TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Support _Cours_ D.E.S.-BIOLOGIE Parasitologie Pr Koffi D ADOUBRYN Professeur Titulaire de Parasitologie et Mycologie UFR SM Université Alassane OUATTARA TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Introduction • Les termes « autres mycoses » regroupent un ensemble hétérogène de mycoses dues à des agents fongiques variés en dehors des levures et des dermatophytes. • Il peut s’agir de mycoses superficielles, sous-cutanées ou profondes. • Certaines surviennent sur des terrains particuliers avec une évolution aiguë ou insidieuse et un pronostic vital péjoratif. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Introduction Parmi ces mycoses, on trouve: - Les aspergilloses, - Les pénicillioses, - Les fusarioses, - Les scytalidioses, - Les mycétomes, - Les scédosporioses, - Les trichosporonoses, - La sporotrichose (due à des ch. dimorphiques), - Les histoplasmoses (dues à des ch. dimorphiques),, - La blastochromomycose, - Les zygomycoses,… TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES La démarche diagnostique des autres mycoses est identique à celle de toutes les mycoses. Les étapes clés sont: - La suspicion clinique - Le prélèvement - La mise en évidence du champignon (techniques directes, techniques indirectes) - L’identification du champignon (phénotypique, génotypique) - Tests de sensibilité/résistance aux antifongiques TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Prélèvements biologiques : respect strict des règles d’asepsie Mycoses superficielles et sous-cutanées: - Squames - Fragments d’ongles - Pus - Biopsies - Suc dermique Difficultés du diagnostic de mycose superficielle: contamination du prélèvement. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Prélèvements biologiques Mycoses profondes: - Hémoculture - Biopsie - LCR - Aspiration bronchique - Lavage bronchiolo-alvéolaire Difficultés du diagnostic de mycose profonde: - colonisation des prélèvements superficiels - contamination du prélèvement TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic direct des mycoses - Examen direct - Histologie - Détection de d’antigène ou de composants fongiques (Ag spécifique (Aspergillus: galactomannane) - Culture sur milieux appropriés - Détection d’ADN par PCR Les techniques mycologiques sont représentées par l’examen direct et la culture. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses Prélèvements • • • • Flacon stérile Conservation à 4°C Isolement à partir d’un site stérile diagnostic Isolement à partir de sites pouvant être colonisés interprétation plus délicate • Prélèvements protégés > examen des expectorations TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses Ensemencements - Sabouraud + antibiotiques antibactériens (chloramphénicol et/ou gentamycine): 2 tubes (quantification) • Incubation: Tubes à 30 -32°C • vérifications tous les jours • Durée: tubes gardés 15 jours • A proscrire Sabouraud + actidione - Parfois milieux d’identification sont nécessaires: • Milieu à l’extrait de malt • Milieu Pomme de terre-Glucose-Agar TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses Examen direct +++ • Filaments mycéliens de 2 à 4 μm de diamètre, cloisonnés ramifiés (dichotomie avec angles aigus à 45°) Filaments type Aspergillus Filaments +++ forme parasitaire du champignon (ne fructifie pas in vivo) TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses Cinq (5) espèces considérées comme opportunistes (au niveau broncho-pulmonaire) • Aspergillus fumigatus • Aspergillus flavus • Aspergillus terreus • Aspergillus niger • Aspergillus nidulans. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses • Le diagnostic repose sur des critères morphologiques: - aspect macroscopique des colonies - aspect microscopique des colonies - caractéristiques des têtes aspergillaires. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses • Aspergillus fumigatus - Croissance rapide sur milieu de Sabouraud sans Actidione ou sur milieu de Czapek : apparition rapide en 3 à 5 jours de colonies d'aspect poudreux à velouté et de couleur vert foncé - L'examen microscopique permet une identification précise par les caractéristiques de la tête aspergillaire. - A maturation des structures conidiogènes, la surface de la colonie se colore en vert foncé puis en gris vert foncé. La texture superficielle est rase, parfois poudreuse, rarement floconneuse. Le revers est généralement incolore mais peut prendre une teinte rougeâtre. Colonies d’Aspergillus fumigatus TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses • Aspergillus fumigatus Cette espèce est franchement thermophile (thermotolérance), elle supporte jusqu'à 57°C. - Les conidiophores mesurent environ 300 µm de long. Ils présentent une paroi lisse et incolore. - Les têtes conidiennes forment une colonne. - La vésicule terminale a une forme en massue. - Elle porte directement de nombreuses phialides disposées parallèlement à l'axe du conidiophore. - Les phialospores verdâtres, de taille réduite ( 2 à 3 µm ) sont globuleuses et finement échinulées. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses • Aspergillus niger - La culture : apparition rapide de colonies d'aspect poudreux, velouté et de couleur noire sur milieu de Sabouraud sans Actidione ou sur milieu de Czapek. - L'examen microscopique permet une identification précise par les caractéristiques de la tête aspergillaire. - La colonie pousse en hauteur, elle est poudreuse à granuleuse, de teinte noirâtre. - Le revers est incolore à jaune. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Colonies d’Aspergillus niger TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses • Aspergillus niger - Les conidiophores sont lisses, longs ( 1 à 3 mm ), larges ( 15 à 20 µm ), à paroi épaisse, incolores à bruns. - La vésicule terminale globuleuse est unie ou bisériée. - La tête aspergillaire est radiaire. - Les phialospores sont globuleuses ou elliptiques, échinulées et mesurent de 3,5 à 5 µm. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Tête d’ A. niger TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses • Aspergillus flavus Têtes conidiennes bisériées (quelquefois unisériées), de couleur vert jaune à vert olive. Typiquement radiées à l'état jeune puis se séparant en colonnes plus ou moins bien définies à maturité. Conidiophore nettement rugueux, incolore, atteignant 1 mm de long parfois plus. Vésicule globuleuse ou subglobuleuse de 25 à 45 µm de diamètre, généralement bisériée. Phialides verdâtres, de 6-10 x 4.0-5.5 µm, formées le plus souvent sur des métules, groupées sur les trois quarts supérieurs de la surface de la vésicule. Conidies subsphériques à ellipsoïdales, de 3 à 6 µm, vert pâle et légèrement rugueuses. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergillus flavus Colonies Tête aspergillaire TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES A. nidulans Largement répandu dans le sol. Produit des aflatoxines. Sinusites et infections pulmonaires chez l’immunodéprimé. Culture Croissance rapide, colonies vert cresson. Zones jaunâtres à gris brun signent la production de cléistothèces. Revers pigment brun-rougeâtre deviennent marron. Inhibé par cycloheximide. Pousse à 37°C. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES A. nidulans Microscopie Anamorphe (forme de reproduction asexuée): Conidiophores courts, lisses et hyalins se terminant par une petite vésicule. Tête bisériée en colonne évasée (pomme d’arrosoir). Conidies globuleuses. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES A. nidulans Microscopie Conidies globuleuses. Téléomorphe (forme de reproduction sexuée): Cléistothèces sphériques (100-300µm) brun-rouge. Le cleistothèce (du grec kleistós = fermé et du grec têke = étui) est un organe en forme de sphère, sans ouverture, qui contient les asques et les ascospores chez certains champignons ascomycètes. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES A. nidulans Microscopie Entourés de Hülle cells ou cllules en noisette, qui sont des formations arrondies, réfringentes à paroi épaisse qui accompagnent souvent les formes sexuées. Peuvent se retrouver dans le mycélium végétatif. Diagnostic différentiel Conidiophores courts et bruns, sinueux, tête bisériée en colonne évasée, présence de Hülle cells. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Aspergilloses: Démarche diagnostique TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Autres moisissures • • • • Penicillium Cladosporium Alternaria Aureobasidium. Penicillium sp. A l’exception de P. marneffei ce sont des contaminants fréquents de laboratoire. Très fréquemment utilisés en agro-alimentaire. Culture Croissance rapide, colonies duveteuses souvent vertes (pouvant aller du vert au rose-orangé). Revers incolore. Revers pigment rouge et colonies vertes pour P. marneffei. Inhibé par cycloheximide. Pousse à 25°C. Penicillium sp. Microscopie Filaments fins septés et hyalins. Conidiophores simples ou ramifiés, fins et cloisonnés. Phialides disposées en verticilles, forme de bouteille. Spores rondes ou ovales, chaînes acropètes. Forme de pinceau. Diagnostic différentiel Par rapport à Aspergillus : disposition en pinceau, conidiophore cloisonné. Par rapport à Paecilomyces : phialides plus trapues. Par rapport à Scopularopsis : conidies lisses et rondes Fusarium sp. F. oxysporum est phytopathogène et cosmopolite. Agent potentiel d’onyxis, kératite, endophtalmie et de péritonites mais aussi d’infections disséminées chez l’ID. F. solani est tellurique et phytopathogène, le plus fréquent chez l’homme, à l’origine de lésions profondes chez le diabétique et l’ID. Culture F. o. : colonies duveteuses blanches devenant rose-violet revers violet F. s. : colonies duveteuses blanc-crème, revers chamois Croissance 25°C, sensible au cycloheximide Fusarium sp. Microscopie Filaments hyalins septés ramifiés, conidies à l’extrémité des phialides directement issues des filaments F. o. : deux types de conidies + chlamydospores en chaîne sur cultures anciennes *Microconidies abondantes produites par des phialides courts et solitaires, spores cylindriques, droites ou légèrement courbées *Macroconidies produites par des phialides groupées. Spores pluricellulaires de grande taille falciformes Fusarium sp. Microscopie F. s. : deux types de conidies+nombreuses chlamydospores en chaînes * Microconidies uni- ou bicellulaires à l’extrémité des phialides * Macroconidies tardives en forme de croissant (6logettes) Diagnostic différentiel Couleur de culture. Phialides (courtes pour F.o. et longues pour F.s.) Alternaria sp. Saprophytes ou phytopathogènes. Allergènes connus (rhinites, conjonctivites, asthme, bronchites…). Peuvent être impliqués dans des lésions cutanées ou sous-cutanées chez le patient immunocompétent. Rarement impliqués en lésions viscérales. Culture Texture duveteuse et épaisse. Gris très foncé, revers noir. Inhibé par le cycloheximide, pousse à 30°C pas à 37°C. Alternaria Microscopie Conidiophores bruns septés, simples ou ramifiés, droits ou flexueux. Conidies (porospores) brunes pluricellulaires à extrémité apicale rétrécie appelée « bec ». Chaînes acropètes. Diagnostic différentiel Seuls à porter des conidies ellipsoidales, à cloisons multiples avec un « bec ». TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes Agents pathogènes 2 origines différentes: * fongique: des champignons filamenteux, les principales espèces: - Madurella mycetomatis à grains noirs - Scedosporium apiospermum à grains blancs * Bactérienne: des bactéries de la classe des actinomycètes - Nocardia asteroïdes à grains blancs - Actinomadura madurae à grains brun rouge. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétome fongique Mycétome actinomycosique TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes Prélèvements - le pus qui s'écoule des fistules, recueillis stérilement (riche en grains) - biopsies cutanées - ponction des nodules fermés L'examen direct: Macroscopique des grains (couleur, taille, consistance) Microscopique après écrasement et coloration des grains à la recherche du type de filaments mycéliens TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes La culture: - on cultive le pus et les grains, - Milieux de culture: SC, SAC, Lowenstein-Jensen - et on incube à 27°C pendant 1 mois. L'examen anatomopathologique: sur biopsies colorées à l'HES et le PAS TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes • Scedosporium apiospermum Agent de mycétome à grains blancs ( Amérique, Afrique du Nord, Europe Centrale ). - A l'origine aussi d'atteintes pulmonaires ( mycétomes, bronchopneumopapthies ), il colonise fréquemment les bronches d'enfants atteints de mucoviscidose. - C'est un opportuniste chez l'immunodéprimé ( transplantés ou corticothérapie prolongée ), il provoque des atteintes viscérales ( système nerveux central, endocardite ), des arthrites, kératites et endophtalmies. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes • Scedosporium apiospermum La culture sur milieu de Sabouraud avec Actidione à 25 ou 37°C. Sur milieu au Malt, sa croissance est encore plus rapide. Il pousse jusqu'à 40°C. • Intérêt pour l'étude histologique des grains et pour la visualisation des filaments mycéliens voisins de ceux des Aspergillus mais plus étroits et moins ramifiés. • Les colonies sur Sabouraud avec et sans Actidione ont un aspect laineux ou cotonneux. La couleur est blanche au départ puis devient plus foncée: gris souris à marron. Le verso est foncé : noir. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes • Scedosporium apiospermum Il y a deux types de conidiogenèse asexuée pour une même souche : - Forme Scedosporium : . filaments mycéliens fins de 2 à 3 µm de diamètre, se ramifiant plutôt à angle droit ; . des conidiophores cylindriques ou en forme de bouteille, dressés sur ces filaments de 10 à 20 µm de long. - des conidies ( spores ovoïdes à base tronquée ) branchées directement sur les filaments ou à l'extrémité des conidiophores qui sont en fait des annellides car on peut visualiser des anneaux à leur partie apicale. Taille des conidies : 6 à 10 µm sur 3 à 6 µm. Scedosporium apiospermum TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Mycétomes • Scedosporium apiospermum Il y a deux types de conidiogenèse asexuée pour une même souche : - Forme Graphium ( associée à la forme Scedosporium mais inconstante ). Les filaments arthrosporés sont regroupés en bouquets ou corémies, ils sont bruns et ramifiés à leur sommet et produisent des conidies cylindriques plus petites 5 à 5 µm sur 2 à 3 µm, et hyalines. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Chromomycoses La chromomycose, ou chromoblastomycose, est une mycose cutanée et sous cutanée chronique, causée par des micromycètes de la classe des Hyphomycètes et de l’ordre des Dematiaceae (hyphomycètes de couleur foncée = filamenteux noirs) (dématiés) dont les formes parasitaires caractéristiques sont des cellules fumagoïdes. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Chromomycoses Au moins cinq espèces, répartis en 4 genres différents sont généralement reconnues comme agents de chromomycose humaine. Il s’agit de: - Fonsecaea pedrosoi, - Fonsecaea compacta, - Phialophora verrucosa, - Phialophora compacta, - Cladophialophora carrionii, - Rhinocladiella aquaspersa. • Fonsecae pedrosoi est majoritairement retrouvé dans les pays à climat tropical chaud et humide. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic des chromomycoses - Prélèvements Il s’agit de prélèvements de squames, croûtes ou de biopsies. Les lésions, au préalable désinfectées à l’alcool, sont grattées à l’aide d’un bistouri stérile. Les squames et croûtes obtenues sont recueillies dans une boîte de Pétri stérile. - Examen direct Le prélèvement est déposé sur une lame porte objet dans une goutte de solution de potasse diluée à 30% (KOH 30%). Le prélèvement est examiné au microscope entre lame et lamelle, au grossissement 100 puis 400. Il met en évidence des formations sphériques, de couleur brune, septées, de 4 à 12 µm de diamètre: les cellules fumagoïdes. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic des chromomycoses - Examen direct Elles sont isolées ou groupés en amas, et peuvent dans de rares cas être bourgeonnantes, germinatives voire filamenteuses. Aspect microscopique d’une cellule fumagoïde germinative TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic des chromomycoses - Culture et identification des espèces • Les squames, croûtes ou fragments de biopsie sont déposées sur milieu de Sabouraud additionné de chloramphénicol et cycloheximide. • L’incubation se fait à 26-28°C, le délai d’obtention en culture des agents de chromomycose est long, allant de 20 jours à 45 jours voire plus. • Les colonies sont duveteuses noires ou foncées et cette macroscopie ne permet pas de différencier les espèces en cause. Colonies noires, veloutées de Fonsecaea pedrosoi sur milieu SC TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic des chromomycoses - Culture et identification des espèces • Le mode de conidiogénèse et les différents types de fructifications asexuées observés au microscope vont permettre au mycologue d’identifier avec précision l’espèce en cause. Forme de fructification de type acrotheca de Fonsecaea pedrosoi TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic des chromomycoses Diagnostic histologique • Les colorations à l’hématéine-éosine- safran (HES), au PAS (Acide périodique de Schiff) et au Gomorit-Grocott permettent une excellente mise en évidence des cellules fumagoïdes (sclerotic cells) au sein des coupes histologiques. Cellules fumagoïdes pathognomoniques de la chromomycose)- coupe histologique TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic de la pneumocystose Agent: Pneumocystis jiroveci • Prélèvements : LBA (+++), crachat, biopsie • Recherche: Examen microscopique direct après coloration : - BTO; - Gomori-grocott (marquage à l’argent), - Giemsa, Ac monoclonaux • Mise en culture: NON P. jirovecii ne se cultive pas ! Arguments directs de certitude Diagnostic parasitologique Arguments directs de certitude Diagnostic parasitologique Arguments directs de certitude Diagnostic immunologique spécifique Kystes de P. jirovecii fluorescents par des Ac monoclonaux spécifiques dans un LBA TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Diagnostic de la pneumocystose • Biologie moléculaire: PCR, RT-PCR • Diagnostic indirect: - sérologie, - recherche de β-glucanes circulants (discuter?) TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses • Les zygomycoses sont des affections fongiques causées par des micromycètes de la classe des zygomycètes caractérisés par un mycélium coenocytique fait de filaments irréguliers, non cloisonnés et par des spores asexuées qui se forment à l’intérieur de sacs appelés sporocystes. • Trois ordres appartiennent aux zygomycètes, il s’agit des Mucorales, des Entomophthorales et des Mortierellales qui, eux, sont très rarement impliqués en pathologie humaine. Les Mucorales sont responsables de mucormycoses et les Entomophtorales d’entomophtoromycoses (basidiobolomycose, conidiobolomycose). TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES • Zygomycoses • L’ordre des mucorales comprend les genres Mucor, Rhizopus, Lichtheimia (Absidia), Rhizomucor, et plus rarement Syncephalastrum, Cunninghamella, Cokeromyces et Saksenaea. • Parmi les Entomophthorales, les principaux genres sont Conidiobolus et Basidiobolus. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses • Caractères macroscopiques Les Zygomycètes ont en général une croissance rapide, toutefois les mucorales sont caractérisées par des colonies à développement aérien le plus souvent (genre Mucor), floconneuses, extensives envahissant le tube ou la boîte (genres Lichtheimia, Rhizopus, Cunninghamella…). Dans le cas des Entomophthorales, les colonies sont plutôt planes et glabres. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses • Caractères microscopiques Le thalle est coenocytique, constitué de filaments peu ou pas cloisonnés, de diamètre large (5 à 20 µm de diamètre) et irrégulier. Dans les cultures âgées, des chlamydospores peuvent se former. Les filaments adhèrent au substrat par des rhizoïdes, plus ou moins développés, qui évoquent des racines. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses Les entomphtoromycoses vont intéresser les sujets originaires des zones tropicales concernées, et particulièrement: - les adultes de sexe masculin pour la Conidiobolomycose (ou Rhinoentomophthoromycose); - les enfants de 2 à 15 ans pour la basidiobolomycose ou Entomophthoromycose sous-cutanée. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses • Mucormycoses, on distingue les formes cliniques fréquentes, moins fréquentes et les formes rares - les formes cliniques sinusienne ou rhinocérébrale, formes cliniques fréquentes (souvent patient diabétique) La forme clinique sinusienne commence par le palais ou le sinus paranasal, atteint progressivement le niveau orbital et, si le diagnostic est tardif, elle s’étend au cerveau, déterminant ainsi la forme rhinocérébrale. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - les formes cliniques sinusienne ou rhinocérébrale, L’espèce Lichtheimia (Absidia) corymbifera est fréquemment mise en cause lors d’atteinte rhinofaciale ou cutanée. - les formes pulmonaire et cutanée, moins fréquentes (surtout patient neutropénique). • Dans la mucormycose pulmonaire, le patient présente une toux, une fièvre, des hémoptysies et/ou des douleurs thoraciques. Le diagnostic clinique différentiel est difficile à établir avec d’autres affections fongiques à champignons filamenteux du genre Aspergillus ou Fusarium. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses Prélèvements Pour le diagnostic des Mucormycoses, en fonction de la localisation, les prélèvements sont les suivants : - prélèvements sinusiens, pulmonaires (liquide de lavage broncho-alvéolaire, aspiration - bronchique, crachats) - prélèvements cutanés (écouvillons, biopsie) - prélèvements de selles plus rarement Pour le diagnostic des Entomophthoromycoses, il s’agit des prélèvements sinusiens ou cutanés. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Examen direct L’examen direct est fondamental, car il permet la mise en évidence dans les produits pathologiques de la forme parasitaire des zygomycètes. Il peut être fait, selon le type de prélèvement, avec ou sans éclaircissant, entre lame et lamelle, ou être réalisé après utilisation de réactifs fluorescents (Mycetfluo®, Mykoval®) ou argentique (Gomori-Grocott). . encore après imprégnation TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Examen direct A l’observation microscopique, au grossissement 100x ou 200X puis 400X, on met en évidence la présence de filaments larges, irréguliers, non ou peu cloisonnés et ramifiés à angles droits. Ces filaments sont caractéristiques des zygomycètes. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture • La mise en culture permet le diagnostic du micromycète en cause, et confirme son rôle pathogène dès lors que l’examen direct est positif. Les zygomycètes sont des champignons peu exigeants en culture, ils se développent sur des milieux de Sabouraud chloramphénicol sans cycloheximide pour les mucorales, sans chloramphénicol et sans cycloheximide pour les Entomophthorales, à des températures d’incubation de 37°C (voire plus) pour les mucorales et de 30°C pour les Entomophthorales excepté Conidiobolus incongruus dont la température optimale est de 37°C. Etant donné le caractère envahissant des cultures, l’utilisation des tubes est préférée pour éviter la contamination des autres prélèvements de l’étuve. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture • Les micromycètes de l’ordre des mucorales poussent rapidement (en 24-48h) et envahissent complètement le tube ou la boîte de culture, ils ont un aspect de coton grisâtre. • Les entomopththorales se développent lentement et donnent des colonies moins envahissantes en culture. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture • Dans le cas de la mise en culture d’un fragment de biopsie, il est recommandé de le découper en plusieurs morceaux, sans dilacérer la biopsie de manière excessive, car le mycélium non septé du zygomycète est fragile. • Les morceaux seront déposés en plusieurs points de la gélose. Ainsi, lorsque le zygomycète se développe en culture au niveau de chacun des points d’ensemencement, le diagnostic de zygomycose est conforté, car la contamination de tous les points d’ensemencement par un zygomycète de l’environnement est peu probable. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture aspect macroscopique d’une mucorale Colonie glabre, plissée de Basidiobolus ranarum Colonies de Coniobolus coronatus TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture Après 2-3 jours Après 7 jours Colonies de de Basidiobolus ranarum TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture Aspects microscopiques de Basidiobolus ranarum en culture: filaments larges, irréguliers avec des ballistospores et des «becs de perroquet » (coloration au bleu coton) TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Zygomycoses - Culture Conidies de Conidiobolus coronatus (becs de perroquet) TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose La sporotrichose est une mycose cosmopolite chronique ou subaiguë, provoquée par un champignon dénommé Sporothrix schenckii qui est un champignon dimorphique. • Il en existe deux formes, une forme sous-cutanée et une forme disséminée rencontrée chez le sujet immunodéprimé. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose • Champignon dimorphe observé sous forme d’hyphes portant des conidies (2 à 3 μm de diamètre) à 25 °C et sous son aspect levuriforme de corps en cigare (4 à 6 μm de diamètre) dans les tissus animaux, à 37 °C. • Le microorganisme croît facilement sur les milieux de Sabouraud; on obtient des colonies lobulées de couleur crème humides, lisses ou à surface ondulée avec formation occasionnelle d’un mycélium aérien. Après quelques jours, il est possible d’observer une maturation des colonies, qui noircissent et se recouvrent de replis leur donnant l’aspect du cuir. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose • Forme levure Après coloration au Gram, ces colonies sont composées de cellules bourgeonnantes sphériques de 10 à 12 µm de diamètre ou fusiformes de 2 µm sur 3-6 µm. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose • Forme levure Les bourgeons se développent généralement au niveau terminal de la cellule. Le blastospore voit sa taille augmenter progressivement et lorsqu’il atteint sa taille convenable, il se sépare de la cellule-mère pour se multiplier à son tour. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose • Forme filamenteuse Elle est caractérisée par des mycéliums cloisonnés fins. Les filaments se ramifient en formant des conidiophores qui se dressent à angle droit. A l’extrémité des conidiophores, on trouve des conidies ovoïdes (2-3 µm de diamètre) que l’on définit en rosette. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose • Forme filamenteuse Elles se détachent et laissent une marque que l’on assimile à une cicatrice. Parfois des conidies se développent directement le long du filament et on parle de disposition en acladium. TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose Prélèvements Les échantillons sont habituellement obtenus par biopsie cutanée ou consistent en des exsudats ou des suppurations provenant des lésions cutanées. Culture Outre les produits précédents, des échantillons d’expectorations, de liquide synovial, de liquide céphalorachidien et, rarement, de sang peuvent également être mis en culture pour isoler le champignon. Elle se fait sur le milieu de Sabouraud avec chloramphénicol et incubation entre 20°C et 30°C TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose Culture Aspect des colonies TECHNIQUES MYCOLOGIQUES ET DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES AUTRES MYCOSES Sporotrichose Culture Les filaments sont obtenus après une semaine. Je vous remercie!
