Telechargé par Soufyane Abbas serki

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Filière : biologie
Spécialité : Physiologie de la nutrition et santé
Analyse d’article
Titre : l'autophagie médiée par les acides
aminés dans les cellules épithéliales
intestinales est régulé par l’échangeur Na
+/H+
Par
Abbas Alio Serki Soufyane
Gonda makaou Abdoul kader
Tenu par : Dr Belkaloul
Année universitaire : 2019-2020
Sommaire
Introduction
Matériels et méthodes
Résultats
Discussion
Conclusion
Introduction
L'autophagie est un mécanisme cellulaire qui consiste en la dégradation
partielle du cytoplasme de la cellule intestinales en utilisant ses
propres lysosomes, Elle intervient à différents niveaux, que ce soit dans la
réparation d'éléments cellulaires, dans la nutrition de la cellule en cas de
jeûne, dans la réponse immunitaire ou dans la mort cellulaire, c’est un
processus à plusieurs étapes impliquant la nucléation, la formation
d’autophagosome, la fusion d’autophagosomes en lysosomes, et ces étapes
sont régies par de multiples facteurs associée à un métabolisme intestinal
aberrant. Dans cette étude nous avons une autophagie dysfonctionnelle qui
est causée par une variation génétique au sein des gènes de sensibilité à la
maladie de crohn (ATG16L1; IRGM) entrainant une manipulation
défectueuse des bactéries envahissantes chez le patient.
Objectif
Ainsi l’objectif principal de cette étude était de déterminer la fonction de
l’échangeur Na+/H3+(NHE3) dans l’activation de l’autophagie induite par les
acides aminés dans l’intestin, mais aussi la réponse autophagique après
administration de la proline, l’alanine et le transport ionique dans les
cellules épithéliales intestinales (IEC-18).
DMEM: cellules témoins
HBSS: modèle privé d’acide aminés
EIPA: l'inhibiteur NHE3 5- (N-éthyl-N-isopropyl) de
l'amiloride.
-HAN: HBSS avec alanine
-HPN: HBSS avec proline
-HAE: HBSS avec alanine et EIPA
-HPE: HBSS avec proline et EIPA
-HBSS contenant soit 0 ou 0.3um d’EIPA
respectivement HNN et HNE.
- Les cellules DMEM contenant 5% de FBS et soit 0 ou
0,3 mM d'EIPA (étiquetées QNN et QNE,
respectivement)
II. Matériels et méthodes
1. Mise en place des modèles de cellules autophagiques
_ Témoins:
cellules IEC-18 de petit rat non transformée et cultivée dans un
milieu EAGLE modifié (DMEM, introgen) complété avec 5% de sérum bovin
fœtal(SBF) et 0,1 u/ml d’insuline bovine dans CO2 atmosphérique humidifié à
5% à 37ºc
Pour le modèle de cellule autophagique Induites par la privation des acides
aminés: les IEC-18 ont été incubés dans une solution saline équilibrée de
HANK(HBSS) comme milieu de culture pendant 6h dans les mêmes conditions
atmosphériques.
_ Ensuite alanine ou proline avec ou sans l’inhibiteur NHE3-5 de l’amiloride
(EIPA) a été ajoutée au milieu de culture et incubé avec les cellules pendant
6h.
_ Pour identifier les concentration optimales d’acides aminés et d’EIPA qui
ont provoqué le meilleur effet, diverses concentrations ont été testées
_ Enfin Pour évaluer l'activité autophagique, la chloroquine(CQ), inhibiteur
de la fusion autophagosome-lysosome, a été utilisée.
2. Cerise monomère (mCherry)-protéines fluorescente verte(GFP)-transfection
LC3 et microscopie confocale:
_ Pour la quantification de la maturation autophagique une construction
mCherry-GFP-LC3 de rat tandem codé par un plasmide a été réalisée
_ la transfection a été réalisée avec de la lipofectamine 2000 dans des cellules
IEC-18, ensuite les cellules ont été cultivés à 37°c et 5%de CO2 pendant 6h
_ le milieu a été remplacé par du milieu de culture complet frais et les cellules
ont été incubées pendant 24h.
_ les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS et fixées dans du
paraformaldéhyde à 4%. Ces cellules fixées ont été préparées pour un balayage
par fluorescence sur des lames de verre avec une solution de montage antidécoloration et la microscopie confocale a été immédiatement réalisée.
3. Quantification du flux autophagique
_ le flux autophagique a été mesuré dans les IEC-18 transfectées par mCherryGFP-LC3 en utilisant un test basé sur l’imagerie.
_ La microscopie confocale a été utilisée pour compter le nombre de puncta
mCherry +LC3 jaune(autophagosome) et rouge (autolysosome) par cellules et
l’étendue du flux autophagique(perte de fluorescence GFP dans
mCherry+puncta observée comme une diminution de la puncta jaune)
_ l’exposition à l’environnement acide des autolysosomes à la diminution de la
fluorescence de la GFP, tandis que le signal mCherry est resté stable.
4. Réaction de polymérisation en chaine quantitative en temps réel (qRT-PCR):
_ l’ARN total a été isolé de chaque échantillon cellulaire à l’aide du réactif TRIzol
et transcrit inverse dans l’ADNc à l’aide du multiscribe transcriptase inverse.
_ ensuite ils ont procédé à un qRT-PCR, les produits de PCR pour le gène lié à
l’autophagie (ATG) chaines légères associée aux microtubules 3 (LC3),
séquestosome-1/SQSTM1(p62) et le GAPDH (glycéraldéhyde3-phosphate
déshydrogénase) ont été amplifiés.
_ tous ces échantillons ont été normalisés chez le rat.
5. Western blot
Les IEC-18 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et soumises aux
traitements respectifs:
-après une incubation de 6h, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées
trois fois avec du PBS glacé (ph 7.4).
‘Les cellules adhérentes ont été collectées avec un grattoir à cellules et lysées
dans un tampon d’essai de radio-immunoprécipitation contenant 1%
d’inhibteur de la phosphatase pendant 30min avec un vortexage intermittent.
-ensuite les lysats cellulaires ont été centrifugés à 12000 g pendant 15min à 4°c
et les surnageants ont été recueillis.
-la concentration en protéines a été mesurée en utilisant un kit de dosage de
protéines BCA.
-des échantillons de protéines(30ug/puits) de chaque groupe de traitement ont
été séparés par électrophorèse sur gel de tris-glycine sodium dofécyl sulfate –
polyacrylamide puis transférés sur des membranes de fluorescence de
polyvinyle.
Les membranes ont été bloqués avec du lait écrémé à 10% dans du sérum
physiologique tamponné tris 1 et Tween-20 à température ambiante, puis
sondées séparément avec LC3 B et p62 anticorps.
-puis les membranes ont été lavées 3 fois et incubées avec un anticorps
secondaire de chévre anti-IgG de lapin(HRP).
-les membranes ont encore été lavées et les signaux d’anticorps ont été
détectés par autoradiographie en utilisant un substrat de transfert western.
-la détection de LC3-II a été utilisé pour évaluer le niveau de LC3 activé.
-enfin une analyse densitométrique des transferts a été réalisée en utilisant le
système FluorChem(FC3).
6. Microscope électronique à transmission.
Les cellules ont été ensemencés dans des plaques à 6 puits, après incubation, les
milieux ont été retirés et les cellules ont été lavées 2 fois avec du PBS avant
d’être trypsinisés et collectés.
-ensuite les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde tamponné au
phosphate à 2.5% et stockées avant l’incorporation.
-après lavages avec du PBS (Ph 7.4), les cellules ont été post-fixées avec 1%
d’OsO4, déshydraté.
-des coupes ultrafines(60-80nm) ont été obtenues collées sur des grilles de
cuivre colorées avec 2 % d’acétate d’uranyle et citrate de plomb pendant 15
minute chacun; puis ont été observé après séchage pendant une nuit à
température ambiante.
7. Analyses statistiques
Le logiciel statistique SPSS 21.0 a été utilisé pour l'analyse des données.
-Les données sont exprimées comme la moyenne ± erreur standard ou l’état
type d’au moins trois expériences indépendantes.
- Les différences entre les groupes ont été analysés à l’aide d’une analyse de
variance unidirectionnelle(ANOVA), suivi du test t de student pour les
comparaisons.
-p<0.05 a été considéré comme significatif.
Résultats
1. L'alanine et la proline réduisent l'autophagie induite par la famine des
acides aminés :
-L’addition d’alanine ou de proline a diminué le niveau de LC3-II en
présence/absence de l’inhibiteur lysosomal et a réduit le flux de P62. (fig1B et
1C)
-L’effet de l’alanine et de la proline combinée à l’activité autophagique pendant
la famine a été examinée par les niveaux de protéines LC3. (fig S2)
-LC3, P62, ATG5, 7et 12: leur expression a considérablement diminué dans HAN
par rapport à HNN. Des résultats similaires ont été observés dans le groupe
HPN.
-les niveaux de NHE3 en présence ou en absence de HBSS, de proline ou
d’alanine a également été vérifiée. (Fig S3)
Figure :1
Conclusion: tous les résultats ont indiqué que l’alanine et la proline réduisaient
l’activité autophagique induite par la privation en acides aminés.
2. Amélioration des niveaux de protéines LC3-II avec un traitement EIPA:
-les résultats du western blot ont démontré que les niveaux totaux de protéines
LC3-II ont augmenter par le traitement EIPA dans HAE et HPE respectivement
par rapport aux groupes HAN et HPN.
Cette augmentation était plus évidente en présence de CQ dans HAE et HPE. (fig
2A et 2B)
-le flux P62 a également augmenté sous traitement EIPA. (fig 2A et 2B)
L’analyse du flux LC3 et du flux P62 en présence ou en l’absence d’un inhibiteur
lysosomal dans les groupes QNN (fig: S4) ont démontré que l’EIPA a inversé les
réductions de l’autophagie lors de la supplémentation en acides aminés;
suggérant que l’alanine et la proline pourraient chacune réguler l’autophagie
des IEC-18 via NHE3.
Figure :2
3. L'IEAP régule à la hausse l'expression de l'ATG:
- On observe des Changements dans les structures observées par microscopie
électronique à transmission dans des cellules IEC-18.
-par rapport au groupe HAN l’expression de ATG5, 7, 12 et P62 ont été
augmentée dans les cellules IEC-18 traitées avec EIPA (groupe HAE). Fig: 2C
- L’expression ATG5, 7, 12 et P62 ont été augmenter dans les groupes HPE
par rapport à HPN.
Figure 3
Figure 3
-conclusion: ces données ont confirmé que l’alanine et la prolines seules
régule négativement l’expression de l’ATG par NHE3.
4. Traitement EIPA augmente le nombre de vacuoles autophagiques:
_ une carence en acides aminés a augmenté le nombre de vacuoles
autophagiques dans le groupe HNN par rapport au groupe QNN. Fig 3A et 3B
-l’ajout d’alanine ou de proline a produit moins de vacuoles autophagiques dans
HAN et HPN que dans HNN. Fig 3A et 3B
-le nombre de vacuoles autophagiques a considérablement augmenté dans les
groupes HAE et HPE après traitement EIPA par rapport aux groupes HAN et
HPN. Fig 3A et 3B
5. L’EIPA régule l’initiation et la maturation de l’autophagie:
Le flux autophagique induit par l’EIPA a été évalué en présence et en absence
de l’inhibiteur de fusion autophagosome-lysosome CQ.
-plus de puncta LC3 jaune(autophagosome) et rouge(autolysosome) ont été
observés dans le groupe HNN que dans le groupe QNN.
-le nombre de puncta LC3 jaunes et rouges a été clairement réduit dans les 2
groupes HAN et HPN par rapport au groupe HNN. Fig: (4A, 4B et 4C)
-l’addition d’EIPA a considérablement augmenté le nombre de LC3 puncta jaune
et rouge dans les groupes HAE et HPE par rapport à HAN et HPN. (Fig4A et 4D)
- Lorsque la dégradation lysosomal est inhibée par CQ, il ya une
accumulation de LC3 puncta jaune dans tous les groupes (fig 4A et 4E)
Figure 4
Conclusion: ces données suggèrent que l’EIPA régule l’initiation et la
maturation de l’autophagie associée aux acides aminés dans les IEC.
IV. Discussion
L'autophagie est considérée comme un mécanisme de survie cellulaire pendant
les conditions de privation de nutriments, de nombreux acides aminés sont
associés à cette autophagie. En particulier, la proline et l'alanine ,Compte tenu
de ces caractéristiques métaboliques, cette étude a permis d’examiner les
effets de ces deux acides aminés sur l'autophagie dans les IEC qui d’après les
résultats obtenus sont capables de réduire l’activité autophagique induite par la
privation d’acides aminés , mais aussi de réguler l’autophagie des IEC-18 via le
NHE3.Ils ont également proposé que NHE3 pourrait contribuer à la régulation
de l'autophagie dans des circonstances spécifiques dans les IEC. D’après les
résultats obtenus NHE3, est responsable du maintien de l'équilibre Na + et H +
dans l'intestin. Ainsi, ils ont déduit que NHE3 pourrait également participer à la
régulation de l'autophagie en modulant la fonction d'absorption des acides
aminés de PAT1. Les résultats ont eu d'importantes implications cliniques, mais
l’hypothèse que l'inhibition de NHE3 entraînera une augmentation des niveaux
intracellulaires de H + et la suppression de l'activité du transporteur d'acides
aminés, entraînant ainsi une absorption altérée des acides aminés associée à la
régulation de l'autophagie dans les IEC est possible
Conclusion
Dans l'ensemble, les différents travaux soulignent le rôle important joué par
NHE dans la régulation de l'activité autophagique médiée par les acides aminés
dans les IEC, ce qui contribue en outre au maintien de l'homéostasie intestinale.
Cependant, d'autres études sont nécessaires pour caractériser l'initiation de
l'autophagie associée au NHE3 dans la pathogenèse de l'inflammation
intestinale. Cette étude approfondie du mécanisme par lequel la NHE régule
l'autophagie dans l'intestin fournira des informations importantes sur la
pathogenèse des Maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI) et
pourrait produire de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients
atteints de MICI.
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