La symbiose Rhizobium-Legumineuse

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REPONSES DES PLANTES A L’ENVIRONNEMENT
CHAPITRE IV : LA SYMBIOSE RHIZOBIUM-LEGUMINEUSE
I – DIVERSITE DES RHIZOBIUM ET SPECIFICITE D’HOTE
L’azote est un nutriment important pour la plante. Il est souvent apporté par la symbiose entre la plante et une bactérie. Celle
entre Rhizobium et les légumineuses passe par une nodosité particulière qui fixe l’azote atmosphérique, le transforme en
ammoniaque, que la plante récupère en échange de composés carbonés donnés à la bactérie. Cela nécessite d’avoir certaines
molécules permettant la reconnaissance.
Il existe plusieurs types d’associations entre les plantes et les bactéries fixatrices d’azote :
• Association sans symbiose vraie : il y a colonisation dans le cortex de la plante mais sans symbiose réelle. Toutefois, la
présence de ces bactéries, que l’on appelle PGPB pour Plant Growth Promoting Bacteria favorise quand même la
croissance de la plantes.
• Symbiose comme le cas de rhizobium, très important, mais qui concerne seulement les légumineuses. Il existe aussi
d’autres cas de symbiose notamment des symbioses avec un actinomycète formant une nodosité particulière,
l’actinorhize.
La symbiose rhizobium-légumineuses existe également en deux types :
 Déterminées : toutes les bactéries sont au même stade de différenciation dans la zone centrale des nodosités rondes.
 Indéterminées : les nodosités sont à croissance apicale avec une forme allongée. La nodosité contient un méristème
apical.
De même, il y a deux types de colonisation bactérienne possible. Chaque bactérie peut utiliser les deux modes d’infection :
 « Crack Entry » : pénétration au niveau d’une blessure
 Colonisation par cordon d’infection : les bactéries pénètrent par les poils absorbants. C’est le mode le plus « évolué ».
Les Rhizobium comprennent donc l’ensemble des bactéries capables de former des nodosités sur une légumineuse.
Cela correspond à des protéobactéries. Il y en a 5 genres dans l’embranchement des protéobactéries α :
 Rhizobium (avec Trèfle, Pois, féverole, haricot)
 Mesorhizobium (avec Lotus, acacia)
 Sinorhizobium (avec Medicago, trigonella, meliloti)
 Azorhizobium (avec sesbania rostrata)
 Bradyrhizobium (avec soja, mimosa)
On pensait qu’il n’y en avait pas d’autres, mais on en a trouvé un autre genre dans les protéobactéries β (Burkholderia).
De nos jours on peut obtenir des souches pouvant moduler jusqu’à 70 espèces de légumineuses (Souche NGR234 qui peut
d’ailleurs aussi moduler une non-légumineuse, parasponia).
Il existe aussi des bactéries capables d’utiliser le méthanol (methanobacterium) qui peut faire une symbiose avec des
légumineuses tropicales. D’autres systèmes originaux se retrouvent :
 Nodosités caulinaires dans les sites de départs de racines adventives
 Nodosités caulinaires d’Aeschynomene indica avec Sesbania. Ces nodosités, très aplaties autour de la tige, contiennent
des systèmes photosynthétiques.
II – LA FORMATION DE LA NODOSITE
L’interaction entre la bactérie et la plante se fait avec un système clé-serrure, dialogue moléculaire entre les deux partenaires :
1. La plante produit des exsudats racinaires, spécifiques de l’hôte, dans la rhizosphère. Parmi ces exsudats, on retrouve
des flavonoïdes, molécules à deux cycles dont un hétérocycle, sur lequel est branché un troisième cycle décoré par des
OH. En fonction du nombre et de la localisation de ces OH, on aura des flavonoïdes différents. Chaque flavonoïde a un
rhizobium de prédilection. La principale pour Sinorhizobium par exemple est la Lutéoléine.

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2. La bactérie dispose d’un facteur de transcription cytosolique, NodD. Celui-ci se lie au flavonoïde et obtient alors une
affinité pour la Nod-box, qui permet la synthèse des facteurs symbiotiques Nod. On a 5 unités de transcription codant
beaucoup de facteurs Nod différents. Ces gènes sont contenus sur les deux mégaplasmides bactérien pSYMa (n’est pas
vital pour la bactérie mais nécessaire à la symbiose) et pSYMb (nécessaire à la symbiose ET à la survie de la bactérie : si
on l’enlève, la bactérie meure).
Les facteurs Nod sont, à la base, des lipochitooligosaccharides, donc une association d’une chaine aliphatique allant de 16 à 18
Carbones avec 5 sucres (N-Acétylglucosamine ou NAG. C’est le premier NAG qui porte la chaine sur son extrémité non-
réductrice) :
a) Le monomère se forme à l’aide du facteur NodM
b) NodA et NodB forment l’enzyme NodAB qui permettra l’adjonction de la chaine aliphatique.
c) NodC forme la liaison des sucres entre eux.
On a donc une base commune à l’ensemble des rhizobiums (sauf pour bradyrhizobium qui est à part). Mais il y a ensuite les
décorations spécifiques de la souche, faisant que le facteur sera reconnu par une plante mais pas l’autre.
d) NodL rajoute un COCH
3
sur le premier sucre.
e) NodH rajoute un SO
3
H sur le dernier sucre.
Tous ces facteurs qui vont créer ce Nod sont considérés comme des enzymes.
3. Dans le cas de la colonisation par cordon d’infection, les bactéries vont donc se loger sur un poil absorbant jeune et
éjecter ce Nod. La cellule végétale dispose d’un récepteur membranaire qui reconnait le Nod spécifiquement. Après
cela, le poil va se courber et adopter une forme en crosse de berger.
4. Le cytosquelette se déplace et déplace le noyau du poil absorbant. Il y a alors hydrolyse locale de la paroi. La membrane
plasmique s’invagine et s’enfonce vers la base du poil. Il se forme une nouvelle paroi sur cette invagination. Le cordon
est né.

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5. Les assises cellulaires en dessous du poil se préparent à accueillir le cordon qui traverse les cellules. Les bactéries se
déplacent à l’intérieur de se cordon jusqu’au cortex racinaire. Mais le cordon ne continue à pousser que tant qu’il y a
des bactéries, qui produisent des exopolysaccharides. Ces sucres sont spécifiques des bactéries et constituent une
nouvelle sécurité de reconnaissance. Les bactéries de l’arrière du cordon sont en phase stationnaires et celles du
devant se divisent activement. Il y a une poussée venant des bactéries « anciennes » rigidifiées par la matrice à l’arrière
sur les bactéries de devant.
6. En parallèle, on a la formation de la nodosité. Sous l’impulsion du péricycle, le cortex interne se dédifférencie. Le
primordium nodositaire, base sur laquelle le méristème se forme au niveau du cortex moyen, grandit et sort de
l’épiderme. Le grandissement se fait par « développement-différenciation » du méristème qui ne se différencie jamais
en entier : on a toujours un méristème apical persistant, qui continue à se développer. Une partie des cellules se
différencient, mais la partie persistante continue de grandir, et le cycle continue.
7. La nodosité est formée de 4 zones. La première est la zone méristématique. Les cordons ne traversent JAMAIS cette
zone. Ils arrivent sur les côtés dans la zone II ou zone d’infection. Parfois, ils arrivent dans les zones III ou IV et dans ce
cas là, ça ne sert à rien, car ça ne marchera pas. En zone II, les bactéries sont endocytosées dans le cytosol. On les
appelle alors bactéroïdes et elles sont entourées d’un espace péribactéroïdien délimité par une membrane
péribactéroïdienne. L’ensemble du système est un symbiosome. Du côté cellulaire on a réduction de la vacuole,
conservation de la mitochondrie, et synthèse de composés important pour la vie de la bactérie.
8. La bactérie stoppe alors sa division, s’allonge et double son génome. Elle entre dans l’interzone II-III ou son mécanisme
d’assimilation de l’azote est supprimé, afin de pouvoir tout donner à la plante. A la place, les gènes de fixation de
l’azote sont transcrits. C’est l’entrée dans la zone III ou zone de fixation ou se trouve aussi des cellules non-infectées.
9. Lorsque la bactérie fatigue et ne sert plus, elle est évacuée en zone IV ou zone de sénescence. Au final, bactérie et
cellule meurent.
En conclusion, pour une nodosité indéterminée, on aura reconnaissance et attachement des bactéries, suivi de l’initiation de
l’infection, avec en parallèle l’organogénèse de la nodosité (synthèse de nodulines précoces pour aider à ça), et la progression
du cordon vers la zone II (nodulines tardives pour maturation et fonctionnement de la nodosité).
On estime qu’il faut 12g de carbone pour fixer 1g d’azote.
III – FONCTIONNEMENT DE LA NODOSITE MATURE
La nitrogénase est une enzyme procaryote très conservée (donc soumis à des contraintes de sélection l’empêchant d’évoluer)
d’une bactérie à une autre. La réaction catalysée est la suivante :
ܰ
ଶ
+ 8ܪ
ା
+ 8݁
ି
→ 2ܰܪ
ଷ
+ ܪ
ଶ
Consommant 16 ATP. Elle est composée de 2 protéines :
• La protéine II ou Dinitrogénase réductase. Cette protéine est composée d’un corps protéique (apoprotéine en deux
sous-unités) et un cœur métallique au centre (cluster 4 Fe – 4 S dans notre cas qui se lie au niveau des soufres aux
cystéines de la protéine). Cette protéine récupère en premier les électrons du donneur, souvent la Ferrédoxine, et
devient alors réduite. Elle se lie à deux ATP et devient affine pour la protéine I.
• La protéine I ou Dinitrogénase possède 4 sous-unités (2 α et 2 β) avec deux centres catalytiques avec des cofacteurs à
molybdènes sur les α, et deux clusters P (Fe-S un peu plus complexes) faisant la liaison α/β. Lorsqu’il y a fixation entre I
et II, il y a hydrolyse de l’ATP éjectant l’électron sur le cofacteur. II se dissocie alors, et 7 cycles plus tard, la protéine est
entièrement chargée.

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La maturation, la synthèse, et le fonctionnement de la nitrogénase, sont réglés par une vingtaine de gènes, les gènes nif. C’est
donc un processus complexe, c’est la raison pour laquelle s’il existe un autre moyen d’avoir de l’azote, la bactérie ne va pas
s’embêter à synthétiser tout ça.
De plus, la nitrogénase est extrêmement sensible à l’oxygène, ce qui pose problème, puisque pour combler les besoins
énergétique de la nitrogénase (et de la bactérie en général) il faut de l’ATP, qui ne peut être obtenu qu’avec de l’oxygène. Pour
comprendre comment la plante résout ce paradoxe, on a entré petit à petit une électrode à oxygène dans une nodosité
déterminée jusqu’au cylindre central (ou indéterminée jusqu’en zone III puisque c’est la même chose), et on s’est aperçu que
plus on avançait vers le centre, moins la concentration en oxygène était grande. La nodosité met donc en place une véritable
barrière à la diffusion des gaz (en particulier de l’oxygène) avec des cellules du parenchyme très petites et bourrées de
glycoprotéines, pour limiter au plus les échanges tout en laissant juste ce qu’il faut, pour que la bactérie, qui reste aérobie,
survive. Lors d’un stress, la plante serrera instinctivement sa barrière, et ce même si ça finit par provoquer la mort des bactéries.
Afin d’aider à récupérer le peu d’oxygène que la barrière laisse entrer, la plante met en place une protéine, noduline tardive
appelée leghémoglobine. Cette protéine hémique dispose d’un noyau tétrapyrrol (comme la chlorophylle mais avec du Fer à la
place du Magnésium) et peut lier l’oxygène, adoptant ainsi un spectre d’absorption particulier selon sa forme :
 Sous forme liée, on aura deux pics spécifiques à 541 et 574 nanomètres.
 Sous forme non-liée, en bonne santé, le fer est sous forme de fer ferreux (Fe
2+
) et on peut voir un pic unique spécifique
à 556 nm
 Sous forme non-liée, en mauvaise santé, le fer est sous forme de fer ferrique (Fe
3+
) et le spectre est indéfinissable.
Cette protéine ne va donc pas pomper l’oxygène en excès mais simplement servir de « tampon à oxygène », diminuant ou
augmentant la concentration en cas de besoin pour maintenir l’équilibre parfait.
Cet équilibre, la bactérie va devoir l’utiliser à bon escient, ce qui n’est pas faisable avec sa chaine de respiration normale. Elle va
donc en synthétiser une autre, très affine pour l’O
2
, la chaine respiratoire FixNOQP qui utilise le cytochrome bb3 en tant
qu’oxydase terminale, créant au passage un gradient de proton utilisé pour faire de l’ATP. Cette chaine aura besoin de NADH
pour fonctionner, celui-ci étant apporté par le cycle de Krebs (à la suite de l’utilisation des substrats carbonés donnés par la
plante)
Il n’est pas toujours simple de mesurer les quantités :
• Parce que beaucoup de bactéries symbiotiques disposent en plus d’hydrogénases pour éliminer l’hydrogène formé par
la réaction de la nitrogénase. Ceci peut interférer avec la mesure de l’activité mais est essentiel pour conserver la
barrière anti-gaz.
• Parce que la nitrogénase réduit un grand nombre de composés (spécificité large, pouvant atteindre l’acétylène et
l’éthylène). Cela ne gène pas trop dans la nodosité ou ces gaz sont peu présents. En plus, on peut vérifier leur présence

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avec une chromatographie en phase gazeuse mesurant l’activité réductrice d’acétylène (ARA). On place ainsi 10 %
d’acétylène dans une cloche sous laquelle se trouve une plante, on attend et on récupère le gaz pour le passer à travers
la colonne. L’éthylène traverse plus vite que l’acétylène.
• Parce qu’il y a déjà du NH
3
dans les plantes naturellement.
En plus des gènes nif, communs à toutes les bactéries fixatrices d’azote, il existe une autre classe de gènes, cette fois
spécifiques. Ce sont les gènes fix.
Parmi les gènes nif, il en existe donc un qui code pour une protéine membranaire, qui servira de détecteur de la concentration
d’oxygène. Dans la bactérie libre, l’oxygène étant très présent, elle ne s’active jamais. Il en va de même dans le cordon ou la
zone II de la nodosité. Dans l’interzone II-III par contre, la protéine sent le changement et s’active, pour ainsi phosphoryler la
protéine FixJ, un régulateur transcriptionnel. Comme c’était le cas avec NodD, ce régulateur se fixe à des régions promotrice
activant la transcription de nifA, qui va aller activer la transcription des autres gènes nif, et FixK qui va réguler l’expression des
gènes spécifiques (fix) de la bactérie. Cette différenciation de classe de gène est cruciale, car le métabolisme de la bactérie libre
et celui du bactéroïde est différent. Par exemple, si les gènes nif sont nécessaires chez la bactérie libre qui doit faire son activité
nitrogénase, les gènes fix, eux, qui vont servir par exemple à la synthèse des acteurs de la chaine respiratoire FixNOQP, ne le
sont absolument pas si la bactérie n’est pas sous forme bactéroïde.
La plante va donc apporter du sucre, sous forme de saccharose. Celui-ci est divisé en Fructose + Glucose par l’action de la
Saccharose invertase. Le glucose entre en glycolyse dans le cytosol de la plante, formant du phosphoénolpyruvate, PEP. Celui-ci,
que ce soit dans les cellules infectées ou les cellules adjacentes non-infectées de la nodosité, sera transformé en oxaloacétate
OAA par carboxylation puis réduit en Malate. C’est sous cette forme que le sucre est transmis au bactéroïde, via des
transporteurs spécifiques sur la membrane péribactéroïdienne ET bactéroïdienne, qui ont plutôt intérêt à ne pas être mutés
(auquel cas la bactérie devient inutile, donc la plante dégénère la nodosité).
En même temps, la plante enverra des protons dans l’espace péribactéroïdien, consommant de l’ATP, pour rendre celui-ci très
acide. Ainsi, lorsque le NH
3
sera formé, celui-ci pourra :
• Diffuser à travers la membrane et se retrouver dans l’espace où, par l’action des protons, il pourra devenir ammonium
NH
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+
. C’est cet ammonium qui sort du symbiosome par un transporteur ANT (codé par la plante, la membrane
péribactéroïdienne étant d’origine plantaire) et pourra être utilisé par le système d’assimilation de l’azote fixé.
• Etre transformé en acides aminés (asparagine ou alanine) qui sortiront du symbiosome via des transporteurs.
La plante pourra assimiler l’azote en utilisant un des deux systèmes suivants :
1. Le système d’exportation sous forme d’amides :