Université Victor Ségalen Bordeaux

Université Victor Ségalen Bordeaux-2
UFR Sciences de la Vie
Licences de Biochimie
UE Réactivité et Catalyse enzymatique
Contrôle continu 22 Mars 2004
Amphi 4, 8-10
2 heures
Documents non autorisés
1 . La phosphatase alcaline catalyse l’hydrolyse des esters organiques de l’acide phosphorique.
Cette réaction, étudiée à pH 9,5, est inhibée par le phosphate inorganique.
R – O P + H2O Æ
R-OH + Pi
Le graphique doubles-inverses ci-dessous indique que la Vmax mesurée diminue en présence de
l’inhibiteur, tandis que le Km augmente.
X sans inhibiteur
1/v
O 1 mM inhibiteur
● 2 mM inhibiteur
1/[s]
Ecrire l’équation de Michaelis qui décrit ce type d’inhibition (mixte).
Quelle sera la dépendance des paramètres cinétiques (Vmax, Km, Vmax/Km) en fonction de la
concentration d’inhibiteur ? On considère [ I ] >> [ E ]t ;
2. On a mesuré l’affinité du Pi pour la phosphatase alcaline (Kd). On fait des mesures dans la
gamme de pH 4 à 10. On a observé une bonne fixation à pH basique tandis que le Pi se fixe mal à
pH acide.
Exprimer la concentration de complexe en fonction du Kd, de la concentration totale
d’enzyme et de phosphate ( [ Pi ] >> [ E ]t ), du pKa du phosphate et de la [ H+ ].
Montrer que le Kd est fonction linéaire de [ H+ ].
On trouve que le Kd est similaire (identique si pas d’erreurs) à une des Ki de l’exercice 1.
Laquelle ?
L’enzyme n’est pas protonée ni déprotonée dans la gamme de pH étudiée.
Les pKa de l’acide phosphorique sont pKa1 = 2.1, pKa2 = 7.2, pKa3 = 12.6
Université de Bordeaux2
UFR Sciences de la Vie
Le 26 Mai 2004
3 heures (14-17)
UE : Réactivité et catalyse enzymatique
1ère session
Documents non autorisés
Attention à la rédaction: seules les réponses claires, concises mais complètes seront prises en compte!
Par exemple, même si vous arrivez au bon résultat au point 1A, mais sans explications, la notation sera
zéro. L’enzymologie n’est pas une branche de l’algèbre !
1. Cinétique enzymatique. (7 points)
On considère une réaction à un substrat, catalysée par une enzyme.
k1
E + S
k2
ES
E + P
Schéma 1
k-1
1a. Déduire de ce schéma réactionnel l’équation de Michaelis, en précisant les conditions expérimentales,
les hypothèses et les approximations utilisés.
1b. Le graphique ci-dessus décrit la variation d’énergie libre durant la réaction. A partir de ce graphique,
préciser si k1 < k2 ou k1 > k2 (expliquer). Quelle est l’étape limitant la vitesse de la réaction? Pourquoi
dans le Schéma 1 la réaction est écrite comme irréversible, tandis que dans le graphique elle apparaît
réversible ? Quelle est l’allure du graphique d’énergie libre de la réaction non-catalysée ?
1c. Quelle est la relation entre la constante d’équilibre de la réaction et les paramètres cinétiques ?
2. Structure du site actif le l’Arginine kinase. ( 7 points) L’arginine kinase est une enzyme présente
chez les invertébrés mais pas chez les vertébrés. La structure du complexe Arginine kinase-ADP-NO3-Arginine a été déterminée par la diffraction des rayons X.
Page 1
2a. Ajouter les atomes d’hydrogène dans la Figure 1. La structure a été déterminée à pH 7. Nommez la
nature de chacune des interactions marquées par des traits pointillés. Les distances sont indiquées en
angstroms.
2b. Dans la Figure 2, pourquoi l’enzyme fixe dans le site actif l’ion nitrate entre l’ADP et l’atome d’azote
de l’arginine? En d’autres mots, de quelle espèce cette structure est-elle un modèle?
2c. Quelle est la nature probable de l’atome/l’ion marquée X dans la Fig. 2 ?
2d. L’activité spécifique de l’arginine kinase est de 200 U/mg. Calculer son kcat. La masse moléculaire de
l’enzyme est 42500.
3. Questions diverses ( 6 points).
3a. Ecrire les formules développées de deux analogues non-hydrolysable de l’ATP. Quelle en est leur
utilité au laboratoire.
3b. Ecrire les formules développées du NAD+ et du lactate, en indiquant quel atome d’hydrogène du
lactate est transféré sur quelle position du NAD+ dans la réaction catalysée par la lactate
déshydrogénase ?
3c. Ecrire la formule développée du peptide PATRICH à pH 5.0 . Les pKa se trouvent à page 4.
NB. Faites l’approximation (raisonnable) que les groupements ionisables sont complètement
protonés/déprotonés si le pH = pKa ± 1 .
3d. Quelle caractéristique structurale est obligatoire pour les enzymes allostériques ?
Page 2
O
O
O
N
N
N
N
O
N
O
O
O
O
N
N
O
Fig. 1. L’arginine, un des substrats de la réaction catalysée par l’Arginine kinase, dans le site actif.,
appellée DAR403 dans cette image. Les interactions les plus importantes sont indiquées (les
distances en anstroms).
.
Fig. 2. Structure de l’état de transition de la réaction calatysée par l’Arginine kinase.
Page 3
Valeurs de pKa des groupes ionisables les peptides et les protéines
Carboxyl terminal
Acide glutamique et aspartique
Histidine
Amine terminale
Cystéine
Tyrosine
Lysine
Arginine
3.1
4.4
6.5
8.0
8.5
10.0
10.0
12
Abreviations utiliéees pour les acides aminés .
Acide amine
Abreviation
a trois lettres
Alanine
Arginine
Asparagine
Acide aspartique
Cystéine
Glutamine
Acide glutamique
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenylalanine
Proline
Serine
Threonine
Tryptophane
Tyrosine
Valine
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gin
Glu
Gly
His
lle
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Symbole
a une lettre
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Page 4
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UFR Sciences de la Vie
Le 7 Septembre 2004
3 heures (8-11)
UE : Réactivité et catalyse enzymatique
2ère session
Documents non autorisés
Attention à la rédaction: seules les réponses claires, concises mais complètes seront
prises en compte!
1. Cinétique enzymatique. (7 points)
On considère une réaction à un substrat, catalysée par une enzyme, en la présence d’un inhibiteur.
k1
E + S
I
k-1
k2
ES
E + P
Schéma 1
Ki
EI
1a. Comment peut-on déterminer expérimentalement s’il s’agît d’un inhibiteur réversible ?
1b. Quel type d’inhibition correspond à ce schéma ?
1c. Déduire de ce schéma réactionnel l’équation de Michaelis, en précisant les conditions expérimentales,
les hypothèses et les approximations utilisés.
1d. Quel paramètre cinétique sera modifié en présence de l’inhibiteur ?
1e. Les Km et le Ki sont-elles des constantes de dissociation ?
Le mécanisme réactionnel des protéases à sérine (7 points)
2a. Quels sont les acides aminés essentiels dans le site actif de cette classe de protéases ?
2b. Décrire en détails les étapes de ce mécanisme
2c. Ecrire la formule d’un inhibiteur irréversible de cette classe de protéases.
2c. Quelles autres enzymes ont un mécanisme similaire ?
2d. Mentionnez d’autres classes de protéases, ayant un autre type de mécanisme.
TSVP
Page 1
3. Questions diverses ( 6 points).
3a. L’activité spécifique d’une enzyme monomérique est de 1000 U/mg. Calculer son kcat. La masse
moléculaire de l’enzyme est 22500.
3b. Ecrire la formule développée du peptide CLAIRE à pH 5.0 . Les pKa se trouvent à page 2.
NB. Faites l’approximation que les groupements ionisables sont complètement déprotonés /protonés si le
pH = pKa ± 1 .
3c. Donner une méthode de dosage de l’hexokinase.
3d. Définition de l’état de transition.
Valeurs de pKa des groupes ionisables dans les peptides et les protéines
Carboxyl terminal
Acide glutamique et aspartique
Histidine
Amine terminale
Cystéine
Tyrosine
Lysine
Arginine
3.1
4.4
6.5
8.0
8.5
10.0
10.0
12
Abreviations utiliéees pour les acides aminés .
Acide amine
Abreviation
a trois lettres
Alanine
Arginine
Asparagine
Acide aspartique
Cystéine
Glutamine
Acide glutamique
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenylalanine
Proline
Serine
Threonine
Tryptophane
Tyrosine
Valine
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gin
Glu
Gly
His
lle
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Symbole
a une lettre
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
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