Optimisation du protocole de recherche des Escherichia coli

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UNIVERSITE DE BOURGOGNE
THÈSE
Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Bourgogne
Discipline : Sciences de la vie
Spécialité : Microbiologie
par Fanny SAVOYE
le 28 Mars 2011
Optimisation du protocole de recherche des
Escherichia coli Producteurs de Shiga-toxines
(STEC) dans les aliments
Directeur de thèse : Monsieur le Pr Jean Guzzo
Co-directeur de thèse : Madame le Dr Delphine Thevenot-Sergentet
JURY :
RAPPORTEUR : Madame Christine Martin, Directrice de recherche, INRA Theix
RAPPORTEUR : Madame Marie-Christine Montel , Directrice de recherche, INRA Aurillac
EXAMINATEUR : Monsieur Fabrice Martin-Laurent, Directeur de Recherche, INRA Dijon
EXAMINATEUR : Madame Christine Rozand, Professeur, BioMérieux, Marcy l’Etoile
EXAMINATEUR : Madame Delphine Thevenot-Sergentet , Maître de Conférence, VetAgro Sup
EXAMINATEUR:Monsieur Jean Guzzo, Professeur, Université de Bourgogne - Dijon
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Remerciements à…
Messieurs et Mesdames les membres du jury :
Monsieur le Professeur Jean Guzzo, mon Directeur de thèse. Je tiens à lui exprimer toute
ma reconnaissance pour m’avoir permis de réaliser cette thèse et pour avoir encadré ce travail
de thèse avec autant de disponibilité, ainsi que pour ses nombreux conseils avisés. Je suis
reconnaissante de la confiance qu’il m’a accordée et des discussions enrichissantes que nous
avons eues.
Madame le Docteur Delphine Thevenot-Sergentet, ma co-Directrice de thèse. Je tenais
chaleureusement à la remercier pour son soutien durant la thèse et son accueil au sein du
laboratoire. Qu’elle reçoive toute l'expression de ma reconnaissance pour son encadrement,
ses précieux conseils et ses compétences scientifiques qui m’ont permis de mener à bien ce
projet. Je la remercie aussi pour son aide à la réalisation de ce mémoire.
Madame le Professeur Christine Rozand, qu’elle reçoive toute l'expression de ma
reconnaissance pour m’avoir proposé ce sujet de recherche et, pour son dynamisme et ses
compétences scientifiques qui m’ont permis de mener à bien cette étude. Qu’elle trouve ici
l’expression de ma respectueuse gratitude.
Mesdames les Professeurs Marie-Christine Montel et Christine Martin d’avoir accepté de
juger ce travail en qualité de rapporteur. Je suis reconnaissante pour l’intérêt qu’elles ont porté
à ce travail et je tiens à leurs exprimer à cet égard mes sincères remerciements.
Monsieur Fabrice Martin-Laurent, qu’il reçoive toute l’expression de ma gratitude pour
avoir accepté de faire partie de ce jury et pour l’intérêt porté à ce travail. Je tiens à lui
exprimer mes sincères remerciements.
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Je remercie…
Monsieur Vincent Atrache, sans qui je ne me serais jamais lancée dans une telle aventure.
Merci de m’avoir fait confiance et d’avoir initié ce travail avec le soutien financier de la
société BioMérieux.
La R&D Microbiologie Industrielle (BioMérieux) et plus particulièrement, Jean-Louis
Pittet, Christine Aguilhon, Cécile Sauvan, Aurélie Lafay, pour leur précieux conseils et
pour m’avoir accompagné tout au long de ce projet ; mais aussi Cathy, Myriam, Rémy,
Anita, Florence et les autres pour leur accueil et les bons moments passés ensemble.
L’équipe de Microbiologie Alimentaire et Prévisionnelle :
 Marion, mon « binôme ». Merci pour ton aide et ton soutien permanent, ta bonne
humeur, les fous rires et les bons moments qu’on a passés ensemble.
 Delphine, pour ta patience, ton soutien et l’ambiance dans laquelle j’ai pu
travailler ces trois années.
 Lysiane et Stéphane, mes voisins de bureau, pour tous les bons moments partagés
autour de la peau de Shrek…
 Les Christine’s, pour nos conversations cuisine, fleurs et jardins.
 Audrey, Sarah, Franck, Françoise, Cécile, Patrice, Manuelle, Estelle, Brigitte
pour leur sympathie, leur aide technique et pour la bonne ambiance qui règne dans
l’unité.
Un grand merci à vous tous pour m’avoir permis de mener à bien ce projet. Je tiens à vous
exprimer toute ma reconnaissance et vous assure mon amitié.
A l’équipe de QSA : Alain Gonthier, Sylvie Mialet et plus particulièrement Pierre Demont
pour m’avoir fait confiance et permis de m’essayer au métier de l’enseignement.
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Une pensée particulière pour…
Mes Parents, sans qui, je n’en serais pas là aujourd’hui. Merci pour tout leur amour et leur
soutien depuis toujours. Ils ont su me donner toutes les chances pour réussir. Qu’ils trouvent,
dans la réalisation de ce travail, l’aboutissement de leurs efforts ainsi que l’expression de ma
plus affectueuse gratitude.
Mes Soeurs, Cindy, Marjory et Lucy pour leur soutien et toute la complicité qui nous unit.
Thomas, qui depuis des années partage ma vie, mes doutes et mes joies. Je le remercie de sa
présence à mes côtés dans les bons comme dans les moments plus difficiles, ses
encouragements, sa compréhension et, tout simplement son amour.
Toute ma Famille et tous mes Amis qui me sont chers…
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Résumé
Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) sont des agents pathogènes
importants émergents en santé publique. Ces bactéries sont à l’origine des épidémies de
colites hémorragiques et de syndrome hémolytique et urémique (SHU). La grande majorité
des cas est liée à la consommation d’aliments contaminés par un type particulier de STEC
appelés E. coli entérohémorragiques (EHEC) parmi lesquels on trouve les sérogroupes définis
comme pathogènes par l’AFSSA : O26, O103, O111, O145 et O157.
Les bovins ont depuis longtemps été identifiés comme un important réservoir de STEC. Bien
que la transmission des STEC à l'homme soit fréquemment associée à la consommation de
viande, les produits laitiers ont également été impliqués dans les cas humains. Le
développement de méthodes rapides pour la détection des STEC les plus impliqués en
pathologie humaine est donc essentiel pour assurer la sécurité des produits alimentaires.
Cependant, la détection des STEC dans les aliments est problématique principalement en
raison de la diversité des sérogroupes de STEC et de l'absence de caractéristiques
biochimiques communes permettant de les distinguer des autres E. coli.
L'objectif de cette thèse était d’optimiser le protocole de détection des STEC dans les aliments
de manière à pouvoir proposer aux industriels des protocoles leur permettant une réelle
maîtrise du « danger STEC » dans leur filière.
Pour se faire, nous sommes intervenus à différentes étapes du protocole. Nous avons
notamment sélectionné un milieu d’enrichissement permettant la détection des E. coli O26
dans les fromages au lait cru : EPT+ acriflavine + CT. Nous avons également évalué les
performances d’une méthode de détection des E. coli O157 :H7 (VIDAS ECPT UP) dans la
viande de boeuf. Cette nouvelle technique est basée sur l’utilisation de protéines recombinante
de phage qui ciblent spécifiquement les E. coli O157. A travers cette étude, nous avons
démontré la possibilité d’avoir des temps d’enrichissement minimes pour l’analyse
d’échantillon de 25g (6h) et la faisabilité d’analyser des échantillons de 375g avec un ratio de
dilution de ¼ et un enrichissement de 24h. Enfin nous nous sommes intéressés à l’étape de
confirmation en mettant au point un test d’immuno-concentration automatisé (utilisant des
protéines de phages spécifiques de nos bactéries cibles) permettant d’immuno-concentrer les 5
sérogroupes les plus connus de STEC (O26, O103, O111, O145 et O157) en une seule fois.
Mots-clés : STEC, aliments, détection, pathogène.
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