Diapositive 1

La cellule
• Taille : de l’ordre du micromètre (10-6m)
• 2 types de cellules
– Cellule procaryote (bactéries)
– Cellule eucaryote : animale, végétale
Cellule procaryote
• Vie unicellulaire
• Noyau non délimité par une membrane
• Présence possible de pili, flagelle, capsule
Cellule Eucaryote
•
•
Végétale ou Animale
Vrai noyau délimité par une membrane
Composition
•
•
•
•
Membrane plasmique
Cytosol
Noyau + enveloppe nucléaire
Organites :
– Mitochondries
– Réticulum endoplasmique (lisse et rugueux)
– Appareil de Golgi
– Ribosomes
– Endosomes, lysosomes
Organites
Fonction principale
Mitochondrie
Apporte l’énergie à la cellule
Ribosomes
Permettent l’allongement des peptides
RE
Synthèse, translocation et adressage de protéines
Glycosylation (ajout de molécules de sucres sur les
protéines)
Synthèse des lipides
Stockage du calcium et autres substances
Appareil de Golgi
Transport des protéines
Glycosylation des protéines
Tri et adressage des protéines
Stockage du calcium
Endosome et lysosome
Dégradation de protéines, lipides, sucres, acides
nucléiques…
Noyau
Contient l’information génétique
Méthodes d’observation
I. Microscopie optique
(MO):
– Grossissement ≈ x1000 à
x2000
– Photonique = Lumière
traverse l’objet
– Hors souvent objet pas
transparent !
– Nécessite donc la
préparation de
l’échantillon
Méthodes d’observation
•
Préparation de l’échantillon au MO :
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
•
Fixation (formol…)
Déshydratation (bains d’alcool croissant)
Inclusion (Paraffine)
Coupe (5 à 10 µm)
Réhydratation (bains d’alcool décroissant)
Coloration (MGG, HE…)
Observation au microscope optique
Autres types de microscopes optiques:
–
–
–
–
–
–
–
Stéréomicroscope
Microscope confocal
Microscope à lumière polarisée
Microscope à fond noir
Microscope à contraste de phase
Microscope inversé
Microscope UV…
Méthodes d’observation
II. Le microscope électronique (ME):
– Utilise un faisceau d’électrons.
– Plus puissant que le microscope optique.
– 2 Types :
• MET (x 500 000)
• MEB (x 100 000)
– Mais plus contraignant:
• Coupe plus fine (50 nm)
• Sous vide
• Coloration spécifique
Méthodes d’observation
• Préparation de l’échantillon au MET :
1)
2)
3)
4)
5)
6)
Fixation (Glutaraldéhyde + Acide osmique…)
Déshydratation (bains d’alcool croissant)
Inclusion (Résines époxy)
Coupe (5 à 10 nm)
« Coloration » (métaux lourds…)
Observation
• Préparation de l’échantillon au MEB :
1)
2)
3)
4)
5)
Fixation (Glutaraldéhyde + Acide osmique…)
Déshydratation (alcool…)
Gonflage: CO2 liquide -> gazeux
« Coloration » (Ombrage métallique…)
Observation
Fractionnement cellulaire
• = Broyage puis centrifugation des cellules.
– Isole les différents organites en grande quantité.
– Permet leur étude biochimique (composition, métabolisme…)
– Première étape = homogénéisation
• Désintègre la membrane plasmique sans endommager les organites
– Deuxième étape = centrifugation
•
•
•
•
Isole le culot (sédimenté) et le surnageant (non sédimenté)
On récupère le culot
On recommence la centrifugation (+vite) avec le surnageant
Répéter ce procédé en augmentant à chaque fois la vitesse de centrifugation
permet d’isoler des constituants de + en + petits
Cultures cellulaires
•
•
•
•
•
Milieux plus ou moins complexes
Permet l’étude in vitro des phénomènes cellulaires
Technique délicate (dépend composition du milieu, pH, température…)
A permit beaucoup de découvertes
Mais résultats parfois difficilement transposable in vivo
Immunomarquage
Il permet de visualiser différents types de
molécules.
Ligands : molécules qui ont une grande
affinité et spécificité avec les molécules
recherchées.
La fixation du ligand sur la molécule
recherchée est visualisée par d’autres
molécules appelées marqueurs.
Dans le cas de l’immunomarquage, le
ligand est toujours un anticorps.
Marqueur
(Anticorps Ac)
Ligand
(Anticorps Ac)
Molécule recherchée
(antigène Ag)
Immunomarquage direct
Technique en un seul temps de réaction : le marqueur
est couplé au ligand quel qu’il soit.
Prenons une protéine P d’une souris et injectons la
chez un lapin.
→ fabrication d’Ac anti P chez le lapin.
injection
marquage
Protéine
P
souris
lapin
Ac anti P
Ac anti P marqué
Immunomarquage direct
Principe de l’immunomarquage direct :
Ag P
+
anti P marqué
(Ac de lapin)
lavages
Complexe Ag/Ac marqué
visible
Elimination des Ac non fixés
Immunomarquage indirect
Technique en deux temps :
• fixation du ligand au niveau de la cellule
• fixation du marqueur
1)
Ag P
+
Anti P
(Ac de lapin)
lavages
Complexe Ag/Ac
invisible car non
marqué
Elimination des Ac non fixés
Immunomarquage indirect
2)
Anti Ac de lapin commercialisé
(dirigé contre tous les Ac de lapin,
pas seulement contre les Ac P)
lavages
+
Complexe Ag/Ac
invisible car non
marqué
Complexe visible +++
Elimination des Ac non fixés
Ultracentrifugation
Technique de fractionnement
Principe :
Vitesse très élevée
La vitesse de sédimentation d’une structure cellulaire dépend de :
• sa taille
• sa densité
• sa forme
Ultracentrifugation différentielle
• Centrifugations de plus en plus rapides et de plus en plus
prolongées
• Pas de séparation individuelle de tous les éléments
• Seuls les composés de taille et de densité différentes sont séparés
Ultracentrifugation en gradient de densité
1) En vélocité
Séparation des organites en fonction de leur vitesse de
sédimentation.
Attention : l’ultracentrifugation est effectuée pendant un temps
déterminé. Si le temps est trop long, tous les composés se
déposent dans le culot.
2) A l’équilibre
Principe :
Un composant cellulaire atteint une position où la densité de la
solution est égale à sa propre densité.
Les composants restent à la même place, à l’équilibre, quelque
soit le temps de centrifugation.
Autohistoradiographie
Principe :
Mise en évidence
• du lieu de biosynthèse des macromolécules
• de la migration des macromolécules au sein de la cellule
Mise en présence des cellules
• utilisation de précurseurs métaboliques radiomarqués
• in vitro ou in vivo
Marquage radioactif d’une molécule :
• Utilisation de radioisotopes
1
3
• Exemple : Remplacement de H par H
Molécule non
radiomarquée
(1H)
Molécule
radiomarquée
(3H)
Emission d’un
rayonnement β
Autohistoradiographie
Méthode du « Pulse-Chase » :
Deux temps :
• Incubation brève dans un milieu radioactif = Pulse
Remarque: Toutes les macromolécules synthétisées sont
radioactives.
• Remplacement du milieu radioactif par un milieu non radioactif = Chase
Mécanisme :
Préparation recouverte d’une émulsion photographique.
Transformation : cristaux AgBr → Ag métal
Cristal d’AgBr
β
β
Gélatine
Emulsion photographique
3
H
Echantillon (cellules
marquées au 3H)
Support (lame de verre ou grille
recouverte de carbone pour la ME)
LES MEMBRANES BIOLOGIQUES.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Définition
Aspect
Structure moléculaire
La mosaïque fluide
Les rôles de la membrane
Les différenciations de la membrane
2 types de membranes biologiques :
• la membrane plasmique
• les membranes intracellulaires
Les deux sont en relations (Cf. endocytose)
La membrane plasmique = en périphérie de la cellule
= frontière entre le Milieu intracellulaire (MIC)
et le milieu extracellulaire(MEC)
Elle délimite la cellule.
La membrane plasmique n’est pas qu’une barrière, elle
permet également les échanges. Ex : grâce aux RECEPTEURS.
 Au microscope optique :
membrane = une ligne qui correspond à la membrane plasmique + ce qu’il y a autour
 Au microscope électronique (aspect diffère selon la technique employée) :
• trilamellaire (en coupe transversale)
• aspect particulaire (en coupe tangetielle)
• 2 hémi-membrane E + P (en cryofracture)
 Les lipides forment la bicouche
 Les protéines permettent de donner sa fonction à la membrane (ex : rôle de récepteurs,…)
 Les glucides ne sont retrouvés qu’à l’extérieur et sont toujours associés soit aux
Pn (protéines), soit aux Lp (lipides).
 Les LIPIDES :
= molécule amphipathique (possèdent un pôle hydrophile et un pôle hydrophobe). Le pôle hydrophile
se tourne vers l’eau, et le pôle hydrophobe se tourne vers le « gras »!
=> Formation en micelle
=> Formation en bicouche
 Le cholestérol :
= petite molécule rigide. Elle s’intercale entre les lipides des membranes
La membrane est moins perméable aux petites molécules hydrophiles
Cholestérol : +++++ ds membrane plasmique
++ ds les membranes intracellulaires
 Les GLUCIDES : ils sont toujours associés:
• aux protéines = Glycoprotéines
• aux lipides = Glycolipides
 Les Glucides ne sont jamais en contact avec le cytoplasme
Sur la face externe de la membrane plasmique ou sur la face interne de la membrane
des organites.
 Les PROTEINES : 2 types
• intrinsèque = liées à la membrane par des liaisons de fortes énergie
• extrinsèque = liées à la membrane par des liaisons de faibles énergie
 Plus il y a de protéines dans une membrane, plus celle-ci est active.
Ex : Mb d’un neurone (simple rôle de conduction de l’influx nerveux) : 20% de Pn
Mb hépatocyte (rôle +++ de transport) : 50% de Pn
 Les éléments de la membrane ne sont pas figés, ils bougent.
 Les lipides ont des mouvements de diffusion latérale, de rotation, de
flip-flop (= changement de feuillet)
 Les protéines ne peuvent se déplacer que dans le plan de la
membrane.
1. Barrière sélective.
 Imperméable aux substances hydrophiles (ms passage grâce aux canaux, pompes,…), petites
molécules hydrophiles passent.
 Perméable aux substances hydrophobes
=> Les membranes déterminent des compartiments!!!!
2. Support de charges électriques
 Protéines et perméases -> maintient d’un potentiel de repos au niveau de la membrane des cellules.
Différence de -70 mV entre feuillet externe et feuillet interne de la membrane.
 Ce phénomène consomme de l’énergie => existe donc que tant que la cellule est vivante!
3. Support de réaction enzymatique.
4. Permet la réception et le transfert de messages.
 Grâce aux récepteurs (=Rc)
 1er messager dans le MEC = le ligand => fixation au récepteur => action du second messager
 Si ligand hydrophobe = traverse la membrane (dc Rc cytosolique)
 Si ligand hydrophile ne peut traverser => Rc membranaire
 Ce sont des déformations permanentes de la membrane qui permettent à la cellule de
s’adapter à ses fonctions.
1. ABSORPTION
Pour la faciliter, on va augmenter la surface cellulaire
 Des microvillosités (cytosquelette d’actine) ou des pseudostéréocils (pas
de cytosquelette organisé)
2. MOBILITE
Déformation = cil vibratile ou flagelle (cytosquelette = microtubules)
3. CONTACTS INTERCELLULAIRES
= les jonctions.
Ex : jonctions serrées pour fonction d’étanchéité
Jonction communicantes pour synchronisation des cellules
Etc,….