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8. Chromatographie de pigments verts - Chimie Organique

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Travaux Pratiques de Chimie Organique
Nadia BOULEKRAS
Chromatographie de pigments verts
I.
INTRODUCTION
Les organismes chlorophylliens sont capables de synthétiser des
molécules organiques simples sous l’action de la lumière visible. Cette
synthèse nécessitant la lumière comme source d'énergie s'appelle la
photosynthèse.
L'utilisation de l'énergie lumineuse est rendue possible grâce à l'existence de
pigments : molécules capables d’absorber certaines longueurs d'onde
lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche. Cette propriété leur donne
une couleur déterminée.
La chlorophylle (mot grec composé chlorós : vert et phýllon : feuille) est le
principal pigment constituant des végétaux photosynthétiques.
La chlorophylle est contenue dans les chloroplastes : de minuscules
organismes situés dans les
essentiellement dans les feuilles.
cellules
végétales
vivantes,
La chlorophylle est constituée de plusieurs molécules de structures
chimiques très proches : les chlorophylles a, b, c et d, les xanthophylles
et les caroténoïdes. Les chlorophylles a et b sont les plus abondantes
chez les plantes supérieures et algues vertes, en proportions variables
suivant l’espèce. Les chlorophylles c et d sont présentes chez les algues
brunes et cyanobactéries.
o
Chlorophylle a (vert-bleu) :
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o
Chlorophylle b (vert-jaune) :
o
Phéophytine (vert-olive)
o
β-Carotène (jaune-orangé) :
o
α-Carotène (orange) :
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o
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Lutéine (jaune)
OH
HO
o
Xanthophylles (jaune) :
•
Viola xanthine
OH
O
O
HO
•
Néo xanthine
HO
OH
OH
O
Remarque : toutes ces molécules contiennent des liaisons doubles
conjuguées qui sont essentielles pour l’absorption et le transport de
l’énergie lumineuse.
En automne, la dégradation des chlorophylles a et b provoquent un
changement de couleur des végétaux : les feuilles des arbres perdent leur
teinte verte et prennent des couleurs allant du jaune au rouge sombre. Sous
l’action d’enzymes, la chlorophylle verte se transforme en des molécules
rouges puis incolores. Les autres pigments de la plante, les caroténoïdes
(jaune-orange) ne seront plus cachés par le vert de la chlorophylle et
seront responsables de la couleur rouge (ou jaune) que prendra la feuille.
II. PRINCIPE
Les pigments que l'on rencontre dans les feuilles des plantes vertes sont
facilement séparés par chromatographie. Ils sont extraits par un solvant
organique (l’éthanol : CH3CH2OH ou l’acétone CH3COCH3). L'extrait est
analysé par chromatographie sur couche mince (C.C.M).
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Les chlorophylles : sont très solubles dans les solvants polaires.
Les xantophylles: ont une solubilité plus ou moins importante dans
les solvants polaires, mais elles sont aussi solubles dans les solvants
apolaires.
Les carotènes: ne possèdent aucun groupement polaire et sont
solubles dans les solvants apolaires.
III. MODE OPÉRATOIRE : Pour 3 binômes
•
•
•
•
•
•
•
Prendre 5 feuilles d’une plante verte, les rincer à l’eau distillée puis les
sécher avec du papier absorbant.
Choisir la partie vert foncée, enlever les nervures et les tiges, puis les
couper finement.
Mettre les feuilles coupées dans un mortier puis ajouter une spatule de
sable (qui facilite le broyage) et 10 mL d’acétone (ou d’éthanol).
Broyer à l'aide du pilon jusqu'à ce que le solvant prenne une couleur vertfoncé.
Filtrer la solution sur papier filtre (ou Büchner) : le filtrat obtenu doit avoir
une couleur vert limpide.
Evaporer le solvant à l’évaporateur rotatif (ou en chauffant modérément
au bain-marie) : on obtient une pâte de couleur vert-foncé.
Réaliser une chromatographie sur couche mince.
Feuilles après broyage
Filtrat après broyage
Après évaporation du solvant
IV. CHROMATOGRAPHIE
Séparation par CCM des différents pigments colorés contenus dans
les feuilles des plantes vertes
a) Préparation de la cuve :
L'atmosphère de la cuve doit être saturée en vapeur d'éluant. Ceci
impose d'avoir une cuve bien fermée et préparée à l'avance.
Sous la hotte, verser l’éluant dans un bécher sec de 100 mL, sur
une hauteur de ½ cm. Recouvrir la cuve avec une boîte à pétri :
•
•
•
•
Eluant
Eluant
Eluant
Eluant
1
2
3
4
:
:
:
:
Ether de pétrole/Acétone/Cyclohexane : 85/10/5%
Ether de pétrole/Ethanol : 90/10%
Ether diéthylique/Ether de Pétrole : 60/40%
Ether diéthylique/Cyclohexane: 70/30%
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b) Préparation de la plaque chromatographique :
o
o
o
o
Prendre une plaque d’aluminium recouverte de
toucher avec les doigts.
Découper avec un cutter, une plaque de (5 cm x 3
Tracer au crayon sans appuyer, une ligne (ligne
cm du bord inférieur de la plaque.
Marquer légèrement au crayon sur cette ligne,
du dépôt.
silice. Ne pas
cm).
de dépôt), à 1
l’emplacement
c) Dépôt de l’échantillon :
o
o
o
A l’aide d’une pipette pasteur, d’un tube capillaire ou d’un curedent, prélever une goutte d’extrait vert, la déposer à
l’emplacement marqué.
Laisser sécher avant d’effectuer un nouveau dépôt.
Effectuer une dizaine de dépôts au même endroit, en laissant
sécher entre chaque dépôt.
d) Elution :
o
o
o
o
Lorsque les dépôts sont secs, introduire la plaque verticalement
dans la cuve (la ligne de dépôt ne doit pas tremper dans l’éluant)
et refermer à l’aide de la boîte à pétri.
Au cours de l’élution, l’éluant migre sur la plaque en imprégnant
la silice.
Retirer la plaque de la cuve avec des pinces, lorsque le front du
solvant est à 1 cm du bord supérieur de la plaque.
Repérer le front du solvant au crayon. Laisser l’éluant s’évaporer
sous la hotte.
e) Révélation (développement du chromatogramme):
Observer le chromatogramme et entourer au crayon, les différentes
tâches colorées qui apparaissent.
f) Analyse du chromatogramme :
On met en évidence 4 sortes de pigments, du haut vers le bas :
•
•
•
•
Carotènes (jaune-orange) : très peu polaires.
Chlorophylle A (vert-bleu) : peu polaire.
Chlorophylle B (vert-jaune) : moyennement polaire.
Xantophylles (jaune) : polaires.
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Remarque : lorsque les taches sont incolores, on les fait apparaître
sous une lampe UV ou à l'aide d'un révélateur chimique mais dans le
cas des pigments, ils apparaissent sous forme de taches colorées,
visibles à l’œil nu.
o Les xantophylles (violaxanthine et néoxanthine) : sont des
carotènes oxydés, ils sont polaires puisqu’ils comportent de
nombreux atomes d’oxygènes qui vont pouvoir se lier avec les
groupements hydroxyles (–OH) du support solide.
o Les chlorophylles a et b : sont des composés peu polaires.
La chlorophylle b se différencie de la chlorophylle a par la
présence
un groupement aldéhyde (-CHO) au lieu d’un
méthyle (CH3). La chlorophylle b est donc plus polaire et plus
retenue par le support solide que la chlorophylle a.
o Les carotènes (β-carotène) : sont des composés apolaires,
ne comportant pas d’atome d’oxygène et ne sont donc pas
retenus par le support solide.
g) Rapport frontal :
On appelle rapport frontal Rf d'une espèce chimique, le rapport
entre la distance x parcourue par l'espèce et la distance y parcourue
par l'éluant pendant le même temps.
Rf dépend de la nature du produit, de l'éluant et de la phase fixe.
Rf =
dis tan ce parcourue par la susbs tan ce
dis tan ce parcourue par l' éluant
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=
x
y
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V.
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COMPTE RENDU
•
•
Reproduire le chromatogramme obtenu. Identifier chaque pigment, en
utilisant les indications données ci-dessus.
Calculer les différents rapports frontaux.
•
Comparer le chromatogramme obtenu à partir du pigment vert avec
celui du paprika : Y a-t-il une substance commune aux deux extraits?
•
Quelle est la technique qui nous permet de révéler le résultat d’une
CCM lorsque les produits ne sont pas colorés ?
•
On a broyé des feuilles de persil que l’on répartit dans 2 béchers :
5 mL d'eau
5 mL d'éthanol
Feuilles de persil
broyées
On agite, on laisse agir, puis on filtre dans 2 tubes à essai. On constate
que :
dans le 1er tube, la couleur du filtrat est à peine verte (presque
incolore).
dans le 2ème tube, la couleur du filtrat est vert foncé.
Quel est le meilleur solvant pour la chlorophylle ?
Références
•
•
http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
http://fr.wikipedia.org/wiki/Chlorophylle
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