CENTRE ANTI CANCER – BATNA COURS DE RESIDANAT 1ERE ANNEE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE MEDICALE 1 I. NUTRITION : -Pour qu’une bactérie puisse vivre et se reproduire elledoit trouver dans son environnement de quoi satisfaire ses besoins nutritifs. -La Nutrition bactérienne étudie les besoins nécessaires au fonctionnement et à la croissance de la bactérie , ainsi que les facteurs physico-chimiques susceptibles de les influencer . A- Besoins élémentaires: 95% du poids sec bactérien correspond à quelques éléments majeurs ( Macro-éléments): L’eau : Besoin majeur : 75 à 80% du poids total de la cellule bactérienne. C’est une source d’H2 et d’O2. Nécessaire pour de nombreuses réactions d’hydrolyse Permet le transport des nutriments dans le cytoplasme. Entre dans la composition de tous les milieux de culture. Le Carbone: éléments constitutif le plus abondant de la bactérie. Le plus simple des composés carbonés: CO2. On distingue: o Les bactéries capables de se développer en milieu inorganique contenant le CO2 comme seule source de carbone: Bactéries Autotrophes o Les bactéries Exigeant des composés organiques comme source de carbone (exp : polysaccharides) Bactéries Hétérotrophes. L’Azote: entre dans la composition des protéines Les éléments minéraux: o Phosphore: Il entre dans la composition des acidesnucléiques, de nombreux coenzymes et de l’ATP. Il permet la récupération , l’accumulation et la distribution de l’énergie dans la cellule . o Soufre: Il entre dans la composition de certains acides aminés et des protéines. o Na, K, Mg et Cl : interviennent dans l’équilibre physicochimique de la cellule. 2 o Fer : pour les enzymes ou les coenzymes (Fer des cytochromes.) o -D’autres à l’état de traces, souvent apportés par l’eau «oligoéléments» (5%) : Cu, Zn ,Mn, Co , Ca… B. Besoins énergétiques : Ils couvrent les dépenses engagées dans les processus catabolisme et de biosynthèse. Les bactéries peuvent utiliser comme source d'énergie Soit l'énergie lumineuse : bactéries Phototrophes. Soit l'énergie fournie par les processus d'oxydo-réduction : bactéries chimiotrophes. Sources d'énergie Les bactéries Phototrophes font appel à des composés minéraux ou organiques comme sources d'électrons. Si le substrat oxydable est minéral, la bactérie est dite Photolitotrophe (comme le font les végétaux) Exemple: les bactéries sulfureuses pourpres ou vertes. Si le substrat oxydable est organique, la bactérie est dite Photo-organotrophe. Exemple: les bactéries pourpres non sulfureuses Les bactéries Chimiotrophes utilisent des composés minéraux ou organiques comme "donneurs ou "accepteurs d'électrons". Si le donneur d’électrons est un corps minéral, la bactérie est dite Chimiolithotrophe. Si le composé est organique, la bactérie est dite Chimio organotrophe =˃ Bactéries pathogènes d’intérêt médical. C. Substances spécifiques: ou « Facteurs de croissance » 3 Métabolites essentiels dont certaines bactéries ont besoin et qu'elles sont incapables de synthétiser par défaut enzymatique. Ca peut être des Acides aminés, des bases puriques et pyrimidiques ou des vitamines. Les bactéries exigeant des facteurs de croissance sont appelées Auxotrophes. Exemple : Haemophilus influenzae qui ne peut cultiver que sur milieu enrichi au sang (facteurs V et X) Les bactéries non exigeantes sont dites: Prototrophes. Exemple : E.coli n'exigeant aucun facteur de croissance, se multiplie sur milieu minimum. Les facteurs de croissance Sont actifs Sont étroitement spécifiques. présentent à des caractères concentration communs: infirme. D. Facteurs influençant la croissance : 1/- Les facteurs physiques: les nutriments doivent être apportés à la bactérie dans les conditions d’environnement qui lui conviennent, sinon, ils peuvent l’inhiber. a. La température: Selon le comportement de la bactérie vis-à-vis de la température, on distingue: Les bactéries mésophiles: T°Optimale de croissance = 20°C -40°C Bactéries pathogènes+++. Les bactéries thermophiles: T°=45°C -65°C .bactéries des sources thermales. Exp: Bacillus et Clostridium. Les bactéries psychrophiles: T° = 0°C =˃ bactéries contaminent les produits laitiers, les produits biologiques (sang et dérivés). Exp: Pseudomonas, Acinetobacter Les bactéries cryophiles: T°Optimale de croissance < à 0°C. bactéries des océans et des glaciers. b. PH : Les bactéries préfèrent un pH neutre ou légèrement alcalin (7 – 7.5). Exemples: E.coli cultive entre pH 5 et pH8. Solutions Tampons : Sont inclus dans les milieux de culture afin d’éviter les brusques variations de pH dues aux modifications chimiques résultant de la dégradation de substrats. Les tampons phosphates sont les plus utilisés parce qu’ils: Permettent de garder le pH dans une large zone autour de 7. 4 Ne sont pas toxiques. Représentent une source de phosphore. Il existe aussi des bactéries : - Alcalophiles qui préfèrent les pH alcalins, cas du Vibrio. - Acidophiles qui se multiplient mieux dans des milieux acides, cas des Lactobacillus. c. La Pression Osmotique : -Les bactéries tolèrent des variations de concentration ionique grâce à la paroi spécifique des procaryotes(Muréine). -Certaines bactéries tolèrent des concentrations salines importantes (Halotolérantes) Exp: *Enterococcus (6.5% Nacl) *Staphylococcus aureus ( 7.5% Nacl) d. La Pression partielle d’Oxygène Etude des types respiratoires On utilise le milieu viande-foie (VF) régénéré et coulé en tube profond. : : Les bactéries aérobies ont obligatoirement besoin d'oxygène libre lors de leur métabolisme énergétique (utilisent l'oxygène moléculaire comme accepteur final d'électrons). exp : Pseudomonas aeruginosa Les bactéries anaérobies ne peuvent se multiplier et survivre qu'en l'absence d'oxygène (O2 toxique). exp: Clostridium botulinum. Les bactéries aéro-anaérobies peuvent croître aussi bien en présence qu'en absence d'oxygène. exp : Entérobactéries. Les bactéries anaérobiesaérotolérantes tolèrent l'oxygène mais leur croissance est meilleure en anaérobiose. exp: Streptococcus spp. Les bactéries microaérophiles ont besoin d'une faible tension d'oxygène, elles ne supportent pas une tension en oxygène équivalente à celle de l'air. exp: Campylobacter jejuni. 5 II. CROISSANCE BACTERIENNE : - Accroissement ordonné de tous les composants de la bactérie.elle se manifeste par une augmentation numérique des cellules bactériennes et non pas une augmentation de taille comme chez les organismes supérieurs (homme, animal, plante). Les bactéries sont des organismes asexués dont la reproduction a lieu par division cellulaire ou reproduction binaire encore appelée scissiparité. La reproduction se fait selon trois phases : Allongement de la bactérie, Duplication des constituants, Séparation. La croissance d’une bactérie placée dans les conditions idéales de culture peut être définie par 02 constantes : Le temps de génération (G) : le temps requis pour un dédoublement du nombre de bactéries. Exps: E.coli: TG= 20mn, M.Tuberculosis: TG= 20 h. Le taux de croissance (µ ): le nombre de division par unité de temps. Exp: µ= 3 pour E.coli . µ= n /t (1h) Au cours de la croissance, le milieu s’appauvrit en éléments nutritifs disponibles et s’enrichit en produits du catabolisme, souvent toxiques. 1- Techniques de mesure de la croissance bactérienne : a-Dénombrement direct des bactéries: 1-Numération totale : Examen au microscope à l’aide d’une cellule hématimétrique. Mesure automatisée avec un compteur de particules. b- Méthode d’épi fluorescence : Echantillon filtration coloration/acridine-orange lumière bleue Dénombrement Bactérien par Microscope à épi fluorescence. 2-Numération des cellules viables : Les bactéries cultivables forment des colonies sur un milieu de culture approprié. On compte les colonies apparues sur un milieu gélosé inoculé avec un volume connu d’une suspension bactérienne. Chacune de ces colonies est supposée dérivée d’une seule bactérie appelée :unité formant colonie UFC. b-Mesure de la biomasse: 6 1-détermination du poids sec: Technique longue et délicate. Microorganisme récolté par Centrifugation ou par filtration sur membrane Lavage culot desséché Poids sec. 2-Mesure de la Densité optique (DO): On évalue la DO du milieu de croissance en fonction du temps, à une longueur d’onde donnée. c-Marqueurs chimiques: Dosage des protéines, DNA, ATP. - Cinétique de la croissance bactérienne : L'étude de la croissance bactérienne dans le temps peut être représentée sur un graphique en portant: * En ordonnée, les valeurs des logs de la D.O du milieu de culture. * En abscisse, le temps (en heures). La courbe de croissance obtenue montre alors 6 phases: Phase I: Phase de latence : Accoutumance des bactéries à leur environnement, synthèse des premières enzymes. Elle dépend de la nature du milieu de culture et de la taille et la nature de l’inoculum : Le temps de latence est long dans un milieu minimal synthétique inoculé avec des bactéries provenant d’un milieu riche contenant de nombreux composés organiques. Il correspond au temps nécessaire à la bactérie pour la synthèse d’enzymes supplémentaires nécessaires à la biosynthèse. Le temps de latence est long dans un milieu minimal synthétique inoculé avec un petit nombre de bactéries provenant d’un milieu identique : il correspond au temps nécessaire pour la bactérie pour neutraliser certains produits toxiques=˃ce temps peut être écourté par l’ajout d’un inoculum lourd. Phase II : phase d’accélération : avec augmentation de la vitesse de croissance, µ tend vers son taux maximal. Phase III: Phase de croissance exponentielle : Le taux de croissance est constant, il atteint la valeur maximale. Il est influencé par la T°, le PH, la nature et la [ ] des aliments. Phase IV: Phase de ralentissement :épuisement du milieu de culture et accumulation des déchets. Phase V: Phase stationnaire: masse bactérienne maximale :les bactéries vivent sur leurs réserves. sa durée est variable souvent courte en milieu synthétique. Phase VI: Phase de déclin: La masse bactérienne décroît du fait de la lyse des bactéries. Croissance en Biofilm : Les bactéries peuvent s'attacher aux surfaces, s'associer entre elles et s'entourer d'un polymère organique pour constituer un biofilm, cela leur confère une plus grande résistance aux produits d’hygiène et aux antibiotiques. Les biofilms intéressent tous les domaines de la microbiologie et de la médecine (matériels d'exploration, matériels implantés, muqueuses lésées), imposent une réflexion en matière d’hygiène hospitalière, de prévention et de désinfection du matériel de soin . modifications de la courbe de croissance : a-Croissance continue: Dans un milieu non renouvelé, la phase exponentielle de croissance ne peut durer que quelques heures. Dans un but industriel (préparation de vaccins, d'anatoxines, vitamines…) il peut être 7 nécessaire de prolonger cette phase en renouvelant constamment le milieu de culture et en éliminant les produits du métabolisme ou déchets . b- La diauxie: Se traduit par une courbe de croissance diphasique. On fournit à la bactérie 2 sources de carbone et d’ énergie. Exp : Milieu contenant du glucose et du lactose. La bactérie utilise le glucose en premier, lorsqu’il sera épuisé et après un certain temps de latence, les enzymes nécessaires à la dégradation du lactose serons mises en jeux. La survie des bactéries: 1-État végétatif : Bactéries vivantes et en croissance Dans un milieu adéquat. 2-État de repos : Les cellules sont vivantes et sans croissance. Il correspond à un minimum d’échange avec l’extérieur . 3-La forme sporulée : État particuliers de repos. C’est une forme de résistance que peuvent mettre en jeu certaines bactéries. Applications de la croissance bactérienne : 1. Le diagnostic bactériologique : Culture et identification des germes à partir du prélèvement pathologique (urine , selle , sang , LCR…) 1.1 Culture et dénombrement bactérien :Le dénombrement est d’une importance capitale . L’ensemencement d’un volume défini d’échantillon sur milieu de culture gélosé permettra, après dénombrement des colonies bactériennes obtenues après incubation , de calculer le nombre de bactéries viables présentes dans l’échantillon analysé. Le résultat est exprimé en Unités Formant Colonie par millilitre (UFC/ml). Les Systèmes pour hémoculture: Actuels 1-Systèmes non automatisés: Exp : Hémoculture Signal (OXOID). 2- systèmes automatisés : Détection d’un produit du métabolisme biochimique (CO2). Exp : BACT/ALERT Détection par technique colorimétrique. 1.2 Identification bactérienne : L'identification des bactéries est effectuée en utilisant des milieux de culture dont la composition permet de mettre en évidence une activité enzymatique par exemple. 1.3 Détermination de la sensibilité aux antibiotiques. L’étude de la croissance bactérienne en présence de différents antibiotiques permet de définir pour chaque bactérie 8 analysée un profil de sensibilité / résistance aux différentes molécules antibiotiques. Automates d’identifications et d’antibiogrammes : A l'heure actuelle, des systèmes automatisés plus sensibles effectuent des mesures photométriques en continu et peuvent identifier les principales bactéries isolées en pratique médicale en moins de 5 heures. 2- Divers Contrôles Contrôle de la qualité microbiologique : Des aliments. Des eaux du réseau de distribution. Des médicaments. 3-L’efficacité de la stérilisation : Mesure de l’inactivation bactérienne lors de stérilisation : autoclave, en présence de désinfectants et des antiseptiques. (Tester la stérilisation par la mise d’une bactérie qui sporule car généralement elle résiste au température élevée). 9
