SUJET ET FEUILLE-RÉPONSE DU CONTROLE DE TP Nom et

Année universitaire 2008-2009
SUJET ET FEUILLE-RÉPONSE DU CONTROLE DE TP
Nom et prénom :.....................................................................………
Section et groupe :...............
ATTENTION : toute copie sans indication de section et de groupe ou avec des indications erronées ne sera pas corrigée.
Licence L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires"
CONTROLE DE TRAVAUX PRATIQUES
samedi 29 novembre 2008
• Lisez très attentivement le sujet.
• Ecrivez lisiblement dans la case-réponse correspondante et rendez une copie soignée.
• Ne dépassez pas les cadres proposés : tout texte hors-cadre ne sera pas lu, ni corrigé.
L'utilisation de documents, de calculatrice et de téléphone portable est strictement interdite.
Durée de l'épreuve : 1 heure
Note sur 15
I. Au cours de la 1ère séance de travaux pratiques de Génétique, vous avez réalisé une expérience de
mutagenèse sur une culture liquide de la souche ORT128 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette souche
est auxotrophe pour l'adénine et forme des colonies de couleur rouge-orangé sur un milieu contenant cette
base azotée : phénotype [ade-, colonies rouge-orangé]. La souche sauvage dont elle est issue est de phénotype
[ade+, colonies blanches].
Les deux caractères mutants de la souche ORT128 sont dûs à une mutation unique qui inactive le gène h. Ce
gène intervient dans la chaîne de biosynthèse de l'adénine et gouverne l'étape de transformation de l'aminoimidazole ribotide (AIR), pigment rouge-orangé, en 5-amino-4-carboxyimidazole ribotide (CAIR),
métabolite incolore. On appellera h1 l’allèle muté du gène h, présent dans la souche ORT 128.
Une expérience de mutagenèse a été réalisée en irradiant des cellules de cette souche de levure, sous un
rayonnement ultra-violet de longueur d'ondes 254 nm, selon un protocole expérimental identique à celui que
vous avez employé au cours des travaux pratiques. La concentration initiale de la suspension de la souche
ORT128 était de 108 cellules/ml. Après une irradiation de 30 secondes, des étalements de la suspension
irradiée ont été effectués sur des boîtes de Pétri contenant, soit un milieu riche (boîtes A), soit un milieu
dépourvu d'adénine (boîte B). Les conditions d'étalement et les résultats observés sont présentés ci-dessous :
boîte A : milieu complet
dilution 8.104 avant étalement
volume déposé : 0,2 ml
boîte B : milieu sans adénine
pas de dilution avant étalement
volume déposé : 0,2 ml
NB : les colonies rouge-orangé apparaissent en grisé sur ce document.
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A partir de ces données et de ces résultats expérimentaux, calculez en donnant le détail de vos calculs :
Q1 : la concentration en cellules survivantes après mutagenèse.
Il y a 40 colonies sur la boite de milieu complet, on a déposé 0,2 ml d’une suspension correspondant à la
4
dilution 8.10 .
Concentration totale de la suspension :
ou :
4
7
40 x 5 x 8.10 = 1,6 . 10 cellules/ml
4
(40 / 0,2) x 8 .10
Q2 : la concentration en cellules de phénotype [ade+] après mutagenèse.
Etalement sans dilution, dépôt 0,2 ml, on dénombre 32 colonies.
2
Concentration de la suspension en cellules [ade+] : 32 x 5 = 1,6 . 10 cellules/ml
Q3 : la fréquence de mutation vers le phénotype [ade+] après mutagenèse.
Concentration en cellules [ade+] / concentration totale [ade+] + [ade-]
2
-5
1,6 . 10 = 10
7
1,6 . 10
Q4 : la concentration en cellules de phénotype [colonies blanches] après mutagenèse.
4
5
2 x 5 x 8 . 10 = 8 . 10 c/ml
Q5 : la fréquence de mutation vers le phénotype [colonies blanches] après mutagenèse.
5
8 . 10
7
-2
= 5 . 10
1,6 . 10
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La fréquence de mutation [ade-] vers [ade+], calculée à partir des boîtes de milieu dépourvu d’adénine est
différente de la fréquence de mutation [colonies rouges] vers [colonies blanches], calculée à partir des
boîtes de milieu contenant de l’adénine.
Q6 : expliquez pourquoi ces deux fréquences de mutation sont différentes.
+
La réversion vers le phénotype [ade ] implique un évènement mutationnel se traduisant obligatoirement par
un retour vers l’activité du gène préalablement muté chez le mutant.
Il faut donc que la nouvelle mutation touche obligatoirement ce gène précis et que la séquence résultant de
cet évènement soit compatible avec la fonction. Ce type d’évènement se produira très rarement.
En ce qui concerne la réversion vers le phénotype [colonies blanches] sur milieu contenant de l’adénine, il
peut y avoir deux origines :
-
+
1°) la réversion vers considérée [ade ]précédemment. Dans ce cas, l’AIR ne s’accumulant plus
dans les cellules, puisqu’il est transformé en CAIR, les colonies seront blanches sur milieu
contenant de l’adénine.
2°) l’inactivation n’importe quel gènes intervenant avant le gène h, dans la chaîne de biosynthèse
de l’adénine,. De ce fait les levures demeureront [ade ] mais l’AIR ne sera plus synthétisé et ne
pourra donc plus s’accumuler dans les cellules en conférant le caractère [colonies rouge-orangé]
sur milieu contenant de l’adénine.
Il suffit donc que l’un de ces gènes soit inactivé, peu importe la mutation responsable de cette
inactivation.
La réversion phénotypique vers le caractère [colonies blanches] sera donc beaucoup plus fréquente que la
+
réversion génotypique vers le caractère [ade ].
II. Vous avez réalisé un test de complémentation fonctionnelle pour déterminer le génotype de quatre
souches mutantes de phénotype [α, ura-, ade-, colonies blanches] :
- mutées pour le gène h (allèle h2)
- mutées également pour l’un des gènes intervenant dans la chaîne de biosynthèse de l’adénine, en amont
du gène h
- possédant l’allèle mutant u1 du gène u, qui leur confère le phénotype [ura-].
Les souches testrices utilisées étaient de phénotype [a, trp-, ade-, colonies blanches] :
- mutées également pour le gène h (allèle h3)
- mutées aussi pour l’un des gènes intervenant en amont du gène h, dans la chaîne de biosynthèse de
l’adénine
- possédant l’allèle mutant t1 du gène t, qui leur confère le caractère [trp-].
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Q8 : En écrivant judicieusement les génotypes, expliquer le principe de sélection des diploïdes obtenus.
-
1
2
Les souches mutantes sont [α, ura ] : génotype Mat α, u , h
-
1
3
Les souches testrices sont [a, trp ] : génotype Mat a, t , h
1
1
Les mutations u et t donnent chacune un caractère mutant récessif.
2
Les diploïdes formés lors du test de complémentation fonctionnelle sont : Mat α h
3
1
u t
+
+ 1
Mat a h u t
Etant donné que les caractères mutants conférés par les mutations t1 et u1 sont récessifs, les diploïdes formés
+
+
sont de phénotype [uracile tryptophane ].
En se plaçant dans un milieu minimum supplémenté en adénine et non supplémenté en uracile ni
tryptophane, on pourra sélectionner les diploïdes et contre sélectionner les parent haploïdes.
Q9 : quelles conditions doit impérativement remplir le milieu d'étalement?
Le gène h est muté chez les deux génomes haploïdes qui sont réunis dans les cellules diploïdes formées. Par
conséquent, ces diploïdes sont sélectionnés sur un milieu
- minimum
- complémenté en adénine
Vous avez obtenu des colonies blanches dans le test réalisé avec la souche testrice A, qui porte l'allèle e1 du
gène e, codant une enzyme qui intervient dans une étape en amont de la formation de l'AIR dans la chaîne de
biosynthèse de l'adénine.
Q10 : Qu'en concluez-vous? Expliquez votre raisonnement.
1
La souche testrice est mutée pour le gène e allèle e .
Si la souche testée est mutée également pour le gène e, le diploïde sera homozygote mutant pour ce gène. Le
pigment rouge ne pourra pas être synthétisé. Le diploïde sera blanc.
Si la souche testée n’est pas mutée pour le gène e mais pour un autre gène de la chaîne de biosynthèse, étant
donné que ce gène nest pas muté chez la souche A, il se produira une complémentation fonctionnelle entre le
génome haploïde de la souche testée et celui de la souche testrice.
L’AIR sera synthétisé et s’accumulera dans les cellules. Les diploïdes seront rouge-orangé.
2
Le diploïde formé avec la souche A étant blanc, le mutant testé était donc muté pour e : allèle e
Q11 : Ecrivez le génotype des colonies obtenues.
3
1
Souche A
a
h
e
Mutant
α
h
e
2
2
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