SV2 Examen TP/TD de Microbiologie – Juin 2004 – Durée 30 min.

SV2 Examen TP/TD de Microbiologie – Juin 2004 – Durée 30 min.
Les deux sujets (cours et TD) sont à traiter sur des copies séparées. Détaillez vos calculs.
Soyez précis et concis. L’usage de la calculatrice est autorisé.
On se propose d’étudier l’incidence de la température sur la croissance d’Escherichia coli.
Pour cela, on dispose d’une souche sauvage DH10B et d’un mutant dérivé.
I. Une préculture de chacune des souches en milieu riche LB est utilisée pour ensemencer des
erlens contenant chacun du milieu LB : deux pour inoculer la souche sauvage DH10B, et un pour
inoculer le mutant. Les trois erlens sont alors incubés à 37°C sous agitation pendant 3 heures. A t = 3h,
une culture contrôle de la souche sauvage est maintenue à 37°C, alors que les deux autres sont
transférées à 15°C sous agitation. Durant toute l’expérience, la Densité Optique (D.O.) à 600 nm de
chacune des cultures est mesurée et les résultats sont reportés sur le graphe ci-joint.
1. A partir des cultures de la souche sauvage, délimitez les différentes phases de croissance de
la courbe obtenue à 37°C, puis de la courbe obtenue après transfert à 15°C.
2. Déterminez les temps de génération obtenus pour la souche sauvage aux deux températures
de croissance.
3. Commentez et comparez les trois courbes de croissance. Quel peut être l’effet de la
mutation ?
4. Afin de dénombrer les bactéries, un prélèvement de la culture du mutant à t = 3h est dilué
de façon sérielle jusqu’à 10
-5
. 150 µl de la dilution 10
-5
sont étalés sur milieu LB gélosé et incubés à
37°C. Le lendemain, 132 colonies sont dénombrées. Déterminez le titre bactérien de la culture à t =
3h.
II. Afin de préparer des cellules compétentes du mutant, 10 ml de la culture en LB à D.0.
600 nm
= 0,5 sont centrifugés et le culot bactérien est repris dans 0,5 ml de CaCl
2
.
1. Donnez le titre de la suspension de cellules compétentes.
2. On dispose du plasmide pCF15 qui porte un gène de résistance à la tétracycline (Tc) et le
gène cspA d’E. coli. A 0,1 ml de la suspension de cellules compétentes, on ajoute 25 ng de pCF15.
Après choc thermique, 0,9 ml de LB sont ajoutés au mélange de transformation et le tout est incubé 1h
à 37°C. La même expérience est réalisée avec le plasmide pCF0 conférant seulement la résistance à la
tétracycline. Dans chaque cas, 200 µl d’une dilution 10
-2
du mélange de transformation sont étalés sur
milieu LB gélosé additionné de tétracycline, puis incubés 48h à 37°C. Un étalement identique est
réalisé, mais les boites sont incubées 48h à 15°C. Les colonies sont dénombrées et les résultats sont
indiqués ci-dessous.
Température d’incubation pCF15 pCF0
37°C 45 44
15°C 46 0
- Expliquez les résultats obtenus.
- Calculez le nombre de transformants par µg d’ADN.
- Calculez le pourcentage de bactéries compétentes transformées.