Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 TP de Biochimie : Lipides Introduction Le but de ce travail pratique est de comparer les différences de proportion entre lipides de deux souches de levure différentes (type sauvage et mutant). La mutation est ensuite identifiée dans la voie de synthèse des lipides. Les lipides sont des composants majeurs de toutes les cellules vivantes. La membrane celullaire est essentiellement composée de lipides. Ils sont par consequent hydrophobes et donc facilement extraits par des solvants organiques. Les lipides sont aussi utilisée pour maintenir les protéines dans les membranes, stocker de l’énergie et synthétiser des messagers chimiques. Il existe différentes classes de lipides en fonction de leur groupes fonctionnels. On distingue notament les phosphoglycerides, les sterols, les triglycérides et les sphingolipides. Les phosphoglycerides sont composés de trois groupes principaux : un gylcerol, deux chaines d’acides gras liées au glycerol et un groupement phosphate esterifié au glycerol et lié à un alcool. En fonction de la variation de ces groupes, il existe des centaines de phosphoglycerides différents. La variation du groupe alcool donne les différents noms des phosphoglycerides. On distingue les PA (pas de groupe alccol), les PG (glycerol), les PE (ethanolamine), les PC (choline), les PS (serine) et les PI (inositol). Les phosphoglycerides sont les constituants majeurs des membranes plasmiques. Les stérols sont une autre classe de lipide très répandue. Ils contribuent à la fluidité des membranes plasmiques et sont à l’origine de la synthèse de beaucoup de messagers chimiques (hormones). Les stérols sont tous synthétisées à partir de squalène. Les triglycerides sont des lipides principalement utilisée pour socker de l’énergie. Ils ont la même structure que les phosphoglycerides mais ont une troisième chaine d’acide gras liée au glycérol à la place du phosphate. Les sphingolipides ont à peu près la même fonction que les phosphoglycerides (constituant de membranes) mais ont la particularité de contenir un azote dans leur structure. Méthodologie Extraction L’analyse porte sur les lipides d’une colonie de levure, il est donc nécessaire d’extraire ceux-‐ci parmi tous les composants de l’organisme (protéines, macromolécules, acides nucléiques, etc.). Ainsi, une séparation est effectuée par solubilisation des lipides dans des solvants organiques (méthanol, chloroforme) et par séparation physique (billes de verres et centrifugation). Analyse par TLC (qualitatif) Un moyen rapide et efficace d’analyser les lipides extraits est de les faire éluer sur des plaques de chromatographie. La chromatographie est une technique de séparation utilisant les propriétés physiques des composants, du solvant d’élution et de la phase stationnaire (plaque de 1 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 silice). Suivant l’affinité du composé pour la phase stationnaire ou l’éluant, celui-‐ci est plus ou moins entrainé le long de la plaque. Lorsqu’il s’agit d’un mélange, chacun des composés sont entrainé différemment, permettant ainsi une séparation de ceux-‐ci. Par la suite, les lipides sont révélés à l’aide de substances chimiques. Différents solvants sont utilisés en fonction du type de lipide souhaitant être élué. Par exemple, les lipides acides seront plus facilement entrainé par des solvant contenant un peu d’acide et inversement pour les basiques. Les produits utilisés pour révéler les lipides sont choisis en fonction des types de lipides à observer. La vapeur d’iode permet de révéler la plupart des lipides de manière générale. Une solution de méthanol, acide sulfurique et MnCl2 permet d’identifier tout les lipides mais colore différemment les lipides saturés et les lipides insaturés. Finalement la ninhydrine révèle les lipides contenant des groupes aminos (par ex les PE ou PS). Analyse par MS (quantitatif) La spectrométrie de masse permet d’identifier un composé par reconnaissance du rapport entre sa masse et sa charge. La spectrométrie de masse est utilisée en parallèle avec la chromatographie en phase gazeuse ou liquide (GC-‐MS ou LC-‐MS). La GC-‐MS est utilisée pour analyser les molécules non-‐polaires qui deviennent volatiles sous l’effet de la chaleur. L’échantillon est chauffé, évaporé, séparé par chromatographie en phase gazeuse et ionisé par un flux d’électron qui a pour effet de fragmenter la molécule avant d’être analysé par le spectromètre de masse. Le résultat de l’analyse est comparé à une base de donnée afin de déterminer la composition du produit. La LC-‐MS permet d’analyser des molécules chargées (ions). Après une séparation par chromatographie en phase liquide, les flux est envoyé dans le spectromètre de masse. Le résultat est également comparé à une base de donnée afin de déterminer la composition du produit. Dans tout les cas, un standard pour chaque espèce de lipide doit être mesuré afin d’étalonner le spectromètre. 2 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 Résultats : Figure 1 : 2D-‐TLC, wild type vs mutant Lipides neutres Lipides neutres 2eme élution 2eme élution Phosphatidyl-‐ ethanolamine Phosphatidyl-‐ choline Phosphatidyl-‐ ethanolamine Phosphatidyl-‐ choline Phosphatidylinositol Phosphatidylinositol Wild type 1ere élution 1ere élution Mutant Éluant : 1ere dim. Chloroforme/méthanol/ammoniaque 25% (65 :35 :5) Chloroforme/méthanol/acide acétique/eau (89 :9 :12 : 2) 2eme dim. On voit ainsi que la seule différence remarquable est la disparition importante de phosphatidyl-‐ ethanolamine (PE) dans le mutant. Figure 2 : 1D-‐TLC pour détections de stérol et lipides par deux solvants 1. Triolein standard 2. Cholestérol 3. Cholesteryl oléate standard 4. Lipide extrait du type sauvage 5. Lipide extrait du mutant 6. Ergostérol standard 7. Phospholipide mix standard 2eme élution 1ere élution 1 2 3 4 5 6 7 3 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 Système à deux élutions : -‐ -‐ 1er solvant (élution de 3 [cm] depuis les spots) : Ether de pétrole/Diethyl éther (1:1, v/v) 2ème solvant (élution de 6 [cm] depuis les spots) : Ether de pétrole/Diethyl éther (49:1, v/v) Cette analyse n’est malheureusement pas suffisamment indicative, car aucune différence n’est notable entre le type mutant et le type sauvage. Des analyses supplémentaires sont donc nécessaires. Figure 3 : TLC ninhydrine spécifique aux groupes amines (PE et PS) Éluant : Ether de pétrol/diethyl éther (49 :1) 1. PA standard 2. PE standard 3. Type sauvage 4. Type mutant 5. Mélange PL standard (PE, PS et PC) 1 2 3 4 5 Cette TLC montre bien une disparition de PE dans la souche mutante, comme on a déjà pu le voir précédemment. Néanmoins, la PE étant synthétisée postérieurement à la PA, et cette dernière n’étant pas visible dans cette analyse, il est nécessaire de porter l'expérience plus loin afin de vérifier si la synthèse est défaillante au niveau de la PE ou préalablement, au niveau de la PA. 4 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 Figure 4 : TLC iodine pour détection des lipides non spécifique Éluant : Ether de pétrol/diethyl éther (49 :1) 1. PA standard 2. PE standard 3. Type sauvage 4. Type mutant 5. Mélange PL standard (PE, PS et PC) 1 2 3 4 5 On constate ici que la PA apparaît aussi bien chez le type mutant que chez le type sauvage. Le problème réside donc au niveau de la PE, toujours moins présente chez le mutant. Figure 5 : Histogramme des quantité de lipides wild type vs mutant (cf : Annexe) 1.8E+09 1.6E+09 1.4E+09 PE 34:2 1.2E+09 PE 32:2 1.0E+09 WT Mutant 8.0E+08 6.0E+08 4.0E+08 2.0E+08 0.0E+00 PC PE PI PS En faisant une comparaison quantitative entre le mutant et le type sauvage, on constate que seule la PE change significativement de concentration, corroborant avec les analyses faites précédemment. On trouve ainsi des facteurs d’amoindrissements de 7 pour la PE 32:2 et de 5 pour la PE 34:2. 5 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 Discussion & conclusion 1ère TLC : chromatographie sur deux dimensions Cette première séparation non spécifique a permis de déterminer la compositions lipidique des deux cultures type sauvage et mutant en séparant les différents types de lipides par affinité électronique dans un solvant donné . En comparant les deux plaques TLC , on constate que la phosphatidylethanolamine (PE) présent dans le type sauvage ne l’est plus dans le mutant. Ce premier résultat informe donc sur la défaillance métabolique du mutant : la voie de synthèse aboutissant de la PE à la PS est bloquée. 2nd TLC : Stérols et lipides neutres La deuxième chromatographie basée sur la comparaison de lipides standard au type sauvage et au mutant ne donne aucun résultat significatif et utilisable pour les cultures cibles : en effet, les lipides type sauvage et mutant étant des groupes phosphatidyl, ceux-‐ci ne présentent aucune similitude avec les autres stérols et lipides neutres standards utilisés ici. Ce résultats était donc attendu. 3ème TLC : glycérophospholipides Cette troisième chromatographie basée sur le même principe que pour les stérols et lipides neutres (comparaison de standards au lipides cibles) permet de déterminer spécifiquement le type de glycérophospholipe obtenu. En effet, les standards utilisés pour cette analyse étant tous des dérivés de ce phospholipide (PE, PA et PL mix), la comparaison est donc uniquement basée sur la comparaison des diverses migrations. La révélation de la plaque TLC à la ninhydrine montre que le type sauvage et le mutant ne sont pas de simples glycérophospholipides sans groupes fonctionnels (no head group) comme la PA, puisque non révélé par marquage spécifique aux groupes amines : le type sauvage présente le même type de migration que la PE standard, tandis que le mutant présente une petite migration (migration tout de même suffisante pour éliminer l’hypothèse de la PA). On en conclut donc que le type sauvage est une phosphatidyéthanolamine. Le marquage par une solution de iodine révélant non seulement la présence de PE pour le type sauvage (à l’inverse du mutant) permet de révéler une faible quantité de migrant pour le mutant dans les zone spécifiques de la PE. Ceci implique que le mutant présente quasiment les mêmes caractéristiques que le type sauvage ou plutôt que le mutant est soumis à une contrainte métabolique. La voie métabolique est donc bloquée, si l’on s’accorde au schéma suivant (figure 6), au niveau de la phosphatidylsérine. Notre mutant est donc une PS. 6 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 Figure 6 : Voie biosynthétique des phosphoglycérides[1] Cependant, comme déjà mentionné, il existe tout de même une certaine concentration de PE pour le mutant (spot éclaircit). Ceci permet d’affirmer qu’il existe une autre voie de biosynthèse entre la PS et la PE. Cette voie est appelée «the Kennedy pathway ». Source : http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/LLbioch/POLY.Chp.6.10.html 7 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 La voie utilisée pour la formation de PE est Phosphatidates -‐> Diglycéride -‐> Phosphatidyléthanolamine. donc celle du passage Le principe de ce mécanisme est l’utilisation d’une coenzyme cytidine diphosphate éthanolamine activée (dont le précurseur est la phosphoryléthanolamine). L’analyse quantitative des résultats obtenus précédemment faite par spectrométrie de masse permet d’affirmer la nature des lipides du type sauvage et du mutant : les intégrales calculée pour la quantité de PE dans les deux souches sont significativement différentes. Ratio Type sauvage Type sauvage Type sauvage Standard PE 24:0 PE 32:2 PE 34:2 9.03E+07 2.61E+08 4.95E+08 Mutant Standard PE Mutant PE Mutant PE 24:0 32:2 34:2 8.65E+07 3.55E+07 8.19E+07 1 7 5 On constate donc que la quantité de PE est de 6 à 7 fois plus grande pour le type sauvage alors qu’il ne change pas pour les standards. On en conclut donc que le type sauvage est de la phosphatidylethanolamine et le mutant une phosphatidysérine ayant suivit une seconde voie de synthèse, à savoir «The Kennedy pathway», afin de métaboliser la PE. Pour valider cette conclusion, il suffit de comparer pour un autre type de lipide, par exemple , la phospatidylinositol : Type sauvage Standard PI 16:0 2.37E+07 Mutant Standard PI 16:0 2.13E+07 Ratio 1 Type sauvage Type sauvage PI 32:1 PI 34:1 2.95E+06 2.38E+06 Mutant PI Mutant PI 32:1 34:1 6.87E+06 8.85E+06 0 0 Pour la PI il n’y a donc aucune différence significative entre quantité de type sauvage et mutant, ne montrant donc aucune mutation dans ce cas. Sources -‐ [1] Protocole de Travaux pratique de biochimie pour chimistes et biochimistes 2eme année -‐ [2] The journal of biological chemistry : http://www.jbc.org/content/280/25/e22.full -‐ [3] http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/LLbioch/POLY.Chp.6.10.html 8 Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Samuel Joseph 28/03/2012 Annexes Graphiques chromatogram de PE du wild type et du mutant : “Nous attestons que dans ce texte toute affirmation qui n’est pas le fruit de ma reflexion personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d’une autre source est en outré place entre guillemets.” Samuel Joseph Noé Mage Romain Laverrière 9 Elias Laudato
