Recommandations pour la (bonne) pratique du diagnostic

doi:10.1684/abc.2012.0704
305
Pour citer cet article : Jouanolle AM, Gérolami V, Ged C, Grandchamp B, Le Gac G, Pissard S, Rochette J, Aguilar-Martinez P. Recommandations pour la (bonne) pratique
du diagnostic moléculaire de l’hémochromatose liée au gène HFE*.Ann Biol Clin 2012 ; 70(3) : 305-13 doi:10.1684/abc.2012.0704
Article original
Ann Biol Clin 2012 ; 70 (3) : 305-13
Recommandations pour la (bonne) pratique
du diagnostic moléculaire de l’hémochromatose
liée au gène HFE *
Synthèse d’une enquête réalisée auprès du réseau
national des laboratoires pratiquant le diagnostic
de maladies rares du métabolisme du fer
Molecular diagnosis of HFE mutations in routine laboratories
Results of a survey from reference laboratories in France
Anne-Marie Jouanolle1
Victoria Gérolami2
Cécile Ged3
Bernard Grandchamp4
Gérald Le Gac5
Serge Pissard6
Jacques Rochette7
Patricia Aguilar-Martinez8
1Laboratoire de génétique moléculaire,
Centre de référence des surcharges
en fer rares d’origine génétique,
CHU Pontchaillou, Rennes
<[email protected]>
2Laboratoire de biologie moléculaire,
CHU Conception, Marseille
3Laboratoire de biochimie, CHU
Bordeaux, Hôpital Pellegrin, Inserm
U1035 Université V Segalen Bordeaux 2,
Bordeaux
4Service de génétique APHP, Université
Denis Diderot, CHU Xavier Bichat, Paris
5Laboratoire de génétique moléculaire et
d’histocompatibilité, CHRU de Brest -
Hôpital Morvan, Université de Bretagne
Occidentale, Inserm U613, Brest
6Laboratoire de biochimie et de
génétique, GH Henri Mondor-Chenevier,
UPEC (Université Paris Est Créteil),
Créteil
7Laboratoire de génétique moléculaire,
Inserm U 925, CHU d’Amiens
8Laboratoire d’hématologie, Hôpital
Saint Eloi, CHU de Montpellier
Article rec¸u le 6 décembre 2011,
accept´ e le 16 février 2012
Résumé. L’hémochromatose liée au gène HFE (hémochromatose HFE) ou
hémochromatose de type 1, est une maladie génétique à transmission autoso-
mique récessive caractérisée par une surcharge en fer progressive de l’organisme
se manifestant habituellement chez l’adulte. Le gène HFE, localisé sur le bras
court du chromosome 6 (6p21.3), code une protéine qui joue un rôle essentiel
dans le métabolisme du fer en modulant la production d’hepcidine par le foie.
La mutation p.Cys282Tyr, à l’état homozygote, explique environ 80 % des cas
d’hémochromatose en France. Le test génétique est l’examen clé pour confir-
mer le diagnostic d’hémochromatose HFE. Une enquête sur les pratiques de huit
laboratoires référents franc¸ais a été réalisée. Les principaux enseignements de
cette enquête sont les suivants : 1) la mutation p.Cys282Tyr doit être recherchée
en première intention pour établir le diagnostic d’hémochromatose HFE, suivant
ainsi les recommandations de la Haute autorité de santé (HAS) qui, en 2005,
a considéré que seule l’homozygotie pour la mutation p.Cys282Tyr associée,
au minimum, à une élévation du coefficient de saturation de la transferrine per-
mettait d’établir le diagnostic d’hémochromatose HFE ; 2) en association avec
la mutation p.Cys282Tyr (génotypes hétérozygotes composites), les variants
p.His63Asp et p.Ser65Cys peuvent contribuer à la survenue d’une surcharge en
fer modérée ; 3) la réalisation d’une enquête familiale après la détection d’un
sujet homozygote pour la mutation p.Cys282Tyr devrait être systématique.
Mots clés : hémochromatose, HFE, diagnostic, mutation, fer
Abstract. HFE-related hemochromatosis (HFE hemochromatosis) or type 1
hemochromatosis is an autosomal recessive disease characterized by progres-
sive iron overload usually expressed in adulthood. The HFE gene, located on
the short arm of chromosome 6 (6p21.3), encodes a protein that plays a crucial
∗Origine du travail. Travail à l’initiative du groupe de veille “fer et hémochromatose” de la SFBC,
sous-groupe “point de vue du biologiste : biologie moléculaire” (Anne-Marie Jouanolle, Victoria
Gerolami, Patricia Aguilar Martinez (coordonnateur)). Les autres membres du groupe de veille
SFBC sont par ordre alphabétique : Carole Beaumont, Muriel Bost, Joël Corberand, Gérard Dine,
Isabelle Fajardy, Véronique David, Henri Michel, Daniel Seifer, Jérôme Pfeffer, Martine Ropert-
Bouchet, Victor Sieso, Catherine Vallat, Jean-Pierre Vinel.
Tirés à part : A.-M. Jouanolle

306 Ann Biol Clin, vol. 70, n◦3, mai-juin 2012
Article original
role in iron metabolism by modulating hepcidin synthesis in the liver. Homo-
zygosity for the p.Cys282Tyr mutation accounts for nearly 80% of cases of
hemochromatosis in France. Genetic testing is the key investigation to confirm
the diagnosis of HFE hemochromatosis. A survey on routine practices was car-
ried out among the eight reference laboratories of the French national network
on genetic iron disorders. The main findings from this survey are as follows:
1) the p.Cys282Tyr mutation must be searched for as an initial step to esta-
blish the diagnosis of HFE hemochromatosis. This is in agreement with the
recommendations of the French Health Authority (HAS) published in 2005.
In these recommendations, homozygosity for the p.Cys282Tyr mutation with
at least elevated transferrin saturation, is considered the only genotype that
confirms of the diagnosis of HFE hemochromatosis; 2) in combination with the
p.Cys282Tyr mutation (compound heterozygous genotypes), the p.Ser65Cys
and the p.His63Asp variants may contribute to the occurrence of mild iron over-
load; 3) family screening is mandatory following the detection of homozygous
individuals for the p.Cys282Tyr mutation.
Key words: hemochromatosis, HFE, diagnosis, mutation, iron
En 1935, Sheldon formulait l’hypothèse que l’hémo-
chromatose, décrite par Trousseau en 1865, était un
trouble inné du métabolisme du fer. En 1975, Simon et
al. démontraient l’existence d’une association entre le
gène de l’hémochromatose et le locus HLA-A sur le bras
court du chromosome 6, ainsi que le mode de transmission
autosomique récessif de la maladie [1, 2]. Il fallut attendre
1996 pour que Feder et son équipe identifient le gène
responsable de l’hémochromatose [3]. Le clonage du gène
HFE et la mise en évidence d’une mutation principale, la
substitution d’une cystéine par une tyrosine en position 282
de la protéine HFE, permettait enfin la mise en place d’un
test génétique qui allait contribuer à faciliter le diagnostic
de la maladie. Cette mutation, connue sous le nom de
C282Y [1], doit être actuellement dénommée p.Cys282Tyr
selon la nomenclature de l’HGVS (Human genome varia-
tion society ; http://www.hgvs.org). A l’état homozygote
(deux allèles mutés) la mutation p.Cys282Tyr explique
près de 80 % des cas d’hémochromatose en France.
Le gène HFE code une protéine qui joue un rôle essentiel
dans le métabolisme du fer en modulant la production, par
le foie, d’une hormone régulatrice, l’hepcidine [4]. A l’état
homozygote, la mutation p.Cys282Tyr est responsable
d’une diminution de la synthèse hépatique d’hepcidine à
l’origine de la surcharge en fer par un double mécanisme :
augmentation de l’absorption duodénale du fer et aug-
mentation de la libération du fer macrophagique dans le
courant sanguin. La surcharge en fer primaire, induite par
cette mutation du gène HFE, est appelée hémochromatose
HFE ou hémochromatose de type 1. Pour affirmer ou infir-
mer le diagnostic d’hémochromatose HFE le test génétique
est l’examen clé. Il doit être prescrit devant une éléva-
tion du coefficient de saturation de la transferrine (CS-Tf)
plasmatique, perturbation biologique la plus précoce dans
la maladie. Cette élévation s’accompagne secondairement
d’une élévation de la ferritinémie qui signe la constitution
de la surcharge martiale tissulaire.
Nous avons réalisé une enquête auprès des membres du
réseau national des laboratoires référents impliqués dans le
diagnostic par biologie moléculaire de maladies rares du
métabolisme du fer afin d’établir un bilan des pratiques,
de faciliter l’interprétation des résultats, voire de guider les
démarches pour un recours aux laboratoires spécialisés.
Méthode
Un questionnaire a été adressé, en décembre 2010, aux
membres du réseau national des laboratoires référents
impliqués dans le diagnostic des surcharges génétiques
en fer, rares. Le questionnaire (Annexe 1) comportait les
rubriques suivantes : le matériel biologique et les méthodes
de diagnostic utilisés, les mutations recherchées et leur
intérêt dans la démarche diagnostique, les commentaires
associés aux génotypes identifiés, la mise en place et le
suivi du conseil génétique, les problèmes réglementaires
liés à la réalisation de tests génétiques et la participation
aux contrôles de qualité. Les 8 membres du réseau national
ont répondu à l’enquête.
Résultats
Les méthodes diagnostiques
Types de prélèvements et méthodes d’extraction
de l’ADN
Les membres du réseau privilégient le sang total prélevé
sur EDTA. Les méthodes d’extraction sont le plus souvent

Ann Biol Clin, vol. 70, n◦3, mai-juin 2012 307
Bonnes pratiques pour la réalisation du test génétique HFE
manuelles, certains laboratoires sont dotés d’automates
d’extraction. Dans tous les cas, la méthode dite de réfé-
rence, au phénol-chloroforme, est devenue marginale, elle
a laissé place aux méthodes qui évitent l’utilisation de sol-
vants toxiques.
Certains laboratoires s’affranchissent de l’extraction et
effectuent le génotypage à partir de prélèvements sanguins
ou buccaux déposés sur support cellulosique (Whatman
10531018, Whatman FTA) [5].
Recensement des méthodes de génotypage
Le choix des méthodes dépend le plus souvent de
l’équipement du laboratoire. Les méthodes peuvent être
propres à chaque laboratoire mais dans tous les cas, elles
font l’objet d’un contrôle de qualité intra et inter- labora-
toires.
Principales techniques «maison »utilisées
Les techniques utilisées par les huit laboratoires qui
composent le « réseau Fer » sont présentées dans le
tableau 1. L’amplification-restriction (ou « PCR-RFLP »)
[6] est nettement majoritaire puisqu’elle est utilisée dans 5
sites
Coffrets commerciaux
Les seuls coffrets commerciaux évalués par les labora-
toires interrogés sont les kits “Hybridation reverse sur
bandelettes” (Viennalab). Deux coffrets ont été testés par
4 laboratoires référents : i) l’un permettant l’identification
de la mutation p.Cys282Tyr, et des variants p.His63Asp
(H63D) et p.Ser65Cys (S65C) du gène HFE,(hemochro-
matosis strip assay B) ; ii) l’autre permettant l’identification
de 12 mutations du gène HFE, 4 du gène TFR2 et2du
gène SLC40A1 codant la ferroportine (hemochromatosis
strip assay A).
De l’avis des membres du réseau, le second coffret n’est
pas adapté au diagnostic de routine de l’hémochromatose
HFE. Il recherche un nombre limité de mutations privées
(c’est-à-dire observées chez un seul malade ou dans une
seule famille), du gène HFE et d’autres gènes impliqués
dans les surcharges en fer. La pertinence du choix de ces
mutations est discutable.
Les contrôles de qualité
Dans le cas des tests génétiques, l’intérêt des contrôles de
qualité est double, évaluer la méthode utilisée par le labo-
ratoire mais également évaluer la qualité des commentaires
proposés en fonction du génotype identifié. Des contrô-
les de qualité nationaux et européens sont accessibles sur
inscription.
Contrôle de qualité national
L’Afssaps (Agence franc¸aise de sécurité sanitaire des
produits de santé) propose depuis 2005 un contrôle de
qualité national annuel pour le diagnostic génétique de
l’hémochromatose HFE.
Deux prélèvements d’ADN sont proposés aux partici-
pants avec des informations clinico-biologiques. La ou
les mutation(s) à rechercher est (sont) précisée(s) (muta-
tion p.Cys282Tyr seule ou mutations p.Cys282Tyr et
Tableau 1. Principales méthodes de génotypage HFE. Méthodes de génotypage utilisées dans les laboratoires du réseau national des
laboratoires référents impliqués dans le diagnostic des surcharges génétiques en fer rares pour la mise en évidence des mutations
p.Cys282Tyr et p.His63Asp du gène HFE.
Méthode - Principe Principales étapes
Amplification-restriction (PCR-RFLP)
Une mutation peut créer ou abolir un site de
reconnaissance pour une enzyme de restriction
Amplification de la séquence cible
Digestion des amplimères par l’enzyme de restriction
dont le site est modifié par la variation de séquence
Séparation électrophorétique des produits de digestion.
Le nombre et la taille des fragments visualisés dépend de la variation
de séquence et permet de discriminer les homozygotes et hétérozygotes
Hybridation spécifique d’allèle
La présence d’un mésappariement
sur un fragment de taille réduite abaisse
significativement la température de fusion
Amplification de la séquence cible
Hybridation des amplimères avec des sondes marquées.
Une sonde est spécifique de l’allèle muté, l’autre de l’allèle normal.
Un hétérozygote donne un signal avec les deux sondes
Amplification réfractaire (ARMS)
La Taq polymérase ne peut pas allonger
un oligonucléotide dont la dernière base
en 3’ n’est pas parfaitement hybridée
Amplification de la séquence cible en utilisant deux couples
d’oligonucléotides. L’un permettant l’amplification de la séquence normale,
l’autre l’amplification de la séquence mutée
Identification des allèles soit par détection de fluorescence
soit après migration électrophorétique [7]
Fusion haute résolution (HRM)
Utilisation d’un fluorochrome intercalant qui
sature complètement les structures double
brins et permet de distinguer des variations
d’une seule base selon le profil de dénaturation
Amplication de la séquence cible en présence du fluorochrome
Dénaturation des amplimères sur une montée en température
très progressive
Identification des allèles par analyses des courbes de fusion

308 Ann Biol Clin, vol. 70, n◦3, mai-juin 2012
Article original
p.His63Asp). Les commentaires doivent être rédigés en
tenant compte du contexte clinique. Le bilan est adressé aux
participants avec un commentaire type adapté au résultat et
au contexte clinique.
Contrôle de qualité européen
Mis en place par l’EMQN (European molecular genetics
quality network), ce contrôle de qualité représente un cer-
tain coût (frais d’inscription : 55 Det frais de participation
au contrôle HFE : 290 D). Trois échantillons d’ADN sont
transmis avec les cas cliniques. Les mutations p.Cys282Tyr
et p.His63Asp doivent être recherchées. Ce contrôle de qua-
lité présente un inconvénient pour les francophones car les
résultats et commentaires doivent être rédigés en anglais.
Quand l’analyse du gène HFE doit-elle être
envisagée ?
En 2005, la HAS a recommandé de pratiquer le test géné-
tique HFE devant une élévation du CS-Tf >45 %. Les
membres du réseau constatent que la demande d’analyse du
gène HFE est souvent prescrite devant une augmentation de
la ferritine sérique et n’est pas toujours accompagnée de la
détermination du coefficient de saturation de la transferrine.
Deux rappels sont essentiels :
– plus de 90 % des hyperferritinémies peuvent être expli-
quées par des causes secondaires (acquises), aux premiers
rangs desquelles : le syndrome inflammatoire, la lyse cel-
lulaire, la consommation excessive d’alcool et le syndrome
métabolique [8]. Le diagnostic de ces formes secondaires
d’hyperferritinémie repose sur des éléments simples, pour
l’essentiel d’ordre biologique [9] ;
– l’élévation du CS-Tf étant le meilleur paramètre
d’orientation diagnostique de l’hémochromatose HFE,
aucun test génétique ne devrait être demandé quand le
CS-Tf est normal en l’absence de tout syndrome inflamma-
toire. En effet, un syndrome inflammatoire peut masquer
l’élévation du CS-Tf, il est donc important d’associer un
dosage de CRP à sa détermination [10]. L’élévation du
CS-Tf n’est cependant pas spécifique de l’hémochromatose
HFE, elle peut s’observer en cas de cytolyse, d’insuffisance
hépato-cellulaire ou de surcharge d’origine transfusion-
nelle. La concentration d’hémoglobine, le dosage des
transaminases, ainsi que le taux de prothrombine, per-
mettent d’éliminer ces causes d’élévation du CS-Tf.
Quelles mutations rechercher ?
La mutation p.Cys282Tyr (C282Y)
La mutation p.Cys282Tyr est la principale mutation
en cause dans l’hémochromatose HFE. L’homozygotie
p.Cys282Tyr (p.[Cys282Tyr];[Cys282Tyr] selon la nomen-
clature HGVS du 17/08/2011) explique, en France, près de
80 % des cas d’hémochromatose HFE. La fréquence de
l’homozygotie est élevée dans les populations d’origine
caucasienne (jusqu’à 1 individu sur 260 dans certaines
populations). La pénétrance clinique de ce génotype est
faible et pourrait n’atteindre que 1 % chez les femmes et
28 % chez les hommes, ce qui suggère l’existence de co-
facteurs, génétiques ou acquis, susceptibles de moduler son
expression [11-15].
Depuis mai 2007, la recherche de la mutation p.Cys282Tyr
est cotée B180 à la nomenclature des actes de biologie
médicale (JO décision du 24 janvier 2007).
Les variants p.His63Asp (H63D) et p.Ser65Cys
(S65C)
Deux variants fréquents, p.His63Asp et p.Ser65Cys, ont
été identifiés sur le gène HFE. La fréquence allélique du
variant p.His63Asp est assez élevée dans les populations
caucasiennes (environ 15 %), elle n’est que de 0,5 % pour
p.Ser65Cys. La présence de ces variants à l’état hétérozy-
gote ou homozygote n’a pas de traduction pathologique.
Il est actuellement admis, par la plupart des auteurs,
que le génotype d’hétérozygotie composite p.[Cys282Tyr];
[His63Asp] peut conduire à une surcharge en fer modé-
rée, qui restera sans conséquence clinique en l’absence de
facteurs de co-morbidité, génétiques ou acquis [8, 16, 17].
Mura et al. [18] ont décrit des formes modérées
de surcharge en fer associées au génotype compo-
site p.[Cys282Tyr];[Ser65Cys]. La présence de facteurs
de co-morbidité associés expliquerait les formes plus
sévères [19, 20]. Nous rappelons cependant que seule
l’homozygotie p.Cys282Tyr associée à une élévation du
CS-Tf permet de porter le diagnostic d’hémochromatose
HFE.
La présence de génotypes d’hétérozygotie composite peut
conduire à des interprétations erronées et le recours aux
laboratoires spécialisés est parfois nécessaire.
Commentaire en fonction du génotype HFE
Homozygotie p.Cys282Tyr,
génotype p.[Cys282Tyr];[Cys282Tyr]
Chez un patient présentant des signes biologiques et/ou
cliniques de surcharge en fer, l’homozygotie pour la
mutation p.Cys282Tyr permet d’affirmer le diagnostic
d’hémochromatose HFE. Le patient doit bénéficier d’une
prise en charge conformément aux recommandations de la
HAS 2005 [21]. L’hémochromatose étant une maladie à
transmission autosomique récessive, un dépistage familial
doit être proposé aux apparentés du premier degré.
Hétérozygotie p.Cys282Tyr,
génotype p.[Cys282Tyr];[=]
Les hétérozygotes p.Cys282Tyr (porteurs d’un seul allèle
muté) ne développent pas de surcharge en fer en l’absence

Ann Biol Clin, vol. 70, n◦3, mai-juin 2012 309
Bonnes pratiques pour la réalisation du test génétique HFE
de facteurs de risque acquis associés (maladie hépatique,
alcool, etc.). La « simple » hétérozygotie p.Cys282Tyr ne
permet donc pas de poser le diagnostic d’hémochromatose
HFE. Cependant, une enquête familiale est recomman-
dée aux apparentés du premier degré afin d’identifier
d’éventuels homozygotes p.Cys282Tyr.
Autres génotypes
Les autres génotypes ne permettent pas de poser le dia-
gnostic d’hémochromatose HFE selon les critères de la
HAS. En l’absence d’étiologie secondaire évidente, il est
indispensable d’adresser ces patients à une consultation
spécialisée afin que soit envisagée une analyse génétique
complémentaire (recherche de mutations rares sur le gène
HFE ou sur les autres gènes responsables de surcharge en
fer) (tableau 2).
En pratique
Chez un patient qui présente un bilan martial évoca-
teur d’hémochromatose, mais qui n’est pas homozygote
pour la mutation p.Cys282Tyr, l’interprétation du test
génétique HFE doit intégrer des données cliniques et bio-
logiques complémentaires afin d’évaluer les facteurs de
co-morbidité.
Quand plusieurs bilans biologiques ont été réalisés dans
de bonnes conditions, que les causes fréquentes de sur-
charge en fer acquise ont été éliminées (apport excessif de
fer, lyse cellulaire, syndrome dysmétabolique, alcool, syn-
drome inflammatoire aigu ou chronique), que la surcharge
hépatique en fer a été confirmée (IRM, biopsie, quantifica-
tion rétrospective après saignées), le patient doit être orienté
vers une consultation spécialisée car une analyse génétique
plus exhaustive peut être envisagée.
Depuis juillet 2007, des consultations spécialisées sont
accessibles pour les pathologies rares du métabolisme du
fer au sein du centre de référence clinique et des huit
centres de compétences régionaux (www.centre-reference-
fer-rennes.org).
L’étude génétique exhaustive, réalisée dans les laboratoires
spécialisés du réseau, inclut la recherche de mutation(s)
rare(s) du gène HFE [17, 22] et/ou l’analyse d’autres gènes
Tableau 2. Surcharges en fer héréditaires primitives non liées au
gène HFE.
Forme Transmission Gène Protéine
Autosomique
récessive
HJV Hémojuvéline
Juvéniles HAMP Hepcidine
Juvénile
ou adulte
Autosomique
récessive
TFR2 Récepteur 2
de la
transferrine
Adulte Autosomique
dominante
SLC40A1 Ferroportine
impliqués dans la survenue de surcharges en fer non-HFE
[23]. En effet, d’autres formes de surcharge en fer non liées
au gène HFE sont répertoriées (tableau 2).
Problèmes réglementaires
Seuls les praticiens agréés pour la réalisation de tests
génétiques visant à la détermination des caractéristiques
génétiques d’un individu, exerc¸ant dans des structures
agréées, peuvent réaliser les tests HFE suivant la régle-
mentation en vigueur (décret 2008-321, article R.1131-6).
Cet agrément est attribué pour 5 ans par l’Agence de la
biomédecine.
Attestation de consultation, consentement
Le décret n◦2008-321 du 4 avril 2008 a redéfini les obli-
gations réglementaires en matière de prescription et de
réalisation des examens des caractéristiques génétiques
d’un individu à des fins médicales. Il stipule notamment
que le médecin consulté délivre une attestation certifiant
qu’il a apporté à la personne concernée les informations
définies à l’article R. 1131-4 et qu’il en a recueilli le consen-
tement dans les conditions prévues au même article. Cette
attestation est remise au praticien agréé réalisant l’examen
mentionné et le double est versé au dossier médical de la
personne concernée (figure 1).
Le praticien agréé doit donc s’assurer que l’attestation de
consultation, stipulant que le consentement du patient a
été recueilli, est jointe au prélèvement. Si ce n’est pas le
cas, une copie du consentement signé par le patient, sur
lequel figure la pathologie concernée, doit accompagner le
prélèvement.
A qui adresser le résultat ?
Selon l’article R1131-19 du 4 avril 2008, le compte rendu
des analyses « est commenté par le praticien agréé ».
C’est le médecin prescripteur qui communique les résultats
de l’examen des caractéristiques génétiques à la personne
concernée, ou à son représentant légal, dans le cadre d’une
consultation médicale individuelle.
Le conseil génétique
Le conseil génétique doit être proposé aux apparentés de
premier degré, à savoir les frères et sœurs, les ascendants
(père et mère), les descendants (fils et filles) s’ils sont
majeurs. C’est en principe le patient qui doit informer ses
apparentés de leur risque génétique ; il y est largement
incité dans le cadre des nouvelles lois de bioéthique. Le
conseil génétique comporte la réalisation du test HFE et du
bilan martial sérique (CS-Tf et ferritine). Pour les enfants
mineurs, le test génétique sera réalisé uniquement en cas
d’élévation des marqueurs sériques du bilan martial. En
revanche, en l’absence d’anomalie du bilan martial, le test
HFE ne doit pas être proposé chez les enfants mineurs.