Enzymologie

Enzymologie
Cinétique enzymatique
E + S ⇋ ES ⇋ EP ⇋ E + P
Sa cinétique est influencée par l’enzyme, le substrat et l’environnement (pH, température,
ions, coenzymes et autres composés). Pour mesurer la vitesse de réaction transformant S en
P catalysée (= diminue l’énergie d’activation donc augmente la vitesse) par l’enzyme E, on a
𝑑S
𝑑P
P = f(t), donc la vitesse de la réaction est : activité enzymatique (AE) ≈ v = - 𝑑𝑡 = 𝑑𝑡 =
kcat [ES] (mol.𝐿−1 . 𝑠 −1 ), v est tangente à la courbe et varie au cours du temps
1 : phase très brève (invisible),
liaison rapide et réversible E+S,
ES augmente et v est
croissante
2 : toutes les enzymes sont sous
forme ES, ES constante, v
maximale et constante tant que
S >>> P
3 : EP et P augmentent, la
réaction inverse PS
commence à se produire, v
diminue
4 : vitesse réaction directe =
vitesse réaction indirecte, on a
donc l’équilibre, S et P constantes, v nulle et constante
En enzymologie on étudie toujours la phase stationnaire = « conditions de vitesse initiale »,
la vitesse initiale (𝑣𝑖 𝑜𝑢 𝑣0 ) est :
- La vitesse la plus grande de toutes les vitesses mesurables
- a une variation linéaire
- c’est l’efficacité catalytique maximale
1- Influence de la concentration en enzyme
Conditions pour l’étude :
- E variable, tous les autres paramètres sont constants
- S >>> E
- Mesure 𝑣0 pour différentes E
On observe : quand E augmente, la vitesse augmente (tangente plus pentue), on a 𝑣0 qui
varie linéairement avec E
2 - Influence du pH, température
Le pH influe sur l’état d’ionisation des acides aminés, un certain pH peut dénaturer l’enzyme
ou affecter la vitesse de formation ou de dissociation de ES, c’est pourquoi il y a un pH
optimum caractéristique de chaque enzyme.
Selon la loi d’Arrhénius, lorsque l’on augmente la température on accélère la vitesse de la
réaction puis au-delà d’un seuil la température dénature progressivement l’enzyme, c’est
pourquoi il y a une température d’inactivation spécifique de chaque enzyme ; enzymes
biologiques : température optimale de 37C.
3 - Influence de la concentration en substrat : équation de MichaelisMenten
Conditions :
- S variable, tous les autres paramètres constants
- S >>> E
- Mesure de 𝑣𝑖 pour chaque S
On observe : quand S augmente, 𝑣𝑖 augmente ; on a 𝑣0 = 𝑓(S) qui donne une hyperbole
𝑣
équilatère, si S  + ∞ alors 𝑣0  𝑣𝑚𝑎𝑥 , si S  0 alors 𝑣0  0, si 𝑣0 = 𝑚𝑎𝑥
alors on a
2
S] = 𝐾𝑚
P = f(t)
𝒗𝟎 = 𝒇(𝐒)
Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :
- Vitesse initiale maximale 𝒗𝒎𝒂𝒙 : activité enzymatique maximale lorsque l’enzyme est
saturée en substrat (S → ∞)
-
Constante de Michaelis-Menten 𝑲𝒎 : concentration de S qui permet d’avoir
État pré-stationnaire
𝑣𝑚𝑎𝑥
2
État stationnaire
 𝑘−2 est négligé
Etape 1 : formation réversible du complexe ES, état pré-stationnaire
Etape 2 : toutes les enzymes sont complexées, c’est l’état stationnaire : ES
constante et S >>> P, réaction inverse P  S est négligée, 𝑘+2 = constante
catalytique (= constante de vitesse de la réaction enzymatique)
S
𝑣0 = 𝑣𝑚𝑎𝑥 𝐾 + S avec
-
𝑚
Avec 𝐾𝑚 =
-
𝑘−1 + 𝑘+2
𝑘+1
=
ES
ES
en mol.𝐿−1 :
Caractéristique fondamentale du couple E/S
Ne dépend pas de la concentration en enzyme
Indicateur de l’affinité de E pour S
Assimilée à 𝐾𝐷 du complexe ES
Avec 𝑘+2 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 la constante catalytique = nombre de turn-over = nombre de molécules de
S transformées / sec / molécule de E
𝑘−1 et 𝑘𝑐𝑎𝑡 sont des constantes de premier ordre (𝑚𝑖𝑛−1 ), 𝑘+1 est une constante du second
ordre (mol/L/min)
Avec 𝑣𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 𝐸𝑇  (𝐸𝑇  = ES + E ) en mol.𝐿−1 . 𝑠 −1 qui est la 𝒗𝟎 maximale, dépend
de E
Problème : il est difficile d’exploiter la représentation en hyperbole de Michaelis-Menten, on
va donc la linéariser.
Représentation de Lineweaver et Burk
1
1
Transformation de Lineweaver et Burk (doubles inverses) : 𝑣 = 𝑓(S)
0
1
𝐾𝑚 1
1
=
+
𝑣0
𝑣𝑚𝑎𝑥 S 𝑣𝑚𝑎𝑥
4 - Mesure de l’activité enzymatique
-
Unités de mesure
UI : unité internationale = quantité d’enzyme transformant 1 mole de substrat par
minute (mol/min) dans les conditions standard (température et pH)
1 UI = 16,66 nkatal
1 nkatal = 60.10−3 UI
Katal (kat) : unité SI = quantité d’enzyme transformant 1 mole de substrat par
seconde (mol/sec)
Quantité catalytique = 𝑄𝑐𝑎𝑡 en UI = quantité d’enzyme dans un milieu réactionnel
capable de réagir avec le substrat présent dans le milieu
𝐴𝐸 𝑚𝑎𝑥
Concentration catalytique = 𝐶𝑐𝑎𝑡 = 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑔 𝑜𝑢 𝐿 en UI/L ou UI/g = quantité
-
analytique ramenée à 1 g ou 1 L de solution d’enzyme
𝐶𝑐𝑎𝑡
Concentration catalytique spécifique = 𝐶𝑐𝑎𝑡 𝑠𝑝é = [𝑝𝑟𝑜𝑡é𝑖𝑛𝑒𝑠]
en UI/mg de protéines
-
-
-
Activité molaire spécifique ou nombre de rotation (turn-over number) = 𝑘𝑐𝑎𝑡 en
𝐴𝐸 𝑚𝑎𝑥
𝑚𝑖𝑛−1 = AS max x MM enzyme = 𝐸  = nombre de molécules de substrat
𝑇
-
-
-
transformées / sec / molécule d’enzyme
𝐴𝐸 𝑚𝑎𝑥
Activité spécifique (AS) = 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑔 𝑜𝑢 𝐿 (utilisation pour le suivi de purification d’une
enzyme) = activité enzymatique par unité de masse de protéines totales (UI/mg) ou
par volume de solution d’enzyme (UI/L), traduit le degré de pureté de l’enzyme
AS = activité enzymatique / masse totale de protéines
Indice de purification (sans unité) = degré d’enrichissement en enzyme après
purification par rapport à l’extrait de départ
Enrichissement = AS de la fraction / AS de l’extrait de départ
Rendement = pourcentage d’enzyme récupéré par rapport à la quantité de départ
R = (activité totale extrait final / activité totale extrait initial) x 100
5 - Influence des inhibiteurs
Les effecteurs sont des molécules de natures diverses qui interfèrent avec une étape de la
catalyse :
- Soit en l’accélérant : activateurs
- Soit en la ralentissant : inhibiteurs (réversibles ou irréversibles)
Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques et en
thérapeutique.
a) Inhibitions « irréversibles »
En cas de liaison covalente de l’inhibiteur à l’enzyme on parle d’inhibiteur suicide.
Ils provoquent une destruction d’un groupement essentiel à l’activité donc l’enzyme devient
incapable de fixer ou transformer le substrat (ça n’existe pas dans le corps mais intérêt en
thérapeutique, exemple des AINS)
b) Inhibitions réversibles
Il y en a 3 types : compétitive , non compétitive et incompétitive. La fixation de l’inhibiteur
sur l’enzyme se fait par des liaisons faibles (formation et rupture faciles et rapides).
Inhibition compétitive
L’inhibiteur a une analogie structurale avec le substrat donc il se fixe au niveau du site actif à
la place du substrat
Il y a une levée de l’inhibition par excès de substrat : déplacement de l’équilibre entre EI et E.
𝑣𝑚𝑎𝑥 est inchangé, 𝐾𝑚 augmente donc il y a diminution de l’affinité apparente pour S.
Inhibition non compétitive
Il n’y a pas d’analogie structurale avec le substrat donc la fixation de l’inhibiteur se fait sur
un site distinct du substrat (site actif). L’inhibiteur entraîne un changement de conformation
en se fixant à l’enzyme et diminue ainsi la vitesse de réaction. L’inhibiteur a la même affinité
sur forme libre E et forme complexée ES, indépendamment de S, une fixation simultanée de
I et S est possible. 𝑣𝑚𝑎𝑥 diminue, 𝐾𝑚 inchangé donc l’affinité pour S est inchangée.
Inhibiton incompétitive
Il y a une fixation sur forme ES (E déjà complexée au S), on a alors un équilibre E + S ⇋ ES
déplacé en faveur de ES et l’affinité apparente de E pour S augmente donc 𝐾𝑚 diminue mais
le complexe ESI n’évolue pas donc 𝑣𝑚𝑎𝑥 diminue.
Les enzymes allostériques
Réponse rapide, fine et adaptée aux conditions intracellulaires, leur cinétique ne suit ps
l’équation de Michaelis-Menten.
Ce sont des protéines allostériques donc :
- Elle sont complexes, multimériques
- Ont plusieurs sites de fixation pour un ou plusieurs ligands
Un effecteur peut se fixer par des liaisons faibles sur un site régulateur distinct du
site catalytique ; site régulateur et catalytique sur méme ou différentes sous-unités
- La fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands
La liaison d’un effecteur provoque un changement conformationnel = transition
allostérique (forme active R ⇋ forme inactive T), modifie la fixation du substrat ou
d’autres modulateurs ; il y a une coopérativité avec le modulateur et/ou le substrat
pour l’activité
Régulation positive : activateurs, en particulier le substrat lui-même
Régulation négative : inhibiteurs en particulier le produit final de la voie = rétro-inhibition,
rétro-contrôle négatif
effet
effecteur
Particularité
Homotrope positif
Substrat S de l’enzyme
Favorise sa propre
transformation
Hétérotrope positif
Hétérotrope négatif
Activateur allostérique A de
l’enzyme
inhibteur allostérique I de
l’enzyme
Pas d’analogie structurale
avec S
Pas d’analogie structurale
avec S
La cinétique allostérique est différente de celle de Michaelis-Menten, on a une courbe
sigmoïde qui traduit un phénomène de coopérativité : on a une transmission des
changements conformationnels d’une sous-unité à l’autre grâce aux interactions non
covalentes à l’interface entre les sous-unités.
Il y a 2 types d’enzymes allostériques :
- Système V : rares
V = f ([𝑆]) hyperbole (=enzyme michaeliennes)
𝑣𝑚𝑎𝑥 varie en présence d’effecteur
- Système K : les plus fréquentes
V = f ([𝑆]) sigmoïde, 𝐾1/2 varie en présence d’effecteur