Faculté de science Département de biologie TGF Thème: Les inhibiteurs enzymatique RÉALISÉE PAR: ABDIRAZAK IBRAHIM ADAN ID HOUSSEIN AHMED SOUMEYA MAHAMOUD ISMAEL ZAMZAM HASSAN AHMED SOMMAIRE I. Inhibition compétitive (fixation exclusive) 1. 2. Définition Représentation graphique II. Inhibition non compétitive (fixation non exclusive) 1. 2. Définition Représentation graphique III. Inhibition incompétitive (fixation non exclusive) 1. 2. Définition Représentation graphique IV. Inhibition par excès de substrat 1. 2. Définition Représentation graphique INTRODUCTION Un inhibiteur enzymatique est une substance se liant à une enzyme et qui en diminue l’activité. Un inhibiteur peut empêcher la fixation du substrat sur le site actif en se fixant à sa place, ou provoquer une déformation de l’enzyme qui rend celle-ci inactive. L'étude de l'effet d'inhibiteurs permet : • d'affiner le mécanisme catalytique d'une réaction enzymatique • de mieux connaître la spécificité d'une enzyme • d'obtenir des données physiques et chimiques concernant le site actif En effet, certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en interagissant de manière non covalente. D'autres se fixent de manière Irréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site catalytique. I) INHIBITEUR COMPÉTITIVE C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat (et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont donc mutuellement exclusives. Le mécanisme réactionnel : LES DIFFÉRENTS MODÈLES : MODÈLE 1: Il n'existe qu'un site de fixation pour les deux molécules : la fixation mutuellement exclusive résulte d'une analogie de structure entre le substrat et l'inhibiteur. MODÈLES 2 À 4: Le substrat et l'inhibiteur se fixent sur des sites distincts. L'inhibition est malgré tout de type compétitif pour diverses raisons structurales. MODÈLE 5: C'est le changement conformationnel de l'enzyme induit par la fixation de l'inhibiteur qui empêche celle du substrat (et réciproquement). Les enzymes sujettes à ce mode de régulation sont souvent des enzymes multimériques à régulation allostérique: par exemple, l'aspartate transcarbamylase, la glutamine synthétase REPRESENTATION GRAPHIQUE En présence d'un d'inhibiteur compétitif, KM est augmentée et VM n'est pas modifiée. • Cela signifie que l'inhibition compétitive peut-être "levée" à concentration saturante en substrat. En effet, puisque la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une très forte concentration de substrat déplace l'équilibre E + S <==> ES en faveur de ES et donc déplace l'équilibre EI <==> E + I en faveur de E. • Vitesse relative (ou activité fractionnaire) en absence et en présence d'inhibiteur : le degré d'inhibition induit par un excès d'inhibiteur compétitif de n fois est maximal quand la concentration du substrat ET la concentration de l'inhibiteur sont beaucoup plus importantes que KM et KI, respectivement II)INHIBITEUR NON COMPÉTITIVE Un inhibiteur non compétitif classique n'a aucune influence sur la fixation du substrat (et réciproquement) : les sites de fixation du substrat et de l'inhibiteur sont distincts. • En conséquence, l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ; de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI. Les inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le substrat. MECANISME REACTIONNEL MODÈLES • MODEL CLASSIQUE : Le mécanisme de fixation de l'inhibiteur ne modifie pas la manière dont se fixe le substrat mais elle empêche les ajustements conformationnels du site actif qui devraient avoir lieu pour qu'il y ait catalyse : le complexe ternaire ESI est inactif. • AUTRE MODELE : Il suggère qu'il n'y a pas de transconformation possible entre ES et ESI, c'està-dire qu'il n'y a pas d'équilibre : ES + I <==> ESI. Cependant, l'effet de l'inhibiteur est le même que dans le modèle classique parce que les 4 formes de l'enzyme (E, EI, ES et ESI) sont en équilibre (ESI <==> EI <==> E <==> ES). • En présence de ce type d'inhibiteur : • VM est diminuée : une partie des molécules d'enzyme se trouvant sous la forme EI et ESI, conjointement au complexe ES, il y a donc moins de molécules d'enzyme productives. • KM n'est pas modifiée : les sites de fixation étant distincts, la saturation par le substrat des molécules d'enzyme libre E n'est pas modifiée Représentations graphiques : • on appelle "pure", l'inhibition non compétitive où l'inhibiteur se fixe avec la même affinité à l'enzyme libre E et au complexe enzyme - substrat ES (KI = K'I). • on appelle "mixte", l'inhibition non compétitive où l'inhibiteur se fixe avec des affinités différentes à E et à ES (KI différent K'I). L'inhibition non compétitive est rare et on en trouve des exemples essentiellement dans le cas des enzymes à régulation allostérique. III) INHIBITION INCOMPÉTITIVE Ce type d'inhibition est aussi appelé inhibition par blocage du complexe intermédiaire. Cette appellation décrit mieux le mécanisme : l'enzyme et le substrat forment d'abord le complexe enzyme-substrat (le complexe intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe. Le mécanisme réactionnel : • Il y a formation d'un complexe ternaire ESI inactif. Ce type d'inhibition est essentiellement observé pour des réactions impliquant plusieurs substrats. En présence de ce type d'inhibiteur : • Les deux paramètres (VM et KM) sont modifiés par le même facteur . • En effet, ce type d'inhibiteur favorise la formation du complexe [enzymesubstrat] qui lui-même est consommé pour former le complexe ESI. • L'équilibre : E+S <==> ES est donc déplacé en faveur de ES. Celà signifie que, pour un même degré de saturation de l'enzyme il faut une concentration plus faible en substrat (KM diminue). • La concentration du complexe [ES] est moindre (une partie se trouve sous forme ESI), donc VM diminue. REPRÉSENTATION GRAPHIQUE IV) INACTIVATION : INHIBITION IRRÉVERSIBLE L'action d'un inhibiteur est IRréversible quand il se forme une liaison covalente entre l'enzyme et l'inhibiteur : on l'appelle un inactivateur. • Le mécanisme réactionnel : L'étude de l'effet des inhibiteurs irréversibles est souvent utilisée pour déterminer les groupes actifs du site catalytique. Un exemple classique d'inactivateur est le di-isopropyl fluorophosphate ou DFP*. L'étude de l'effet de ce composé sur l'activité des protéases à sérine a permis d'identifier la sérine 195 comme l'un des deux résidus impliqués dans la catalyse (le second étant l'histidine 57). • Le complexe est inactif, mais en fonction de la concentration relative de l'enzyme et de l'inhibiteur, toute molécule d'enzyme libre est évidemment totalement active. • partie A : tant que la concentration en inactivateur est supérieure à celle de l'enzyme, tout l'enzyme est complexée sous forme EI inactive. • partie B : dès que [E0] >[I0], chaque molécule d'enzyme libre catalyse la réaction avec une vitesse maximale qui est : • Vmaxapp = kcat . ([E0] - [I0]) V) INHIBITION PAR EXCÈS DE SUBSTRAT • Ce type d'inhibition par le substrat lui-même peut avoir lieu quand il est en très grande concentration. • En général, le site de fixation du substrat est dans ce cas de grande dimension et contient plusieurs sous - sites, chacun fixant une partie du substrat. • Le mécanisme réactionnel : L'acétylcholinestérase est un exemple d'enzyme sujette à inhibition par excès de son substrat, l'acétylcholine. • Le site actif de cette enzyme a été caractérisé, en particulier en utilisant des analogues de substrat : une série d'inhibiteurs compétitifs portant des charges et un nombre d'atomes de carbone variables. • Il existe deux sous - sites de fixation de l'acétylcholine, distants de 7 Å : • le sous - site anionique qui porte une charge négative et qui interagit avec la charge positive portée par l'ammonium quaternaire du substrat • le sous - site estérasique (contenant les résidus catalytiques sérine et histidine) et qui interagit avec la liaison ester du substrat • Quand la concentration du substrat est faible, chaque partie du substrat interagit avec le sous-site qui lui est dédié. • Quand la concentration du substrat est forte, une molécule de substrat n'interagit plus que partiellement avec l'un ou l'autre des sous - sites, chaque sous - site étant cependant occupé par une molécule de substrat. Un autre exemple est la régulation de la phosphofructokinase-1 (enzyme de la glycolyse) par la concentration de ces substrats (l'ATP et le fructose 6phosphate) mais aussi par celles de de nombreux effecteurs liés à la production d'énergie (ATP) par la phosphorylation oxydative. Ces effecteurs sont : l'ATP lui-même (voir ci-dessous), l'ADP, l'AMP, le phosphoénolpyruvate, le phosphate inorganique, le citrate, le NADH L'ATP est un cas particulier : c'est l'un des deux substrats de la PFK mais c'est aussi un effecteur. En effet la PFK-1 possède : • un site de fixation de l'ATP en tant que substrat (effet homotrope) • un site de fixation en tant qu'effecteur (effet hétérotrope) a. Partie gauche de la courbe de saturation ci-dessous • Elle reflète l'effet de l'ATP sur la vitesse de la réaction enzymatique en tant que substrat. • L'allure hyperbolique de cette première partie de la courbe indique que la fixation de l'ATP aux 4 sites catalytiques (la PFK est un homotétramère) s'effectue selon un mécanisme "Michaelien". • Celà signifie qu'il n'y a pas d'effet coopératif dans la fixation des molécules d'ATP. b. Partie droite de la courbe de saturation ci-dessus A partir d'une certaine concentration, des molécules d'ATP se fixent sur un site qui n'est pas le site catalytique : ce site est lié à la régulation de l'activité catalytique. C'est un site dit effecteur : certaines molécules d'ATP n'agissent plus comme substrat mais comme effecteur : La fixation de molécules d'ATP sur ce site induit un changement de conformation de certaines molécules d'enzyme. Les sites catalytiques dans cette conformation (dite "tendue" ou "tense", T) ne fixe pas ou trés mal l'ATP. Dans cette conformation T, l'enzyme n'est pas ou trés peu active. c. En conséquence : • Une partie des molécules d'enzyme étant inactive, la concentration réelle de complexe enzyme - substrat ([ES]) est moindre que la concentration d'enzyme. La vitesse de catalyse diminue puisque : vi = kcat x [ES]. d. Illustration Inhibition de la CTP synthase par excès d'ammoniaque. Représentation graphique