaux nés *0,5) Veaux femelles (veaux nés *0,5) vendues:39 valorisation des veaux 21997,5 (veaux mâles *84+veaux femelles*48 coût des doses de semence (nb de doses*21) Surcoût d’élevage des génisses (doses suppl*0,6*28) TOTAL 124 veaux nés*0,1 39 4812 75,6 17109,9 17 veaux nés*0,9 Annexe 7: Elevage charolais avec 80 vaches et 20 génisses toutes inséminées en semence non sexée Charolaise Données: Taux de gestation des vaches:54,5% Taux de gestation des génisses= 55,8% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =350€ Prix de vente des veaux femelles =322€ Prix dose de semence Charolaise non sexée = 20€ Nombre de vaches inséminées Rang des chaleurs Nombres de vaches pleines Nombre de génisses inséminées (Nb de vaches inséminées*0,545) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombres de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*0,558) 80 36 17 8 3 1 44 19 9 4 2 1 20 9 4 2 1 11 5 2 1 1 145 79 36 20 Avortements 1 0 78 39 20 10 39 10 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males (Veaux nés *0,5) Veaux femelles vendues:29 (veaux nés *0,5) valorisation des veaux 26488 (veaux mâles *350+veaux femelles*322 coût des doses de semence 3620 (nb de doses*21) TOTAL 22868 125 Annexe 8: Elevage Charolais avec 80 vaches inséminées en semence non sexée Charolais et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolais Données: Taux de gestation des vaches:54,5% Taux de gestation des génisses= 50% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =350€ Prix de vente des veaux femelles =322€ Prix dose de semence Charolaise non sexée= 20€ Prix dose de semence Charolaise sexée X = 35€ Surcoût de l’élevage d’une génisse=0,6€/jour Rang des chaleurs Nombre de vaches inséminées Nombres de vaches pleines Nombre de génisses inséminées (Nb de vaches inséminées*0,54) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombre de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*0,5) 80 36 17 8 3 1 44 19 9 4 2 1 20 10 5 3 1 10 5 2 2 0 145 79 39 19 Doses suppl=3 Avortements 1 0 78 39 19 2 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males veaux nés*0,1 (Veaux nés *0,5) Veaux femelles 39 (veaux nés *0,5) vendues:36 valorisation des veaux 25942 (veaux mâles *350+veaux femelles*322) coût des doses de semence 4265 (nb de doses*21) Surcoût d’élevage des génisses (doses suppl*0,6*28) 37,8 TOTAL 126 21639,2 17 veaux nés*0,9 Annexe 9: Elevage Charolais avec 80 vaches inséminées en semence sexée Y Charolaise et 20 génisses inséminées en semence sexée X Charolaise Données: Taux de gestation des vaches:48,5% Taux de gestation des génisses= 50% Taux d'avortement=1,7% Taux de renouvellement=20% Prix de vente des veaux mâles =350€ Prix de vente des veaux femelles =322€ Prix dose de semence Charolaise sexée= 35€ Surcoût d’élevage d’une femelle non gestante=0,6€/jour Rang des chaleurs Nombre de vaches inséminées Nombres de vaches pleines Nombre de génisses inséminées (Nb de vaches inséminées*0,54) 1 2 3 4 5 6 Total arrondi Nombres de génisses pleines (Nb de génisses inséminées*0,6) 80 41 21 11 6 3 39 20 10 5 3 2 20 10 5 3 1 10 5 2 2 0 162 79 39 19 Doses suppl=17 Doses suppl=3 Avortement 1 0 78 70 19 2 (vaches pleines*0,017) Nb de veaux nés Veaux males (veaux nés *0,1) (Veaux nés *0,9) Veaux femelles 8 (veaux nés *0,1) 17 (veaux nés*0,9) vendues:5 valorisation des veaux 26810 (veaux mâles *84+veaux femelles*48 coût des doses de semence (nb de doses*21) 7035 Surcoût d’élevage 252 (doses suppl*0,6*21) TOTAL 19523 127 Bibliographie ANDERSON GB (1987) Identification of embryonic sex by detection of H-Y antigen Theriogenology, Volume 27, p81 à p97 ARZUL P (2006) (1) 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Ce travail se penche sur les différentes techniques disponibles ou en cours de développement qui permettent à l’éleveur d’influer sur le sexe ratio des produits de son élevage. Ces techniques s’appliquent à différents moments de la conception et du développement de l’embryon : sur la semence, sur l’embryon préimplantatoire ou sur le fœtus. L’utilisation de ces techniques engendre un coût supplémentaire pour éleveur. En prenant l’exemple de l’insémination artificielle en semence sexée, nous verrons que certains élevages n’ont financièrement pas intérêt à recourir à cette technique. MOTS CLES : -Sexage - Semence - Embryon - Echographie - Elevage bovin JURY : Président : Monsieur le Professeur Jean-François GUERIN 1er Assesseur : 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Pierre GUERIN Madame le docteur Marianne ARCANGIOLI DATE DE SOUTENANCE : 14 octobre 2011 ADRESSE DE L’AUTEUR : 11 rue du Moulin à vent 95660 Champagne sur Oise 136
