Protocole - Collège Lionel

Collège Lionel-Groulx Évolution et diversité du vivant 101-NYA-05
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LAB 5 - GÉNIE GÉNÉTIQUE
Transformation bactérienne et
résistance aux antibiotiques
1 OBJECTIFS
1. Effectuer une transformation génétique sur la bactérie Escherichia coli (E. coli) en insérant un gène de résistance
à un antibiotique et vérifier si la résistance obtenue est spécifique ou étendue à plusieurs antibiotiques.
2. Utiliser comme vecteur de transformation un plasmide porteur d’un gène de contrôle, le gène de fluorescence
de la méduse Aequorea victoria (A. victoria).
3. Appliquer des techniques d’asepsie, de culture de microorganismes et de transfert de microvolumes.
4. Réaliser une expérimentation contrôlée au moyen de groupes témoins.
5. Réaliser un travail pratique illustrant l’effet des antibiotiques, la résistance bactérienne et la régulation de
l’expression des gènes par des facteurs de l’environnement.
2 SÉCURITÉ AU LABORATOIRE
 Bactéries et ADN: éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le laboratoire.
En cas de doute, nettoyer soigneusement.
 Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux.
 Les UV affectent la peau et les yeux. Utiliser du verre protecteur.
 Comme toujours :
◦ Port du sarrau obligatoire.
◦ Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le laboratoire.
◦ Il est interdit de manger ou de boire au laboratoire.
3 PRÉPARATION AU LABORATOIRE
Séance 1. Lire le document et compléter l’Annexe 1 à l’aide de la section «Manipulations» (pages 6-7).
Séance 2. Formuler une hypothèse et complétez le tableau des résultats attendus à l’Annexe 2.

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4 INTRODUCTION
4.1 GÉNIE ET CODE GÉNÉTIQUE
En génie génétique, on utilise des outils moléculaires pour étudier et manipuler l’ADN à des fins
pratiques : thérapies anti-cancer, agriculture (OGM), pharmacologie (insuline pour les diabétiques
produites par des bactéries) [1, p. 459]. Parmi les premières manipulations génétiques, en 1972
le chercheur Stanley Cohen introduit un gène de résistance à l'antibiotique tétracycline dans des
bactéries E. coli [2].
Un code universel. En 2001, l’ADN humain a été complètement décodé [3] et contient environ 3
milliards de nucléotides (A, T, C et G) alignés en de longues séquences qui constituent les gènes.
Le code génétique serait apparu il y a 3 à 4 milliards d’années chez des bactéries, les ancêtres des
organismes actuels. Il serait quasi universel : un gène d’une espèce peut être transplanté et
décodé par une autre espèce; par exemple, un plant de tabac peut s’illuminer après avoir reçu un
gène de luciole (figure 1) [1, p. 383, 4]!
Au cours de ce laboratoire, nous introduirons des gènes dans la bactérie E. coli à l’aide d’un plasmide bactérien. Voici les 2
principaux gènes transférés:
 un gène de résistance à l’antibiotique ampicilline; nous vérifierons si la résistance acquise est spécifique à cet
antibiotique ou si la résistance acquise permet la survie face à divers antibiotiques;
 un gène de contrôle, emprunté à une méduse, qui rend vert-fluorescent sous UV; il permettra de s’assurer que la
résistance acquise provient bien de gènes transférés par le plasmide et non d’une autre source.
4.2 BACTÉRIES MULTIRÉSISTANTES
Santé publique menacée. En 1929, Alexander Flemming découvre que la moisissure Penicillium notatum produit une substance
(la «pénicilline») capable de tuer certaines bactéries [1, p. 756]. Par la suite, des centaines d’autres «antibiotiques» ont été
identifiés et ont contribué à sauver un nombre incalculable de vies humaines et animales. Cependant, leur utilisation abusive a
contribué à l’augmentation de la résistance bactérienne; des bactéries multirésistantes constituent aujourd’hui une menace
très sérieuse à la santé publique, particulièrement en milieu hospitalier où le combat est devenu très ardu contre les
staphylocoques [1, p. 532] et autres Clostridium difficile (C. difficile) ou Neisseria gonorrheae (N. gonorrheae) [5, 6]
Évolution de la résistance. Lorsqu’une population de bactéries est exposée à un antibiotique (ex : dans le corps d’un malade,
dans un élevage porcin, etc.), les bactéries sensibles meurent mais il suffit de quelques bactéries plus résistantes qui survivent
et se multiplient pour créer une nouvelle population de bactéries résistantes; c’est un processus de sélection naturelle [1, p.
534].
Action des antibiotiques. Les antibiotiques agissent principalement sur la paroi bactérienne (ex : pénicilline et ampicilline) [1,
p. 644] ou sur la fabrication des protéines (ex : kanamycine) [7], mais il existe plusieurs autres modes d’action [8].
Acquisition et modes de résistance. Comment une bactérie donnée peut-elle devenir résistante? Une simple mutation dans
l’ADN bactérien peut modifier une des cibles de l’antibiotique qui est alors neutralisé. Mais le plus souvent, elle acquiert un
nouveau gène d’une bactérie déjà résistante; on parle alors de recombinaison génétique [1, p. 649]. Il existe plusieurs types de
gènes de résistance et ils peuvent être transférés de diverses manières. Par exemple, des bactéries résistantes possèdent un
gène codant pour un enzyme qui détruit l’antibiotique [1, p. 650]. Ces gènes spéciaux ont été élaborés au cours de l’évolution
des bactéries. Souvent, ils ne font pas partie de leur chromosome, ils sont plutôt inclus dans de petits anneaux d’ADN appelés
«plasmides» que seules certaines bactéries possèdent. Et ces plasmides peuvent être copiés et transmis à d’autres bactéries!
Transmission via les plasmides. Un plasmide est minuscule par rapport aux bactéries, environ 116,000 fois plus petit si on
compare E. coli et le plasmide pGLO! Une même bactérie peut donc posséder plusieurs plasmides. Les plasmides peuvent être
transférés de diverses façons. Le mécanisme le plus simple est appelé une «transformation» [1, p. 649]. Lorsqu’une bactérie
FIGURE 1 – PLANT DE TABAC
LUMINEUX [4]

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meurt, l’ADN libéré peut être absorbé par une autre bactérie qui devient ainsi «transformée». Ce mécanisme a vite été récupéré
par le génie génétique pour introduire des gènes étrangers. Il suffit d’isoler un gène d’intérêt, de l’insérer dans un plasmide
bactérien qui sert alors de «vecteur» et de le placer en présence de la bactérie à transformer [1, p. 460; fig. 20.2]! Simple comme
bonjour, ou presque.
4.3 LE PLASMIDE «PGLO», UN OUTIL BRILLANT
Divers plasmides sont maintenant disponibles sur le marché. Le plasmide «pGLO» (figure 2) contient quelques gènes dont trois
sont d’intérêt pour ce labo:
 un gène de résistance Ampr codant pour l’enzyme β-lactamase qui détruit
l’ampicilline [7], un antibiotique dérivé de la pénicilline;
 un gène de contrôle GFP emprunté à la méduse Aequorea victoria codant pour une
protéine fluorescente; il permet de vérifier visuellement que le plasmide a bien été
introduit dans la bactérie;
 un 2e gène de contrôle AraC. En absence d’arabinose dans le milieu de croissance, le
gène GFP n’est pas transcrit (figure 3) tandis qu’en présence de la molécule
arabinose dans le milieu de croissance, il déclenche l’expression du gène GFP (figure
4). Ce type de gène s’appelle un «promoteur»; il contribue dans notre expérience à
vérifier l’introduction du plasmide dans la bactérie.
FIGURE 2 - PLASMIDE PGLO
FIGURE 3- EXPRESSION GÉNIQUE SANS LA PRÉSENCE D’ARABINOSE
DANS LE MILIEU DE CROISSANCE. « RNA POL » DÉSIGNE
L’ENZYME ARN POLYMÉRASE.
FIGURE 4- EXPRESSION GÉNIQUE AVEC LA PRÉSENCE D’ARABINOSE
DANS LE MILIEU DE CROISSANCE. « RNA POL » DÉSIGNE
L’ENZYME ARN POLYMÉRASE.

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5 QUESTION EXPÉRIMENTALE ET HYPOTHÈSE
QUESTION EXPÉRIMENTALE
Pour qu’une bactérie devienne «multirésistante», c’est-à-dire résistante à plusieurs antibiotiques, doit-elle acquérir plusieurs
gènes ou est-ce qu’un seul gène suffit? Compte tenu du matériel que nous possédons pour cette expérience, la question
pourrait s’énoncer plus précisément de la manière suivante:
«La bactérie E.coli placée en présence d’un plasmide porteur d’un gène de résistance à l’ampicilline deviendra-t-elle résistante
uniquement à l’ampicilline ou aussi à d’autres antibiotiques comme la kanamycine, l’amoxicilline ou la céfixime?»
6 DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE
EN RÉSUMÉ
1. Pour tenter de répondre à la question expérimentale, nous allons transformer des bactéries E. coli (provenant d’une
souche compétente, c’est-à-dire plus perméable aux plasmides) avec le plasmide pGLO et vérifier si elle devient
résistante à l’ampicilline, à la kanamycine, à l’amoxicilline et à la céfixime.
2. Nous obtiendrons nos données en mesurant le nombre d’unités formant colonies (UFC) sur chaque gélose. L’UFC s'agit
de l'unité utilisée en microbiologie permettant de dénombrer les bactéries vivantes. Une UFC correspond à une colonie
sur la gélose; elle est une bonne approximation du nombre de bactéries vivantes ayant été ensemencées sur une
gélose.
6.1 MÉTHODE D’ÉVALUATION DE LA RÉSISTANCE
La résistance des bactéries sera évaluée en les plaçant sur des «géloses» (milieu
nutritif sous forme de gel) contenant un antibiotique. Si les bactéries sont
résistantes, elles se multiplieront et après quelques heures d’incubation elles
formeront des «colonies» visibles à l’œil nu (figure 5a). Si au contraire elles sont
sensibles, elles mourront et aucune croissance ne sera observée (figure 5b). La
résistance aux quatre antibiotiques suivants sera testée : ampicilline,
amoxicilline, céfixime et kanamycine.
6.2 UNE EXPÉRIENCE RIGOUREUSE POUR DES RÉSULTATS SOLIDES
En sciences, lorsque vient le temps de démontrer expérimentalement l’effet d’une quelconque variable, il est important de
pouvoir isoler l‘effet de la variable étudiée des autres facteurs pouvant affecter l’expérience.
Dans le cadre de notre expérience, il s’agit ici de démontrer que les nouvelles capacités acquises par les bactéries transformées
(résistance à l’ampicilline et fluorescence sous UV) sont strictement attribuables aux plasmides ajoutés. Pour réussir à le faire,
nous aurons à faire deux expériences en parallèle : une sur un groupe expérimental et la même sur un groupe témoin. Les deux
groupes seront traités exactement de la même manière, mais seules les bactéries du groupe expérimental recevront un
plasmide. Ainsi, nous allons nous assurer que l’effet observé (la résistance à un antibiotique ou la fluorescence) est bel et bien
relié à une seule variable (l’insertion d’un gène) et non à des facteurs non voulus [1, p. 23].
Les bactéries du groupe témoin (sans plasmide) ne devraient pas croître en présence d’un antibiotique, comme dans la figure
5b. Ce résultat permettra de s’assurer que les bactéries utilisées pour l’expérience sont sensibles aux antibiotiques et non pas
naturellement résistantes.
FIGURE 5 - CROISSANCE DE BACTÉRIES SUR DES GÉLOSES
CONTENANT UN ANTIBIOTIQUE

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En plus de la formation d’un groupe témoin, les résultats obtenus peuvent être encore plus valables si on est en mesure
d’effectuer certains contrôles.
A. CONTRÔLE DE LA VITALITÉ DES BACTÉRIES
Si les bactéries témoin ne croissent pas sur une gélose, est-ce vraiment dû à leur sensibilité aux antibiotiques? Par
exemple, pourrait-il y avoir des traces d’éléments chimiques nuisibles dans une des solutions? Si les bactéries meurent
en cours d’expérimentation, l’absence de croissance observée ne serait pas due aux antibiotiques. Donc, idéalement,
il faut s’assurer que les bactéries restent bien vivantes tout au long du processus.
Méthode: Déposer des bactéries sur des géloses SANS ANTIBIOTIQUE (LB). Si elles sont bien vivantes, elles
devraient croître.
B. CONTRÔLE DE L’INSERTION DU PLASMIDE
Si les bactéries du groupe expérimental croissent en présence d’un antibiotique,
comment être certain que c’est dû au plasmide, et non à une contamination par une
bactérie déjà résistante? Ou encore à une mutation induite par des agents chimiques?
On ne peut tout exclure, mais on peut tout au moins vérifier que les bactéries
résistantes ont bel et bien reçu des gènes du plasmide. Comment? En ajoutant du
sucre arabinose à la gélose. L’arabinose permet d’activer le gène «promoteur» du
plasmide, lequel active à son tour le gène de fluorescence (permettant la construction
de protéines fluorescentes) et les bactéries sont alors fluorescentes sous UV (fig. 6).
Méthode : Ajouter de l’ARABINOSE aux géloses contenant un antibiotique. Seules
les bactéries possédant un plasmide devraient devenir fluorescentes.
6.3 PRINCIPALES ÉTAPES DE LA MÉTHODE DE TRANSFORMATION
1. Mélange des bactéries avec le plasmide et conditionnement. Des bactéries E. coli compétentes de souche DH5 sont
placées en présence du plasmide pGLO et subissent un «conditionnement» : elles
baignent dans une solution d’ions Ca++ qui neutralisent les charges négatives des
plasmides et de la membrane des bactéries; ceci permet aux plasmides de s’approcher
et de se lier aux bactéries. Cette opération est effectuée sur glace pour stopper toute
activité bactérienne, incluant la destruction d’ADN étranger par des enzymes.
2. Choc thermique. Les bactéries sont ensuite soumises à un changement brusque de
température, ce qui facilite la pénétration du plasmide. La durée du choc thermique est
critique et varie d’un type de plasmide à l’autre. Mais si sa durée est trop longue, beaucoup
de bactéries mourront car les membranes portant les ions Ca++ sont fragilisées.
3. Récupération et expression génique. Puis les bactéries sont incubées à 37ºC dans un bouillon nutritif.
Elles croissent et, possiblement après un certain temps (délai d’expression phénotypique [10]),
activent les nouveaux gènes reçus avec le plasmide. Elles deviennent aptes à produire de nouvelles
protéines dont l’enzyme β-lactamase.
4. Étalement des bactéries sur géloses. Pour vérifier la résistance acquise, les bactéries sont
ensemencées sur des géloses contenant un antibiotique et incubées à 37ºC pendant 24 heures.
FIGURE 6 - FLUORESCENCE DES
COLONIES D’E. COLI TRANSFORMÉES
SOUS L’INFLUENCE DE LA LUMIÈRE UV