La symbiose Rhizobium-Legumineuse
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REPONSES DES PLANTES A L’ENVIRONNEMENT CHAPITRE IV : LA SYMBIOSE RHIZOBIUM-LEGUMINEUSE I – DIVERSITE DES RHIZOBIUM ET SPECIFICITE D’HOTE L’azote est un nutriment important pour la plante. Il est souvent apporté par la symbiose entre la plante et une bactérie. Celle entre Rhizobium et les légumineuses passe par une nodosité particulière qui fixe l’azote atmosphérique, le transforme en ammoniaque, que la plante récupère en échange de composés carbonés donnés à la bactérie. Cela nécessite d’avoir certaines molécules permettant la reconnaissance. Il existe plusieurs types d’associations entre les plantes et les bactéries fixatrices d’azote : • Association sans symbiose vraie : il y a colonisation dans le cortex de la plante mais sans symbiose réelle. Toutefois, la présence de ces bactéries, que l’on appelle PGPB pour Plant Growth Promoting Bacteria favorise quand même la croissance de la plantes. • Symbiose comme le cas de rhizobium, très important, mais qui concerne seulement les légumineuses. Il existe aussi d’autres cas de symbiose notamment des symbioses avec un actinomycète formant une nodosité particulière, l’actinorhize. La symbiose rhizobium-légumineuses existe également en deux types : Déterminées : toutes les bactéries sont au même stade de différenciation dans la zone centrale des nodosités rondes. Indéterminées : les nodosités sont à croissance apicale avec une forme allongée. La nodosité contient un méristème apical. De même, il y a deux types de colonisation bactérienne possible. Chaque bactérie peut utiliser les deux modes d’infection : « Crack Entry » : pénétration au niveau d’une blessure Colonisation par cordon d’infection : les bactéries pénètrent par les poils absorbants. C’est le mode le plus « évolué ». Les Rhizobium comprennent donc l’ensemble des bactéries capables de former des nodosités sur une légumineuse. Cela correspond à des protéobactéries. Il y en a 5 genres dans l’embranchement des protéobactéries α : Rhizobium (avec Trèfle, Pois, féverole, haricot) Mesorhizobium (avec Lotus, acacia) Sinorhizobium (avec Medicago, trigonella, meliloti) Azorhizobium (avec sesbania rostrata) Bradyrhizobium (avec soja, mimosa) On pensait qu’il n’y en avait pas d’autres, mais on en a trouvé un autre genre dans les protéobactéries β (Burkholderia). De nos jours on peut obtenir des souches pouvant moduler jusqu’à 70 espèces de légumineuses (Souche NGR234 qui peut d’ailleurs aussi moduler une non-légumineuse, parasponia). Il existe aussi des bactéries capables d’utiliser le méthanol (methanobacterium) qui peut faire une symbiose avec des légumineuses tropicales. D’autres systèmes originaux se retrouvent : Nodosités caulinaires dans les sites de départs de racines adventives Nodosités caulinaires d’Aeschynomene indica avec Sesbania. Ces nodosités, très aplaties autour de la tige, contiennent des systèmes photosynthétiques. II – LA FORMATION DE LA NODOSITE L’interaction entre la bactérie et la plante se fait avec un système clé-serrure, dialogue moléculaire entre les deux partenaires : 1. La plante produit des exsudats racinaires, spécifiques de l’hôte, dans la rhizosphère. Parmi ces exsudats, on retrouve des flavonoïdes, molécules à deux cycles dont un hétérocycle, sur lequel est branché un troisième cycle décoré par des OH. En fonction du nombre et de la localisation de ces OH, on aura des flavonoïdes différents. Chaque flavonoïde a un rhizobium de prédilection. La principale pour Sinorhizobium par exemple est la Lutéoléine. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 1 La bactérie dispose d’un facteur de transcription cytosolique, NodD. Celui-ci se lie au flavonoïde et obtient alors une affinité pour la Nod-box, qui permet la synthèse des facteurs symbiotiques Nod. On a 5 unités de transcription codant beaucoup de facteurs Nod différents. Ces gènes sont contenus sur les deux mégaplasmides bactérien pSYMa (n’est pas vital pour la bactérie mais nécessaire à la symbiose) et pSYMb (nécessaire à la symbiose ET à la survie de la bactérie : si on l’enlève, la bactérie meure). Les facteurs Nod sont, à la base, des lipochitooligosaccharides, donc une association d’une chaine aliphatique allant de 16 à 18 Carbones avec 5 sucres (N-Acétylglucosamine ou NAG. C’est le premier NAG qui porte la chaine sur son extrémité nonréductrice) : a) Le monomère se forme à l’aide du facteur NodM b) NodA et NodB forment l’enzyme NodAB qui permettra l’adjonction de la chaine aliphatique. c) NodC forme la liaison des sucres entre eux. On a donc une base commune à l’ensemble des rhizobiums (sauf pour bradyrhizobium qui est à part). Mais il y a ensuite les décorations spécifiques de la souche, faisant que le facteur sera reconnu par une plante mais pas l’autre. d) NodL rajoute un COCH3 sur le premier sucre. e) NodH rajoute un SO3H sur le dernier sucre. Tous ces facteurs qui vont créer ce Nod sont considérés comme des enzymes. 2. 3. Dans le cas de la colonisation par cordon d’infection, les bactéries vont donc se loger sur un poil absorbant jeune et éjecter ce Nod. La cellule végétale dispose d’un récepteur membranaire qui reconnait le Nod spécifiquement. Après cela, le poil va se courber et adopter une forme en crosse de berger. 4. Le cytosquelette se déplace et déplace le noyau du poil absorbant. Il y a alors hydrolyse locale de la paroi. La membrane plasmique s’invagine et s’enfonce vers la base du poil. Il se forme une nouvelle paroi sur cette invagination. Le cordon est né. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 2 5. Les assises cellulaires en dessous du poil se préparent à accueillir le cordon qui traverse les cellules. Les bactéries se déplacent à l’intérieur de se cordon jusqu’au cortex racinaire. Mais le cordon ne continue à pousser que tant qu’il y a des bactéries, qui produisent des exopolysaccharides. Ces sucres sont spécifiques des bactéries et constituent une nouvelle sécurité de reconnaissance. Les bactéries de l’arrière du cordon sont en phase stationnaires et celles du devant se divisent activement. Il y a une poussée venant des bactéries « anciennes » rigidifiées par la matrice à l’arrière sur les bactéries de devant. 6. En parallèle, on a la formation de la nodosité. Sous l’impulsion du péricycle, le cortex interne se dédifférencie. Le primordium nodositaire, base sur laquelle le méristème se forme au niveau du cortex moyen, grandit et sort de l’épiderme. Le grandissement se fait par « développement-différenciation » du méristème qui ne se différencie jamais en entier : on a toujours un méristème apical persistant, qui continue à se développer. Une partie des cellules se différencient, mais la partie persistante continue de grandir, et le cycle continue. 7. La nodosité est formée de 4 zones. La première est la zone méristématique. Les cordons ne traversent JAMAIS cette zone. Ils arrivent sur les côtés dans la zone II ou zone d’infection. Parfois, ils arrivent dans les zones III ou IV et dans ce cas là, ça ne sert à rien, car ça ne marchera pas. En zone II, les bactéries sont endocytosées dans le cytosol. On les appelle alors bactéroïdes et elles sont entourées d’un espace péribactéroïdien délimité par une membrane péribactéroïdienne. L’ensemble du système est un symbiosome. Du côté cellulaire on a réduction de la vacuole, conservation de la mitochondrie, et synthèse de composés important pour la vie de la bactérie. 8. La bactérie stoppe alors sa division, s’allonge et double son génome. Elle entre dans l’interzone II-III ou son mécanisme d’assimilation de l’azote est supprimé, afin de pouvoir tout donner à la plante. A la place, les gènes de fixation de l’azote sont transcrits. C’est l’entrée dans la zone III ou zone de fixation ou se trouve aussi des cellules non-infectées. 9. Lorsque la bactérie fatigue et ne sert plus, elle est évacuée en zone IV ou zone de sénescence. Au final, bactérie et cellule meurent. En conclusion, pour une nodosité indéterminée, on aura reconnaissance et attachement des bactéries, suivi de l’initiation de l’infection, avec en parallèle l’organogénèse de la nodosité (synthèse de nodulines précoces pour aider à ça), et la progression du cordon vers la zone II (nodulines tardives pour maturation et fonctionnement de la nodosité). On estime qu’il faut 12g de carbone pour fixer 1g d’azote. III – FONCTIONNEMENT DE LA NODOSITE MATURE La nitrogénase est une enzyme procaryote très conservée (donc soumis à des contraintes de sélection l’empêchant d’évoluer) d’une bactérie à une autre. La réaction catalysée est la suivante : ܰଶ + 8 ܪା + 8݁ ି → 2ܰܪଷ + ܪଶ Consommant 16 ATP. Elle est composée de 2 protéines : • La protéine II ou Dinitrogénase réductase. Cette protéine est composée d’un corps protéique (apoprotéine en deux sous-unités) et un cœur métallique au centre (cluster 4 Fe – 4 S dans notre cas qui se lie au niveau des soufres aux cystéines de la protéine). Cette protéine récupère en premier les électrons du donneur, souvent la Ferrédoxine, et devient alors réduite. Elle se lie à deux ATP et devient affine pour la protéine I. • La protéine I ou Dinitrogénase possède 4 sous-unités (2 α et 2 β) avec deux centres catalytiques avec des cofacteurs à molybdènes sur les α, et deux clusters P (Fe-S un peu plus complexes) faisant la liaison α/β. Lorsqu’il y a fixation entre I et II, il y a hydrolyse de l’ATP éjectant l’électron sur le cofacteur. II se dissocie alors, et 7 cycles plus tard, la protéine est entièrement chargée. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 3 La maturation, la synthèse, et le fonctionnement de la nitrogénase, sont réglés par une vingtaine de gènes, les gènes nif. C’est donc un processus complexe, c’est la raison pour laquelle s’il existe un autre moyen d’avoir de l’azote, la bactérie ne va pas s’embêter à synthétiser tout ça. De plus, la nitrogénase est extrêmement sensible à l’oxygène, ce qui pose problème, puisque pour combler les besoins énergétique de la nitrogénase (et de la bactérie en général) il faut de l’ATP, qui ne peut être obtenu qu’avec de l’oxygène. Pour comprendre comment la plante résout ce paradoxe, on a entré petit à petit une électrode à oxygène dans une nodosité déterminée jusqu’au cylindre central (ou indéterminée jusqu’en zone III puisque c’est la même chose), et on s’est aperçu que plus on avançait vers le centre, moins la concentration en oxygène était grande. La nodosité met donc en place une véritable barrière à la diffusion des gaz (en particulier de l’oxygène) avec des cellules du parenchyme très petites et bourrées de glycoprotéines, pour limiter au plus les échanges tout en laissant juste ce qu’il faut, pour que la bactérie, qui reste aérobie, survive. Lors d’un stress, la plante serrera instinctivement sa barrière, et ce même si ça finit par provoquer la mort des bactéries. Afin d’aider à récupérer le peu d’oxygène que la barrière laisse entrer, la plante met en place une protéine, noduline tardive appelée leghémoglobine. Cette protéine hémique dispose d’un noyau tétrapyrrol (comme la chlorophylle mais avec du Fer à la place du Magnésium) et peut lier l’oxygène, adoptant ainsi un spectre d’absorption particulier selon sa forme : Sous forme liée, on aura deux pics spécifiques à 541 et 574 nanomètres. 2+ Sous forme non-liée, en bonne santé, le fer est sous forme de fer ferreux (Fe ) et on peut voir un pic unique spécifique à 556 nm 3+ Sous forme non-liée, en mauvaise santé, le fer est sous forme de fer ferrique (Fe ) et le spectre est indéfinissable. Cette protéine ne va donc pas pomper l’oxygène en excès mais simplement servir de « tampon à oxygène », diminuant ou augmentant la concentration en cas de besoin pour maintenir l’équilibre parfait. Cet équilibre, la bactérie va devoir l’utiliser à bon escient, ce qui n’est pas faisable avec sa chaine de respiration normale. Elle va donc en synthétiser une autre, très affine pour l’O2, la chaine respiratoire FixNOQP qui utilise le cytochrome bb3 en tant qu’oxydase terminale, créant au passage un gradient de proton utilisé pour faire de l’ATP. Cette chaine aura besoin de NADH pour fonctionner, celui-ci étant apporté par le cycle de Krebs (à la suite de l’utilisation des substrats carbonés donnés par la plante) Il n’est pas toujours simple de mesurer les quantités : • Parce que beaucoup de bactéries symbiotiques disposent en plus d’hydrogénases pour éliminer l’hydrogène formé par la réaction de la nitrogénase. Ceci peut interférer avec la mesure de l’activité mais est essentiel pour conserver la barrière anti-gaz. • Parce que la nitrogénase réduit un grand nombre de composés (spécificité large, pouvant atteindre l’acétylène et l’éthylène). Cela ne gène pas trop dans la nodosité ou ces gaz sont peu présents. En plus, on peut vérifier leur présence Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 4 • avec une chromatographie en phase gazeuse mesurant l’activité réductrice d’acétylène (ARA). On place ainsi 10 % d’acétylène dans une cloche sous laquelle se trouve une plante, on attend et on récupère le gaz pour le passer à travers la colonne. L’éthylène traverse plus vite que l’acétylène. Parce qu’il y a déjà du NH3 dans les plantes naturellement. En plus des gènes nif, communs à toutes les bactéries fixatrices d’azote, il existe une autre classe de gènes, cette fois spécifiques. Ce sont les gènes fix. Parmi les gènes nif, il en existe donc un qui code pour une protéine membranaire, qui servira de détecteur de la concentration d’oxygène. Dans la bactérie libre, l’oxygène étant très présent, elle ne s’active jamais. Il en va de même dans le cordon ou la zone II de la nodosité. Dans l’interzone II-III par contre, la protéine sent le changement et s’active, pour ainsi phosphoryler la protéine FixJ, un régulateur transcriptionnel. Comme c’était le cas avec NodD, ce régulateur se fixe à des régions promotrice activant la transcription de nifA, qui va aller activer la transcription des autres gènes nif, et FixK qui va réguler l’expression des gènes spécifiques (fix) de la bactérie. Cette différenciation de classe de gène est cruciale, car le métabolisme de la bactérie libre et celui du bactéroïde est différent. Par exemple, si les gènes nif sont nécessaires chez la bactérie libre qui doit faire son activité nitrogénase, les gènes fix, eux, qui vont servir par exemple à la synthèse des acteurs de la chaine respiratoire FixNOQP, ne le sont absolument pas si la bactérie n’est pas sous forme bactéroïde. La plante va donc apporter du sucre, sous forme de saccharose. Celui-ci est divisé en Fructose + Glucose par l’action de la Saccharose invertase. Le glucose entre en glycolyse dans le cytosol de la plante, formant du phosphoénolpyruvate, PEP. Celui-ci, que ce soit dans les cellules infectées ou les cellules adjacentes non-infectées de la nodosité, sera transformé en oxaloacétate OAA par carboxylation puis réduit en Malate. C’est sous cette forme que le sucre est transmis au bactéroïde, via des transporteurs spécifiques sur la membrane péribactéroïdienne ET bactéroïdienne, qui ont plutôt intérêt à ne pas être mutés (auquel cas la bactérie devient inutile, donc la plante dégénère la nodosité). En même temps, la plante enverra des protons dans l’espace péribactéroïdien, consommant de l’ATP, pour rendre celui-ci très acide. Ainsi, lorsque le NH3 sera formé, celui-ci pourra : • Diffuser à travers la membrane et se retrouver dans l’espace où, par l’action des protons, il pourra devenir ammonium + NH4 . C’est cet ammonium qui sort du symbiosome par un transporteur ANT (codé par la plante, la membrane péribactéroïdienne étant d’origine plantaire) et pourra être utilisé par le système d’assimilation de l’azote fixé. • Etre transformé en acides aminés (asparagine ou alanine) qui sortiront du symbiosome via des transporteurs. La plante pourra assimiler l’azote en utilisant un des deux systèmes suivants : 1. Le système d’exportation sous forme d’amides : Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 5 a. 2. Le système GS/GOGAT par lequel le glutamate donne de la glutamine (par l’action de GS), utilisant l’ammonium et consommant de l’ATP. Cette Glutamine se combine avec un α-cétoglutarate, transférant l’azote sur ce dernier pour redonner deux molécules de glutamate. Cette opération, exécutée par la GOGAT, consomme du pouvoir réducteur (NADH pour la GOGAT des racines ou Fdx pour la GOGAT des feuilles). Souvent, la GOGAT des racines est un peu plus synthétisée en cas d’infectée, mais dans certains cas une GOGAT « spécifique de la nodosité » est synthétisée. b. Le système des transaminations dans lequel le glutamate cette fois se combinera à l’OAA pour donner, sous l’action de l’aspartate aminotransférase, de l’α-cétoglutarate et de l’aspartate. Le premier des deux produits pourra alimenter le système GS/GOGAT, alors que le deuxième pourra se combiner à la glutamine par l’action de l’asparagine synthétase, consommant de l’ATP pour donner de l’AMP et du PPi, et produisant du Glutamate et de l’Asparagine. Le système d’exportation sous forme d’uréides comme chez le soja, ou il y collaboration entre cellules infectées et noninfectées. Le principe est de synthétiser d’abord du glutamate et de la glutamine, mais qu’ensuite ceux-ci entrent dans la voie de biosynthèse des purines, aboutissant à l’acide urique, qui passe dans la cellule non-infectée pour être transformé en allantoïne. Cette réaction ne peut pas avoir lieu dans une cellule infectée, puisqu’elle se déroule en présence d’oxygène dans le peroxysome (en car elle dégage de l’H2O2) qui est évidemment absent des cellules infectées pour ne pas gêner le métabolisme bactérien. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 6
