Corrige_ controle TP Web_2006

Année universitaire 2006-2007
CORRIGE ET BAREME DU CONTROLE DE TP LV203
L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires"
CONTROLE DE TRAVAUX PRATIQUES
samedi 9 décembre 2006
• Indiquez dans la case ci-dessus vos nom et prénom, votre section et votre n° de groupe précis de TP.
• Lisez très attentivement le sujet.
• N'écrivez lisiblement que dans les cases réponses prévues à cet effet.
L'utilisation de documents, de calculatrice et de téléphone portable est strictement interdite.
Durée de l'épreuve : 1 heure
Note sur 15
******************
I. Une expérience de mutagenèse a été réalisée sur une culture liquide d'une souche T de levure
Saccharomyces cerevisiae, auxotrophe pour l'adénine et donnant des colonies rouge-orangé sur un milieu
supplémenté avec cet acide nucléique : phénotype [ade-, rouge]. Ce phénotype est dû à une mutation dans
le gène h, intervenant dans la chaîne de biosynthèse de l'adénine. A l'état sauvage de référence, ce gène
code une enzyme permettant la transformation de l'amino-imidazole ribotide (AIR), pigment rougeorangé, en 5-amino-4-carboxyimidazole ribotide (CAIR), métabolite incolore.
Cette expérience de mutagenèse a été réalisée par irradiation aux rayons UV, à la longueur d'ondes
de 254 nm, d'une suspension liquide de la souche T, à la concentration initiale de 108 cellules/ml, selon un
protocole expérimental identique à celui employé lors des TP.
Après une irradiation de 30 secondes, des étalements de 0,2 ml de la suspension irradiée ont été
effectués sur des boîtes de Pétri contenant soit, un milieu complet (boîte A), soit un milieu dépourvu
d'adénine (boîte B). Les conditions d'étalements et les résultats observés sont présentés ci-dessous :
(NB : les colonies rouge-orangé apparaissent en grisé sur ces schémas)
boîte A
milieu complet
dilution 8.104 avant étalement
volume déposé : 0,2 ml
boîte B
milieu sans adénine
pas de dilution avant étalement
volume déposé : 0,2 ml
A partir de ces résultats expérimentaux, calculer, en détaillant votre calcul :
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1) la concentration en cellules survivantes après mutagenèse
Q. 1
40 x 8.104/0,2 ou 40 x 8.104 x 5 = 1,6.107 cellules/ml
2) le taux de survie après mutagenèse
Q. 2
1,6.107 x 100/108 = 16%
3) la concentration en cellules de phénotype [ade+] obtenues
Q. 3
32/0,2 ou 32 x 5 = 160 cellules/ml ou 1,6.102 cellules/ml
4) la fréquence de mutants (révertants) vers le phénotype [ade+]
Q. 4
1,6.102/1,6.107 = 10-5
II. Les colonies blanches obtenues sur boîte A sont ensuite testées pour leur phénotype [ade+] ou
[ade-], en utilisant un crible approprié. A la suite de ce test, la plupart de ces colonies apparaissent
constituées de levures de phénotype [ade-]. Cependant, certaines d'entre elles sont constituées de
levures de phénoytpe [ade+].
5) Schématisez un protocole expérimental (avec légendes précises) permettant de discriminer les
deux types de colonies recherchées.
Q. 5
1. boîte d'étalement initiale
2. boîte de réplique 1
réplique
sur velours
milieu complet
Poussent sur ce milieu :
• les colonies [ade-, rouge]
• les colonies [ade-, blanc]
• les colonies [ade+, blanc]
3. boîte de réplique 2 : témoin
réplique
sur velours
milieu sans adénine
milieu complet
Poussent sur ce milieu :
• les colonies [ade+, blanc]
Poussent sur ce milieu les mêmes
colonies aux mêmes endroits que
sur la boîte 1 : c'est le contrôle
de la réplique
Les colonies blanches pour lesquelles l'empreinte ne donne pas de croissance sur la boîte de réplique 1
sans adénine, alors que l'on observe une croissance sur le témoin de réplique correspondent à des levures
de phénotype [ade+, blanc]. Les autres colonies blanches de la boîte 1 correspondent donc à des levures
de phénotype [ade-, blanc].
NB : le témoin de réplique (boîte 3) n'était pas demandé dans la réponse.
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6) Expliquez comment peuvent-être obtenus l'un et l'autre de ces deux phénotypes.
Q. 6
• Phénotype [ade-, colonies blanches] : le gène h est toujours muté, mais le pigment rougeorangé, substrat de l'enzyme codée par le gène h, n’est plus fabriqué en raison de
l’inactivation de l’un des gènes intervenant antérieurement dans la chaîne de biosynthèse de
l’adénine, avant l’étape h.
• Phénotype [ade+, colonies blanches] : le gène h n’est plus muté, en raison d’un nouvel
événement mutationnel dans ce gène (réversion), ayant permis de redonner un allèle h+ codant
une enzyme fonctionnelle.
(La possibilité de mutations "suppresseur" dans d’autres gènes permettant de supprimer le
phénotype mutant peut être évoquée mais n’a pas été abordée pour tous les groupes).
III. Par ailleurs, on dispose d'une souche haploïde de levure (souche A), dont on cherche à
déterminer le signe sexuel. Cette souche présente un phénotype mutant [his-], récessif devant le
phénotype sauvage de référence [his+] et dû à une mutation dans le gène p, codant une enzyme
intervenant dans la biosynthèse de l'histidine. La souche A possède l'allèle muté p1 de ce gène. On se
propose de déterminer le signe sexuel de la souche A en utilisant un protocole identique à celui des TP.
Dans ce but, on dispose de 6 souches testrices différentes, de signe sexuel a ou α et de génotypes
connus :
• souche B (génotype a, m1) et souche B' (génotype α, m1)
(m1 est un allèle muté du gène m, impliqué dans la biosynthèse de l'histidine)
• souche C (génotype a, p2) et souche C' (génotype α, p2)
(p2 est un autre allèle muté du gène p, déjà mentionné et impliqué dans la biosynthèse de l'histidine)
• souche D (génotype a, k1) et souche D' (génotype α, k1)
(k1 est un allèle muté du gène k, impliqué dans la biosynthèse du tryptophane)
Dans tous les cas, les différents allèles mutés confèrent un phénotype mutant récessif par rapport au
phénotype sauvage de référence, dominant.
7) Sur quel principe général est basé le test de détermination du signe sexuel?
Q. 7
La détermination du signe sexuel est basé sur le principe général de la complémentation
fonctionnelle entre 2 génotypes haploïdes :
• les deux souches haploïdes ne doivent pas pouvoir pousser sur le milieu utilisé pour le test
(contre-sélection des souches parentales).
• seules les cellules diploïdes formées entre les cellules haploïdes doivent être capable de
pousser sur ce milieu de culture (sélection des diploïdes).
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8) Quelles souches testrices, parmi celles proposées, sont utilisables pour cette expérience?
Q. 8
-
La souche A est mutée dans le gène p et de phénotype [his ]
Quatre souches sont utilisables pour ce test car permettant l'application du principe général
présenté précédemment :
- souche B : a, mutée dans le gène m
- souche B’ : α, mutée dans le gène m
- souche D : a, mutée dans le gène k
- souche D' : α, mutée dans le gène k
(NB : les justifications ne sont pas demandées)
9) En prenant un exemple de votre choix parmi les souches utilisables, schématisez et légendez
précisément le protocole expérimental utilisé et les résultats obtenus.
Q. 9
Expérience réalisée avec les souches B et B'
boîte de croissance des souches B et B' (milieu complet)
B
B
B'
B'
réplique
sur velours
boîte-test : milieu sans histidine
A
réplique
sur velours
croissance de cellules
A
boîte de croissance de la souches A (milieu complet)
Résultats obtenus : • croissance avec la souche B' α
• pas de croissance avec la souche B a
La souche A est donc de signe sexuel a
NB : dans le cas où le choix se porte vers les souches C et C', la boîte-test sera un milieu sans histidine et sans tryptophane.
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