lipides 2012

Elias&Laudato&Romain&Laverrière&Noé&Mage&Samuel&Joseph&28/03/2012&
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TP#de#Biochimie#:#Lipides#
Introduction*
Le&but&de&ce&travail&pratique&est&de&comparer&les&différences&de&proportion&entre&lipides&de&deux&
souches&de&levure&différentes&(type&sauvage&et&mutant).&&La&mutation&est&ensuite&identifiée&dans&
la&voie&de&synthèse&des&lipides.&
Les&lipides&sont&des&composants&majeurs&de&toutes&les&cellules&vivantes.&La&membrane&celullaire&
est& essentiellement& composée& de& lipides.& Ils&sont& par& consequent& hydrophobes& et& donc&
facilement&extraits&par&des&solvants&organiques.&Les&lipides&sont&aussi&utilisée&pour&maintenir&les&
protéines&dans&les&membranes,&stocker&de&l’énergie&et&synthétiser&des&messagers&chimiques.&
Il& existe& différentes& classes& de& lipides& en& fonction& de& leur& groupes& fonctionnels.& On& distingue&
notament&les&phosphoglycerides,&les&sterols,&les&triglycérides&et&les&sphingolipides.&&
Les& phosphoglycerides& sont& composés& de& trois& groupes& principaux&:& un& gylcerol,& deux&chaines&
d’acides&gras&liées&au&glycerol&et&un&groupement&phosphate&esterifié&au&glycerol&et&lié&à&un&alcool.&
En& fonction& de& la& variation& de& ces& groupes,& il& existe& des& centaines& de& phosphoglycerides&
différents.&La&variation&du&groupe&alcool&donne&les&différents&noms&des&phosphoglycerides.&On&
distingue&les&PA&(pas&de&groupe&alccol),&les&PG&(glycerol),&les&PE&(ethanolamine),&les&PC&(choline),&
les& PS& (serine)& et& les& PI& (inositol).& Les& phosphoglycerides& sont& les& constituants& majeurs& des&
membranes&plasmiques.&
Les& stérols& sont& une& autre& classe& de& lipide& très& répandue.& Ils& contribuent& à& la& fluidité& des&
membranes&plasmiques&et&sont&à&l’origine&de&la&synthèse&de&beaucoup&de&messagers&chimiques&
(hormones).&Les&stérols&sont&tous&synthétisées&à&partir&de&squalène.&&
Les& triglycerides& sont& des& lipides& principalement& utilisée& pour& socker& de& l’énergie.& Ils& ont& la&
même&structure&que&les&phosphoglycerides&mais&ont&une&troisième&chaine&d’acide&gras&liée&au&
glycérol&à&la&place&du&phosphate.&
Les&sphingolipides&ont&à&peu&près&la&même&fonction&que&les&phosphoglycerides&(constituant&de&
membranes)&mais&ont&la&particularité&de&contenir&un&azote&dans&leur&structure.&
Méthodologie*
Extraction*
L’analyse&porte&sur&les&lipides&d’une&colonie&de&levure,&il&est&donc&nécessaire&d’extraire&ceuxXci&
parmi&tous&les&composants&de&l’organisme&(protéines,&macromolécules,&acides&nucléiques,&etc.).&
Ainsi,&une&séparation&est&effectuée&par&solubilisation&des&lipides&dans&des&solvants&organiques&
(méthanol,&chloroforme)&et&par&séparation&physique&(billes&de&verres&et&centrifugation).&&
Analyse*par*TLC*(qualitatif)*
Un&moyen&rapide&et&efficace&d’analyser&les&lipides&extraits&est&de&les&faire&éluer&sur&des&plaques&
de& chromatographie.& La& chromatographie& est& une& technique& de& séparation& utilisant& les&
propriétés&physiques&des&composants,&du&solvant&d’élution&et&de&la&phase&stationnaire&(plaque&de&

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silice).&Suivant&l’affinité&du&composé&pour&la&phase&stationnaire&ou&l’éluant,&celuiXci&est&plus&ou&
moins& entrainé& le& long& de& la& plaque.& Lorsqu’il& s’agit& d’un& mélange,& chacun& des& composés& sont&
entrainé&différemment,&permettant&ainsi&une&séparation&de&ceuxXci.&Par&la&suite,&les&lipides&sont&
révélés&à&l’aide&de&substances&chimiques.&
Différents&solvants&sont&utilisés&en&fonction&du&type&de&lipide&souhaitant&être&élué.&Par&exemple,&
les& lipides& acides& seront& plus& facilement& entrainé& par& des& solvant&contenant& un&peu&d’acide& et&
inversement&pour&les&basiques.&
Les& produits& utilisés& pour& révéler& les& lipides& sont& choisis&en& fonction& des& types& de& lipides&à&
observer.&&La&vapeur&d’iode&permet&de&révéler&la&plupart&des&lipides&de&manière&générale.&Une&
solution&de&méthanol,&acide&sulfurique&et&MnCl2&permet&d’identifier&tout&les&lipides&mais&colore&
différemment& les& lipides& saturés& et& les& lipides& insaturés.& Finalement& la& ninhydrine& révèle& les&
lipides&contenant&des&groupes&aminos&(par&ex&les&PE&ou&PS).&
Analyse*par*MS*(quantitatif)*
La&spectrométrie&de&masse&permet&d’identifier&un&composé&par&reconnaissance&du&rapport&entre&
sa& masse& et& sa& charge.& La& spectrométrie&de& masse& est& utilisée& en& parallèle& avec& la&
chromatographie&en&phase&gazeuse&ou&liquide&(GCXMS&ou&LCXMS).&
La& GCXMS& est& utilisée& pour& analyser& les& molécules& nonXpolaires& qui& deviennent& volatiles& sous&
l’effet& de& la& chaleur.& L’échantillon& est& chauffé,& évaporé,& séparé& par& chromatographie& en& phase&
gazeuse&et&ionisé&par&un&flux&d’électron&qui&a&pour&effet&de&fragmenter&la&molécule&avant&d’être&
analysé&par&le&spectromètre&de&masse.&Le&résultat&de&l’analyse&est&comparé&à&une&base&de&donnée&
afin&de&déterminer&la&composition&du&produit.&
La& LCXMS& permet& d’analyser& des& molécules& chargées& (ions).& Après& une& séparation& par&
chromatographie&en&phase&liquide,&les&flux&est&envoyé&dans&le&spectromètre&de&masse.&Le&résultat&
est&également&comparé&à&une&base&de&donnée&afin&de&déterminer&la&composition&du&produit.&
Dans&tout&les&cas,&un&standard&pour&chaque&espèce&de&lipide&doit&être&mesuré&afin&d’étalonner&le&
spectromètre.&
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Résultats*:!
!"#$%&'(')'*+,-./0'1"23'456&'78'9$4:;4'
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Éluant&:&&&1ere&dim.&& Chloroforme/méthanol/ammoniaque&25%& & (65&:35&:5)&
&&&&2eme&dim.&Chloroforme/méthanol/acide&acétique/eau& & (89&:9&:12&:&2)&
On&voit&ainsi&que&la&seule&différence&remarquable&est&la&disparition&importante&de&phosphatidylX
ethanolamine&(PE)&dans&le&mutant.&
&
'!"#$%&'*')'(+,-./'6<$%'3=4&>4"<;8'3&'84=%<2'&4'2"6"3&8'6:%'3&$?'8<27:;48'
&
1.&Triolein&standard&
&
2.&Cholestérol&
&
3.&Cholesteryl&oléate&standard&
&
4.&Lipide&extrait&du&type&sauvage&
&
5.&Lipide&extrait&du&mutant&
&
6.&Ergostérol&standard&
&
7.&Phospholipide&mix&standard&
&
&
Wild&
type&
Mutant&
1ere&élution&
1ere&élution&
2eme&élution&
2eme&élution&
Phosphatidylinositol&
PhosphatidylX&
choline&
PhosphatidylX&
choline&
Phosphatidylinositol&
PhosphatidylX&
ethanolamine&
PhosphatidylX&
ethanolamine&
Lipides&neutres&
Lipides&neutres&
1*
*
2*
*
3*
&
4*
&
5*
&
6*
&
7*
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1ere*élution*
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2eme*élution*
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Système&à&deux&élutions&:&
0 1er&solvant&(élution&de&3&[cm]&depuis&les&spots)&:&Ether&de&pétrole/Diethyl&éther&(1:1,&v/v)&
0 2ème&solvant&(élution&de&6&[cm]&depuis&les&spots)&:&Ether&de&pétrole/Diethyl&éther&(49:1,&
v/v)&
Cette&analyse&n’est&malheureusement&pas&suffisamment&indicative,&car&aucune&différence&n’est&
notable& entre& le& type& mutant& et& le& type& sauvage.& Des& analyses& supplémentaires& sont& donc&
nécessaires.&
&
'!"#$%&'@')'-./';";A53%";&'86=>"B"C$&':$?'#%<$6&8':9";&8'DEF'&4'EGH'
'
Éluant&:&
Ether&de&pétrol/diethyl&éther&&(49&:1)&
'
1.&PA&standard&
2.&PE&standard&
3.&Type&sauvage&
4.&Type&mutant&
5.&Mélange&PL&standard&(PE,&PS&et&PC)&
*
Cette&TLC&montre&bien&une&disparition&de&PE&dans&la&souche&mutante,&comme&on&a&déjà&pu&le&voir&
précédemment.&Néanmoins,&la&PE&étant&synthétisée&postérieurement&à&la&PA,&et&cette&dernière&
n’étant&pas&visible&dans&cette&analyse,&il&est&nécessaire&de&porter&l'expérience&plus&loin&afin&de&
vérifier&si&la&synthèse&est&défaillante&au&niveau&de&la&PE&ou&préalablement,&au&niveau&de&la&PA.&
' '
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2*
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3*
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4*
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5*
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5&
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!"#$%&'I')'-./'"<3";&'6<$%'3=4&>4"<;'3&8'2"6"3&8';<;'86=>"B"C$&'
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Éluant&:&
Ether&de&pétrol/diethyl&éther&&(49&:1)&
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1.&PA&standard&
2.&PE&standard&
3.&Type&sauvage&
4.&Type&mutant&
5.&Mélange&PL&standard&(PE,&PS&et&PC)&
&
On&constate&ici&que&la&PA&apparaît&aussi&bien&chez&le&type&mutant&que&chez&le&type&sauvage.&Le&
problème&réside&donc&au&niveau&de&la&PE,&toujours&moins&présente&chez&le&mutant.&
&
*!"#$%&'J')'K"84<#%:99&'3&8'C$:;4"4='3&'2"6"3&8'1"23'456&'78'9$4:;4'D>B')'L;;&?&H'
!
En& faisant& une& comparaison& quantitative& entre& le& mutant& et& le& type& sauvage,& on& constate& que&
seule& la& PE& change& significativement& de& concentration,& corroborant& avec& les&analyses& faites&
précédemment.&
On&trouve&ainsi&des&facteurs&d’amoindrissements&de&7*pour&la&PE&32:2&et&de&5&pour&la&PE&34:2.! !
0.0E+00&
2.0E+08&
4.0E+08&
6.0E+08&
8.0E+08&
1.0E+09&
1.2E+09&
1.4E+09&
1.6E+09&
1.8E+09&
PC& PE& PI& PS&
WT&
Mutant&
PE&32:2&
PE&34:2&
1*
*
2*
*
3*
&
4*
&
5*
&