BIO401 Examen terminal 2nde session (27 juin 2017) Documents et calculatrices non autorisés Notation sur 80 points, 6 pages _____________________________________________________ PARTIE A : Métabolisme bactérien 15 pts Une bactérie hyperthermophile, dont le nom de code est pour l’instant AM4, a été isolée dans l’un de ces vers qui peuplent les fonds des océans, au niveau des fumeurs sous-marins (hydrothermal vents). Cette bactérie peut être cultivée dans un milieu contenant NaCl, KCl, MgSO4, CaCl2, NH4Cl, Na2SiO3, Na2S, Na2HPO4, NaHCO3, un peu de cystéine et d’extrait de levure (peptides et acides aminés), ainsi que quelques oligo-éléments et des vitamines ; le pH est ajusté à 6,8 et la culture incubée à 80°C sous une atmosphère constituée de 100% de monoxyde de carbone (CO). La figure ci-contre présente l’évolution de la biomasse () et de la concentration en CO () et H2 () au cours du temps. Par la suite, différents essais ont été réalisés en faisant varier certains paramètres du milieu de culture, qui donnent les résultats suivants : essai 1 2 3 4 5 extrait de levure + + + + CO + + - N2 + - soufre (S0) + + croissance + + - N.B. : l’azote diatomique (N2) n’est pas métabolisé, mais sa présence permet de chasser l’oxygène. 1 Par ailleurs, les chercheurs ont identifié deux enzymes qui jouent un rôle essentiel dans le métabolisme de cette bactérie (en dehors du métabolisme central) : - une CO déshydrogénase, qui catalyse la réaction CO + H2O → CO2 + 2 e- + 2 H+ ; - une hydrogénase, qui catalyse la réaction H2 ↔ 2 e- + 2 H+. a) Pouvez-vous dire si la bactérie AM4 est (vos réponses devront être justifiées) : - autotrophe ou hétérotrophe ? (1 point) - chimiotrophe ou phototrophe ? (1 point) - lithotrophe ou organotrophe ? (1 point) on ne peut pas dire si la bactérie est autotrophe ou hétérotrophe puisque rien n’est dit quant à sa capacité d’utiliser CO2 comme source de carbone vu qu’il s’agit d’une bactérie vivant dans les grands fonds marins, et que la lumière ne parvient pas à ces profondeurs, il y a fort à penser qu’il s’agit d’une bactérie chimiotrophe le monoxyde de carbone, qui n’est pas une molécule organique (pas d’hydrogène !) pouvant servir de source d’électrons, la bactérie est donc lithotrophe b) Quel(s) rôle(s) l’extrait de levure joue-t-il dans le métabolisme d’AM4 ? (1 point) l’extrait de levure est essentiel pour la croissance bactérienne, mais doit obligatoirement être couplé avec un donneur d’électrons (CO ou S0), donc son rôle (unique ?) est de servir de source de carbone c) Que pouvez-vous dire du comportement d’AM4 vis-à-vis de l’oxygène ? (1 point) si l’on compare l’essai 5 à l’essai 4, on observe deux différences, à savoir l’absence d’azote diatomique dans l’atmosphère (donc la présence d’oxygène) et de croissance, donc on peut en déduire que la bactérie ne pousse pas en présence d’oxygène, auquel cas elle anaérobie stricte d) Dans l’essai 4, quel rôle le soufre joue-t-il ? Quel pourrait être le produit de son métabolisme ? (3 points) si l’on compare l’essai 4 avec l’essai 1, on voit que le soufre remplace le monoxyde de carbone, et que cela ne change rien à la croissance bactérienne, donc on peut en déduire que le soufre sert de donneur d’électrons si le soufre est oxydé, le produit d’oxydation pourrait être du sulfate e) Quel rôle la production d’hydrogène mise en évidence dans la figure ci-dessus joue-t-elle dans le métabolisme de la bactérie ? Quel pourrait-être l’intérêt d’une telle production d’un point de vue énergétique ? (2 points) 2 La production d’hydrogène permet d’utiliser les électrons produits par l’oxydation du CO Si, entre leur production par la CO déshydrogénase et leur utilisation par l’hydrogénase, les électrons transitent par un système de transport d’électrons membranaire, il en résultera la production d’un gradient de protons, et donc, grâce au retour des protons dans la cellule via une ATPase membranaire, la production d’ATP f) Contrairement à AM4, les autres bactéries connues pour pouvoir utiliser le monoxyde de carbone sont des méthanogènes (qui produisent du méthane). Pourriez-vous dire : - s’il s’agit là d’une oxydation ou d’une réduction (justifiez votre réponse quant à l’origine et au devenir des électrons) ? (2 points) Le méthane (CH4) est la forme la plus réduite du carbone monoatomique : il s’agit donc là d’une réduction Les électrons injectés sur le carbone (pour donner le méthane) peuvent provenir de l’oxydation du CO (cf. réaction de la CO déshydrogénase) - quelle(s) autre(s) molécule(s) est (sont) obligatoirement produite(s) dans un tel métabolisme ? (1 point) Du coup, on se retrouve avec deux formes de molécules carbonées, produites à partir du CO : CH4 et CO2 - quel pourrait être le comportement de telles bactéries vis-à-vis de l’hydrogène ? (2 points) sachant que, pour produire méthane et dioxyde de carbone, il faut utiliser deux molécules de monoxyde de carbone ainsi que 4 atomes d’hydrogène, ici, il n’y aura pas de production d’hydrogène mais, au contraire, une consommation de deux molécules d’hydrogène (utilisé comme donneur d’électrons) : 2 CO + 2 H2 → CH4 + CO2 ! PARTIE B : Bioénergétique-Enzymologie (35 points) Question 1 (10pts) La demi équation redox correspondante au couple redox ci-dessous : acétaldéhyde/éthanol : E'° = - 0,2 V est la suivante : acétaldéhyde + 2 H+ + 2e- éthanol 3 Ce couple réagit avec le couple redox NAD+/ NADH,H+ (E'° = - 0,3 V). a) Ecrire la réaction d'oxydoréduction dans le sens de l'oxydation de l’éthanol. éthanol + NAD+ acetaldehyde + NADH + H+ b) Calculer ΔG'°. ΔG'° = - n F ΔE'° = - 2 x 96500 x(-0,3 - (-0,2)) = -193000 (-0,1) = 19300 J. mol-1 c) Préciser la signification de l’abréviation ΔG'°. Que représente cette donnée ? Quelles sont les conditions dans lesquelles elle est mesurée et dans quel sens aura lieu la réaction d'oxydoréduction écrite ci-dessus dans les conditions précitées ? variation d'énergie libre dans les conditions standard apparentes elle représente la quantité de travail maximale qu'une réaction spontanée est susceptible de fournir au milieu extérieur. Conditions standard (P = 1bar ; T= 298°C ; [chaque réactant] = 1M) apparente (pH = 7) valeur positive donc non spontanée dans les conditions standard apparente Dans le foie, dans le cadre de la détoxification de l’éthanol, la réaction a lieu dans le sens de l'oxydation de l’éthanol. d) Comment pouvez-vous l'expliquer ? Dans les cellules les conditions ne sont pas standard il faut calculer le ΔG' pour connaître le sens de la réaction : ΔG' = ΔG'° + RT ln ([produits])/([réactifs]) et selon les conditions cellulaires le ln peut être différent et faire basculer le signe du ΔG'. Donnée : F = 96 500 C. Question 2 (14 points) Dans le foie, l’oxydation de l’éthanol est catalysée par l’alcool déshydrogénase. On mesure l'activité de l’alcool déshydrogénase dans les conditions suivantes : - 2,6 mL d'une solution tampon pH 8 4 - 0,1 mL d'une solution de NAD à 6,15 mg.mL-1 (340nm = 6000 L.mol-1.cm-1) - 0,2 mL d'une solution à 1 M d'éthanol - Pré-incubation 5 min. à 25°C - Addition de 0,1 mL de solution d’alcool déshydrogénase contenant 2 mg.mL-1 de protéines pour démarrer la réaction. On mesure l'absorbance du milieu réactionnel (maintenu à 25°C) à 340 nm en fonction du temps dans une cuve de trajet optique de 1 cm. La tracé de la courbe A340nm = f(t) donne une pente à l’origine de 0,36 min-1. a) Donner la valeur du volume réactionnel dans cette expérience. Vreact = 2.6 +0.1+ 0.2 + 0.1 = 3 mL b) Donner la vitesse initiale V0 de la réaction en M.s-1. V0 = ∆P/∆t = ∆A/(340nm .l. ∆t = 0.36/ 6000.1.60 =10-6 M.s-1 c) Donner la définition de l'activité enzymatique en précisant ses unités et les conditions expérimentales pour effectuer sa mesure. L’AE mesurée à pH opt, T°opt, [S]0 saturante et ramenée à 1mL de solution enzymatique correspond au nombre de moles de substrat transformées en produit par l’enzyme en fonction du temps exprimé en secondes. L’AE est exprimée en mol.s-1 ou katals. d) Calculer l'activité enzymatique de 1 mL de solution d’alcool déshydrogénase. AE (0.1mL de ADH) = V0 x Vreact = (10-6 x 3.10-3) = 3 10-9 kat AE (1mL de ADH) = AE (0.1mL de ADH) x 10 = 30 nkat.mL-1 e) Donner la définition de l'activité spécifique en précisant ses unités. L’AS correspond à l’activité enzymatique ramenée en kat.mg-1 de prot présentes dans la solution enzymatique. f) Calculer l'activité spécifique de la solution d’alcool déshydrogénase. AS = AE (1mL de ADH) / masse de prot par mL = 30 / 2 = 15 nkat.mg-1 5 Question 3 (11 points) Vous suivez une étape de purification de l’alcool déshydrogénase à partir d’un extrait biologique de foie (EB). Des échantillons enzymatiques sont prélevés pour mesurer la concentration en protéines. L’activité enzymatique est mesurée avec 0,1 mL d'échantillon enzymatique dilué au ½ dans un volume réactionnel de 3 mL. On obtient le tableau suivant : Fraction Volume Conc. de AE mesurée sur total 100 µL protéines (mL) [mg.mL-1] d’échantillon dilué au ½ (nmole.s-1) AE totale (nkat) AS -1 (nkat.mg ) EB 100 20 5 5x2x10x100 5x10x2/20 = 10000 =5 Etape 1 10 1 25 25x2x10x10 25x2x10/1 = 5000 = 500 a) Rdt (%) 50 Fp 100 Donner la définition de l'activité totale. AT = AE (1mL) x vol total b) Donner la définition du rendement. Que permet-il de déterminer ? Rdt = AT extrait purifié/ AT extrait brut détermine la quantité d'enzyme conservée c) Donner la définition du facteur de purification. Que permet-il de déterminer ? FP = AS extrait purifié/ AS extrait brut détermine la quantité de protéines contaminantes éliminées d) Calculer l’activité enzymatique totale, l’activité spécifique (AS), le Rendement (Rdt) et le facteur de purification (Fp) de chaque étape. Détailler un exemple de calcul de l'AS, l'AE totale, le rendement et le facteur de purification. Voir tableau 6 PARTIE C : Métabolisme Question 1 (30 points) (8 pts) Dans la cellule, la réaction de phosphorylation du glucose est catalysée par une enzyme appelée hexokinase (HK). Dans le foie, cette réaction est catalysée par une isoenzyme appelée glucokinase (GK). La comparaison des activités de ces deux enzymes en fonction de la concentration du glucose sanguin est donnée sur la figure ci-dessous. a- Donner la réaction complète catalysée par ces enzymes Glucose + ATP → Glucose-6P + ADP b- Dans quelle voie métabolique trouve-t-on cette réaction ? Première étape de la glycolyse c- Commenter les allures des deux courbes HK atteint sa valeur Vm pour des concentrations très faibles en glucose, comparée à GK. HK présente donc une affinité pour le glucose bien supérieure à celle de la GK (facteur 100 minimum à l’œil). d- Expliquer ces différences de comportement dans un contexte physiologique sachant que la concentration normale moyenne du glucose circulant est d’environ 5 mM. L’une des fonctions majeures du foie est d’assurer le maintien de la glycémie. Quand le taux de glucose sanguin devient faible, l’activité glucokinase est très faible alors que l’activité HK reste très forte dans les autres tissus. HK, de par sa très grande affinité pour le glucose est bien adaptée au besoin des tissus périphériques non hépatiques, à savoir capter le maximum de glucose plasmatique pour s’en servir comme substrat énergétique via la glycolyse. Ceci est particulièrement important pour le cerveau et les GR qui utilisent exclusivement le glucose comme source d’énergie. Par contre quand le taux de 7 glucose sanguin augmente de façon importante, après un repas riche en glucides, la glucokinase hépatique, dont le Km est très supérieur à la conc. normale du glucose sanguin, devient active et capte l’excès de glucose pour en faire des réserves de glycogène. Question 2 (6 pts) La maladie de von Gierke (encore appelée glycogénose de type 1) est causée par une déficience dans l’activité de la Glucose-6-phosphatase. a- Quelle est la réaction catalysée par cette enzyme ? Glucose-6P + H2O → Glucose + Pi b- Dans quelle voie métabolique trouve-t-on cette réaction ? La dernière étape de la néoglucogenèse c- Quel est le principal organe touché par cette déficience enzymatique ? Le foie qui est le site majeur de la néoglucogenèse d- Quelles seront les conséquences (ou symptômes) les plus prévisibles pour le patient ? Hypoglycémie et augmentation de la concentration en glycogène hépatique Question 3 (12 pts) Parmi les affirmations suivantes, lesquelles sont exactes ? Répondre par vrai ou faux. Pour chaque affirmation considérée fausse, vous justifierez votre réponse (briévement) en donnant, selon les cas, la bonne définition ou des exemples vus en cours. a- Une voie métabolique est constituée d’une succession de réactions irréversibles qui permettent d’obtenir un produit final à partir d’un substrat initial Faux Ex la glycolyse qui comporte 10 étapes et seulement 3 sont irréversibles, les autres fonctionnent proches de l’équilibre b- Dans une voie métabolique, chaque réaction chimique est catalysée par une enzyme particulière Vrai 8 c- Les voies métaboliques de synthèse et de dégradation, qui ont les mêmes produits de départ et d’arrivée, fonctionnent en sens inverse et utilisent les mêmes enzymes Faux Ex : la glycolyse et la néoglucogenèse diffèrent au moins par trois étapes De plus ce ne serait pas possible d’un point de vue thermodynamique d- La néoglucogenèse correspond à la synthèse de glycogène à partir de glucose Faux Non il s’agit de la synthèse du glucose à partir du pyruvate e- La phosphorylation oxydative correspond à la phosphorylation du glucose en condition oxydative Faux La phosphorylation oxydative correspond à la synthèse d’ATP couplée au transport d’électrons au niveau de la chaîne respiratoire f- A l’exception des produits initiaux et finaux, la glycolyse n’utilise comme intermédiaires que des composés phosphorylés VRAI g- Toutes les réactions irréversibles de la glycolyse sont soumises à une régulation stricte VRAI h- Le cycle de Krebs ne peut fonctionner qu’en présence d’oxygène VRAI Question 4 (4 pts) Le cycle de Krebs a pour fonction de cataboliser l’acétyl-CoA. Quel sera le bilan en ATP de l’oxydation d’une molécule d’acétyl-CoA (utiliser les valeurs hautes P/O). 1 Acetyl‐CoA donne 2 CO2 + 3 NADH,H+ + 1 FADH2 + 1 GTP + Valeurs hautes : NADH = 3 ATP et FADH2 = 2 ATP Total 12 ATP 9
