CORRECTION TD CHROMATOGRAPHIE BIOCHIMIE III : 2020/2021. MinBo fax: 680132620 – 659239359 Correction exercice 6 : 1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire, gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps de rétention) La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite : MM Log MM tr 145000 5.16 10.4 52 Lactate 135000 déshydrogénase 5.13 11.4 57 Phosphatase alcaline 80000 4.9 18.4 92 Ovalbumine 45000 4.65 26.2 131 Lactoglobuline 37100 4.57 28.6 143 Aldolase (min) Ve (ml) 1 Le fait de visualiser une droite signifie qu'aucune protéine n'est exclue du gel. 2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x 21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse moléculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ. ci, on a tracé le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (Ve). L'autre représentation serait de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt) Correction exercice 7 1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-) est chargée négativement et est donc une résine échangeuse de cations. Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique). 2 Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique). Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids aminés, à pH = 2 et à pH = 7 Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne. A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98) Correction exercice 8: 1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9. Le pH est donné par la relation suivante : PH =pka +log (base)/(acide)… À pH = 1 :log B/A = pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76 donc :B/A= 1,74 10-4 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10-4.(A), + 1,74 10-4.(A) = 100 on en déduit que (A) (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 1,74 10-4) 3 On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 % À pH = 4,76 :logB/A= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0 donc :B/A= 1 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), 100 on en déduit que (A) + (A) = (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 % À pH = 7 : logB/A= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24 donc :base/acide =173,781 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), 173,78(A) = 100 on en déduit que (A) + (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(174,78) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 % À pH = 9 : log B/A= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24 donc :B/A = 13378 Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), 13378(A) = 100 on en déduit que (A) + (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(13379) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10-3 % et (B) = 99,994 % Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (CH2-COOH). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-CH2-COO-) 4 2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH2-COO-). Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenues Correction exercice 9 : 1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12. Le pH est donné par la relation suivante : PH= PKA +log N/NH À pH = 2 :log B/A = pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4 donc : B/A Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-6.(A), + 3,98 10-6.(A) = 100 = 3,98 10-6 on en déduit que (A) (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-6) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 % À pH = 7 : log/B/A = pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc : B/A Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-3.(A), + 3,98 10-3.(A) = 100 = 3,98 10-3 on en déduit que (A) (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-3) 5 On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 % À pH = 9,4 : logB/A = pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0 donc : Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), 100 B/A =1 on en déduit que (A) + (A) = (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 % À pH = 12 : logB/A = pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6 donc : B/A Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), 398,1(A) = 100 = 398,1 on en déduit que (A) + (A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 398,1) On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 % Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH+). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-N) 2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide, chargée positivement. 6 Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus. Correction exercice 10: Coefficient de partage de l'iode dans le tétrachlorométhane et l'eau. D'après les données de l'exercice, on peut écrire les deux égalités suivantes : On peut en déduire que : Concentration dans le tétrachlorométhane (solvant organique) = 9,9 g/l 7 Concentration dans l'eau (solvant aqueux) = 0,099 g/l Correction exercice 11 : 1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10-27 kg. La masse moléculaire d'un composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abréviation de dalton s'écrit avec un D majuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa. 2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer la représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM) = f(Ve) pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire : 8 Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un log MM = 4,93, soit une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p. Il est très important de noter que : - 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances exclues (ici, le dextran). - 132 ml représente le volume d'exclusion des protéines totalement incluses. - la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la catalase, car le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement incluse dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à partir des points correspondant à la catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les volumes d'élution encadrent celui de la protéine p). Correction exercice 12: Afin de remplir le tableau, il faut connaître quelques définitions : - L'activité spécifique (AS) représente un nombre d'unités enzymatiques (UE) par gramme de protéines (g) : AS = (UE / g) - Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une étape de purification, sur l'AS mesurée à l'étape précédente : Taux de purification = AS après une étape / AS avant cette même étape - Le rendement correspond à un nombre d'UE mesuré après une étape de purification, sur un nombre d'UE mesuré à l'étape précédente : Rendement = UE après une étape / UE avant cette même étape 9 Connaissant ces définitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne supplémentaire "AS" qui nous permettra de calculer le taux de purification : On pourra utilement calculer : - Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par celle de départ. Ici, le taux global de purification est égal à 7000 / 20 = 350. - Le rendement global qui est égal à 3500 / 20000 = 17,5 %, Conclusion : Suite aux différentes étapes de purification, on a pu récupérer 3500 unités, sur les 20000 que l'on avait au départ, soit 17,5 %. L'enzyme a été purifiée 350 fois. Correction exercice 13: Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6. Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ? 10 Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement. Acides aminés Charge à pH Charge à PH6 <2.87 PHi Asp 2.87 Leu 6 Arg 10.76 + + + neutre (50%/50)% + À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée. Correction exercice 14 : Voici un diagramme d'élution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da), sur laquelle on aurait déposé un un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da). 11 Ici on a représenté la mesure de la densité optique (DO) de l'éluat en fonction du volume d'élution (Ve). Les IgG présentent une masse moléculaire supérieure à la valeur de la limite d'exclusion de la colonne (100000 Da). Elles seront donc éluées en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne (Vm = Ve IgG) L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus tard, avec un Ve albumine qui est égal à Vm + Ve' albumine. 12
