Filière : biologie Spécialité : Physiologie de la nutrition et santé Analyse d’article Titre : l'autophagie médiée par les acides aminés dans les cellules épithéliales intestinales est régulé par l’échangeur Na +/H+ Par Abbas Alio Serki Soufyane Gonda makaou Abdoul kader Tenu par : Dr Belkaloul Année universitaire : 2019-2020 Sommaire Introduction Matériels et méthodes Résultats Discussion Conclusion Introduction L'autophagie est un mécanisme cellulaire qui consiste en la dégradation partielle du cytoplasme de la cellule intestinales en utilisant ses propres lysosomes, Elle intervient à différents niveaux, que ce soit dans la réparation d'éléments cellulaires, dans la nutrition de la cellule en cas de jeûne, dans la réponse immunitaire ou dans la mort cellulaire, c’est un processus à plusieurs étapes impliquant la nucléation, la formation d’autophagosome, la fusion d’autophagosomes en lysosomes, et ces étapes sont régies par de multiples facteurs associée à un métabolisme intestinal aberrant. Dans cette étude nous avons une autophagie dysfonctionnelle qui est causée par une variation génétique au sein des gènes de sensibilité à la maladie de crohn (ATG16L1; IRGM) entrainant une manipulation défectueuse des bactéries envahissantes chez le patient. Objectif Ainsi l’objectif principal de cette étude était de déterminer la fonction de l’échangeur Na+/H3+(NHE3) dans l’activation de l’autophagie induite par les acides aminés dans l’intestin, mais aussi la réponse autophagique après administration de la proline, l’alanine et le transport ionique dans les cellules épithéliales intestinales (IEC-18). DMEM: cellules témoins HBSS: modèle privé d’acide aminés EIPA: l'inhibiteur NHE3 5- (N-éthyl-N-isopropyl) de l'amiloride. -HAN: HBSS avec alanine -HPN: HBSS avec proline -HAE: HBSS avec alanine et EIPA -HPE: HBSS avec proline et EIPA -HBSS contenant soit 0 ou 0.3um d’EIPA respectivement HNN et HNE. - Les cellules DMEM contenant 5% de FBS et soit 0 ou 0,3 mM d'EIPA (étiquetées QNN et QNE, respectivement) II. Matériels et méthodes 1. Mise en place des modèles de cellules autophagiques _ Témoins: cellules IEC-18 de petit rat non transformée et cultivée dans un milieu EAGLE modifié (DMEM, introgen) complété avec 5% de sérum bovin fœtal(SBF) et 0,1 u/ml d’insuline bovine dans CO2 atmosphérique humidifié à 5% à 37ºc Pour le modèle de cellule autophagique Induites par la privation des acides aminés: les IEC-18 ont été incubés dans une solution saline équilibrée de HANK(HBSS) comme milieu de culture pendant 6h dans les mêmes conditions atmosphériques. _ Ensuite alanine ou proline avec ou sans l’inhibiteur NHE3-5 de l’amiloride (EIPA) a été ajoutée au milieu de culture et incubé avec les cellules pendant 6h. _ Pour identifier les concentration optimales d’acides aminés et d’EIPA qui ont provoqué le meilleur effet, diverses concentrations ont été testées _ Enfin Pour évaluer l'activité autophagique, la chloroquine(CQ), inhibiteur de la fusion autophagosome-lysosome, a été utilisée. 2. Cerise monomère (mCherry)-protéines fluorescente verte(GFP)-transfection LC3 et microscopie confocale: _ Pour la quantification de la maturation autophagique une construction mCherry-GFP-LC3 de rat tandem codé par un plasmide a été réalisée _ la transfection a été réalisée avec de la lipofectamine 2000 dans des cellules IEC-18, ensuite les cellules ont été cultivés à 37°c et 5%de CO2 pendant 6h _ le milieu a été remplacé par du milieu de culture complet frais et les cellules ont été incubées pendant 24h. _ les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS et fixées dans du paraformaldéhyde à 4%. Ces cellules fixées ont été préparées pour un balayage par fluorescence sur des lames de verre avec une solution de montage antidécoloration et la microscopie confocale a été immédiatement réalisée. 3. Quantification du flux autophagique _ le flux autophagique a été mesuré dans les IEC-18 transfectées par mCherryGFP-LC3 en utilisant un test basé sur l’imagerie. _ La microscopie confocale a été utilisée pour compter le nombre de puncta mCherry +LC3 jaune(autophagosome) et rouge (autolysosome) par cellules et l’étendue du flux autophagique(perte de fluorescence GFP dans mCherry+puncta observée comme une diminution de la puncta jaune) _ l’exposition à l’environnement acide des autolysosomes à la diminution de la fluorescence de la GFP, tandis que le signal mCherry est resté stable. 4. Réaction de polymérisation en chaine quantitative en temps réel (qRT-PCR): _ l’ARN total a été isolé de chaque échantillon cellulaire à l’aide du réactif TRIzol et transcrit inverse dans l’ADNc à l’aide du multiscribe transcriptase inverse. _ ensuite ils ont procédé à un qRT-PCR, les produits de PCR pour le gène lié à l’autophagie (ATG) chaines légères associée aux microtubules 3 (LC3), séquestosome-1/SQSTM1(p62) et le GAPDH (glycéraldéhyde3-phosphate déshydrogénase) ont été amplifiés. _ tous ces échantillons ont été normalisés chez le rat. 5. Western blot Les IEC-18 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et soumises aux traitements respectifs: -après une incubation de 6h, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS glacé (ph 7.4). ‘Les cellules adhérentes ont été collectées avec un grattoir à cellules et lysées dans un tampon d’essai de radio-immunoprécipitation contenant 1% d’inhibteur de la phosphatase pendant 30min avec un vortexage intermittent. -ensuite les lysats cellulaires ont été centrifugés à 12000 g pendant 15min à 4°c et les surnageants ont été recueillis. -la concentration en protéines a été mesurée en utilisant un kit de dosage de protéines BCA. -des échantillons de protéines(30ug/puits) de chaque groupe de traitement ont été séparés par électrophorèse sur gel de tris-glycine sodium dofécyl sulfate – polyacrylamide puis transférés sur des membranes de fluorescence de polyvinyle. Les membranes ont été bloqués avec du lait écrémé à 10% dans du sérum physiologique tamponné tris 1 et Tween-20 à température ambiante, puis sondées séparément avec LC3 B et p62 anticorps. -puis les membranes ont été lavées 3 fois et incubées avec un anticorps secondaire de chévre anti-IgG de lapin(HRP). -les membranes ont encore été lavées et les signaux d’anticorps ont été détectés par autoradiographie en utilisant un substrat de transfert western. -la détection de LC3-II a été utilisé pour évaluer le niveau de LC3 activé. -enfin une analyse densitométrique des transferts a été réalisée en utilisant le système FluorChem(FC3). 6. Microscope électronique à transmission. Les cellules ont été ensemencés dans des plaques à 6 puits, après incubation, les milieux ont été retirés et les cellules ont été lavées 2 fois avec du PBS avant d’être trypsinisés et collectés. -ensuite les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde tamponné au phosphate à 2.5% et stockées avant l’incorporation. -après lavages avec du PBS (Ph 7.4), les cellules ont été post-fixées avec 1% d’OsO4, déshydraté. -des coupes ultrafines(60-80nm) ont été obtenues collées sur des grilles de cuivre colorées avec 2 % d’acétate d’uranyle et citrate de plomb pendant 15 minute chacun; puis ont été observé après séchage pendant une nuit à température ambiante. 7. Analyses statistiques Le logiciel statistique SPSS 21.0 a été utilisé pour l'analyse des données. -Les données sont exprimées comme la moyenne ± erreur standard ou l’état type d’au moins trois expériences indépendantes. - Les différences entre les groupes ont été analysés à l’aide d’une analyse de variance unidirectionnelle(ANOVA), suivi du test t de student pour les comparaisons. -p<0.05 a été considéré comme significatif. Résultats 1. L'alanine et la proline réduisent l'autophagie induite par la famine des acides aminés : -L’addition d’alanine ou de proline a diminué le niveau de LC3-II en présence/absence de l’inhibiteur lysosomal et a réduit le flux de P62. (fig1B et 1C) -L’effet de l’alanine et de la proline combinée à l’activité autophagique pendant la famine a été examinée par les niveaux de protéines LC3. (fig S2) -LC3, P62, ATG5, 7et 12: leur expression a considérablement diminué dans HAN par rapport à HNN. Des résultats similaires ont été observés dans le groupe HPN. -les niveaux de NHE3 en présence ou en absence de HBSS, de proline ou d’alanine a également été vérifiée. (Fig S3) Figure :1 Conclusion: tous les résultats ont indiqué que l’alanine et la proline réduisaient l’activité autophagique induite par la privation en acides aminés. 2. Amélioration des niveaux de protéines LC3-II avec un traitement EIPA: -les résultats du western blot ont démontré que les niveaux totaux de protéines LC3-II ont augmenter par le traitement EIPA dans HAE et HPE respectivement par rapport aux groupes HAN et HPN. Cette augmentation était plus évidente en présence de CQ dans HAE et HPE. (fig 2A et 2B) -le flux P62 a également augmenté sous traitement EIPA. (fig 2A et 2B) L’analyse du flux LC3 et du flux P62 en présence ou en l’absence d’un inhibiteur lysosomal dans les groupes QNN (fig: S4) ont démontré que l’EIPA a inversé les réductions de l’autophagie lors de la supplémentation en acides aminés; suggérant que l’alanine et la proline pourraient chacune réguler l’autophagie des IEC-18 via NHE3. Figure :2 3. L'IEAP régule à la hausse l'expression de l'ATG: - On observe des Changements dans les structures observées par microscopie électronique à transmission dans des cellules IEC-18. -par rapport au groupe HAN l’expression de ATG5, 7, 12 et P62 ont été augmentée dans les cellules IEC-18 traitées avec EIPA (groupe HAE). Fig: 2C - L’expression ATG5, 7, 12 et P62 ont été augmenter dans les groupes HPE par rapport à HPN. Figure 3 Figure 3 -conclusion: ces données ont confirmé que l’alanine et la prolines seules régule négativement l’expression de l’ATG par NHE3. 4. Traitement EIPA augmente le nombre de vacuoles autophagiques: _ une carence en acides aminés a augmenté le nombre de vacuoles autophagiques dans le groupe HNN par rapport au groupe QNN. Fig 3A et 3B -l’ajout d’alanine ou de proline a produit moins de vacuoles autophagiques dans HAN et HPN que dans HNN. Fig 3A et 3B -le nombre de vacuoles autophagiques a considérablement augmenté dans les groupes HAE et HPE après traitement EIPA par rapport aux groupes HAN et HPN. Fig 3A et 3B 5. L’EIPA régule l’initiation et la maturation de l’autophagie: Le flux autophagique induit par l’EIPA a été évalué en présence et en absence de l’inhibiteur de fusion autophagosome-lysosome CQ. -plus de puncta LC3 jaune(autophagosome) et rouge(autolysosome) ont été observés dans le groupe HNN que dans le groupe QNN. -le nombre de puncta LC3 jaunes et rouges a été clairement réduit dans les 2 groupes HAN et HPN par rapport au groupe HNN. Fig: (4A, 4B et 4C) -l’addition d’EIPA a considérablement augmenté le nombre de LC3 puncta jaune et rouge dans les groupes HAE et HPE par rapport à HAN et HPN. (Fig4A et 4D) - Lorsque la dégradation lysosomal est inhibée par CQ, il ya une accumulation de LC3 puncta jaune dans tous les groupes (fig 4A et 4E) Figure 4 Conclusion: ces données suggèrent que l’EIPA régule l’initiation et la maturation de l’autophagie associée aux acides aminés dans les IEC. IV. Discussion L'autophagie est considérée comme un mécanisme de survie cellulaire pendant les conditions de privation de nutriments, de nombreux acides aminés sont associés à cette autophagie. En particulier, la proline et l'alanine ,Compte tenu de ces caractéristiques métaboliques, cette étude a permis d’examiner les effets de ces deux acides aminés sur l'autophagie dans les IEC qui d’après les résultats obtenus sont capables de réduire l’activité autophagique induite par la privation d’acides aminés , mais aussi de réguler l’autophagie des IEC-18 via le NHE3.Ils ont également proposé que NHE3 pourrait contribuer à la régulation de l'autophagie dans des circonstances spécifiques dans les IEC. D’après les résultats obtenus NHE3, est responsable du maintien de l'équilibre Na + et H + dans l'intestin. Ainsi, ils ont déduit que NHE3 pourrait également participer à la régulation de l'autophagie en modulant la fonction d'absorption des acides aminés de PAT1. Les résultats ont eu d'importantes implications cliniques, mais l’hypothèse que l'inhibition de NHE3 entraînera une augmentation des niveaux intracellulaires de H + et la suppression de l'activité du transporteur d'acides aminés, entraînant ainsi une absorption altérée des acides aminés associée à la régulation de l'autophagie dans les IEC est possible Conclusion Dans l'ensemble, les différents travaux soulignent le rôle important joué par NHE dans la régulation de l'activité autophagique médiée par les acides aminés dans les IEC, ce qui contribue en outre au maintien de l'homéostasie intestinale. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour caractériser l'initiation de l'autophagie associée au NHE3 dans la pathogenèse de l'inflammation intestinale. Cette étude approfondie du mécanisme par lequel la NHE régule l'autophagie dans l'intestin fournira des informations importantes sur la pathogenèse des Maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI) et pourrait produire de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints de MICI.
