Extraction, séparation et identification des pigments de chlorophylle

Sciences et laboratoire: Formes d'énergie
Extraction, séparation et identification
des pigments de chlorophylle dans les
feuilles d’épinard.
La réalisation de la photosynthèse par les chloroplastes des végétaux met en jeu un ensemble de molécules
particulières appelées pigments photosynthétiques. On parle de pigments car ces molécules sont colorées: elles
sont capables d’absorber certaines radiations lumineuses et pas d’autres.
Le but de ce TP est de :
 Extraire, séparer et identifier les différents pigments de la chlorophylle dans des feuilles d’épinards
 Comprendre quelles sont les radiations lumineuses dites actives pour la photosynthèse.
La chlorophylle est contenue dans les chloroplastes des cellules végétales chlorophylliennes, mais ces cellules
végétales sont entourées d’une paroi épaisse. Comment récupérer la chlorophylle ?
I) Extraction des pigments de la chlorophylle brute contenus dans les feuilles d’épinard
1) Protocole
Proposer un protocole pour réaliser l’extraction désirée.
Après validation par le professeur, mettre en œuvre ce protocole.
Il est fortement conseillé de s’inspirer du matériel présent sur vos paillasses.
2) Schémas
Faire plusieurs schémas retraçant les différentes étapes du protocole mis en œuvre.
II) Chromatographie sur couche mince
1) Principe
Cette technique de laboratoire consiste à entrainer des molécules par un solvant (appelé éluant et constituant la
phase mobile) sur un support en silice (phase stationnaire). Sur un support donné, avec un éluant donné, chaque
pigment migrera avec une vitesse de déplacement qui lui est propre. Les différents pigments ne monteront donc
pas à la même hauteur sur le support.
2) Protocole
Tracer une ligne à 1 cm du bord inférieur et 1 cm du bord supérieur.
Déposer à l’aide d’un capillaire (petit tube de verre très fin) 1 goutte de filtrat sur la ligne inférieure de la plaque
(ligne de dépôt).
Verser de l’éluant dans la cuve à chromatographie sur une hauteur de 2 mm environ.
Placer la plaque dans la cuve à chromatographie. Attention : le dépôt ne doit pas tremper dans l’éluant pour ne
pas diluer les composés déposés.
Fermer la cuve.
3) Résultat de la chromatographie et exploitation
Combien de taches sur le papier observe-t-on ? Faire le schéma du chromatogramme obtenu.
Que peut-on en déduire?
III) Spectrophotométrie
On cherche maintenant à connaître les radiations lumineuses que la chlorophylle absorbe pour réaliser
efficacement la photosynthèse (ce sont les radiations dites actives). Pour cela il faut donc réaliser un spectre
d’absorption de la chlorophylle brute.

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1) Principe de la spectrophotométrie
La spectrophotométrie d'absorption est une méthode physique d'analyse chimique. Elle permet de mesurer la
proportion de lumière absorbée par une espèce colorée en solution. On appelle cette grandeur l’absorbance.
Le spectrophotomètre fait passer une lumière blanche à travers une longueur l de solution et compare son
intensité avec celle d’un faisceau de lumière blanche qui n’aurait pas traversé la solution. Le rapport sans unité
donne l'absorbance de l’espèce colorée pour chaque radiation composant la longueur d’onde: on obtient alors un
spectre.
2) Réalisation du spectre d’absorption de la solution extraite.
Préparer deux cuves: une remplie d’eau et l’autre réalisée avec quelques gouttes de la solution extraite et de l’eau
(le filtrat est trop concentré et on ne verrait rien si on l’utilisait tel quel).
 Allumer l’ordinateur et lancer "Synchronie 6".
 Dans le menu déroulant, choisir "Exécuter" puis "Module de chimie".
 Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, vérifier qu'on est bien en mode "Acquisition" puis valider.
 Choisir l'appareil (Secomam Prim) et le port (Com 1).
 Cliquer sur "Tester" et attendre que le logiciel reconnaisse l'appareil.
 Cliquer sur l'onglet "Plage de mesure" et régler l'intervalle de mesure à 5 nm.
En validant, le nombre de points est recalculé automatiquement.
Vérifier également que le type d'analyse est bien le "Tracé d'un spectre".

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 Cliquer sur l'onglet "Valeurs mesurées" et décocher "Mesure transmission".
Cliquer alors sur "Acquisition".
 Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, cliquer sur "Démarrer".
Le logiciel indique alors "Introduire la solution pour effectuer le blanc".
 Introduire la cuve contenant l'eau distillée, fermer le couvercle puis cliquer sur "Démarrer".
 Lorsque l'étalonnage est terminé, la fenêtre ci-dessous apparaît:
 Introduire alors la cuve contenant la solution extraite, fermer le couvercle et cliquer alors sur "OK"
(ordre impératif).
 Lorsque le spectre est terminé, faire une copie d'écran puis ouvrir "Paint". Enregistrer le spectre sur votre
clé USB.
3) Exploitation du spectre d’absorption des espèces en solution
Pour quelle longueur d'onde la solution présente-t-elle un maximum d'absorption?
A quelle couleur cette longueur d'onde correspond elle?
En utilisant le cercle chromatique, expliquer pourquoi la chlorophylle paraît verte.
La chlorophylle présente également un maximum d'absorption dans un autre domaine de lumière invisible.
 Comment le sait-on?
 Que nécessite une plante pour bien se développer?
 Expliquer en termes de transformation d'énergie ce qui se passe lors de la photosynthèse.