PHYSIQUE CELLULAIRE

PHYSIQUE CELLULAIRE
FUSION MEMBRANAIRE
Rappel des cours précédents
Description de l’exocytose (5)
Jean-Pierre HENRY
5 Février 2009
Place de la fusion membranaire en
biologie cellulaire
• Le trafic membranaire et l’exocytose
• La fusion virale
• Fusion et développement
Trafic membranaire et exocytose
La fusion virale
La fusion cellule-cellule
ASPECTS PHYSIQUES
DE LA FUSION MEMBRANAIRE
Le modèle du pédoncule
LA FUSION VIRALE
Un modèle « simple » de fusion de
membranes biologiques
Mécanisme de la fusion induite par le
virus de la grippe
PHYSIQUE CELLULAIRE
FUSION MEMBRANAIRE
EXOCYTOSE
Jean-Pierre HENRY
5 Février 2009
Exocytose régulée/constitutive
• Exocytose constitutive:
– Non régulée par Ca2+
– Renouvellement de la
membrane cellulaire
• Exocytose régulée
(schéma)
– Déclenchée par une
montée de Ca2+ cellulaire
– Libération de médiateur
pour la communication
cellulaire
L’exocytose régulée est impliquée dans le fonctionnement
de la synapse et dans la libération des hormones hydrosolubles
L’exocytose régulée est complexe
L’exocytose (sécrétion) comporte des étapes multiples
précédant la fusion membranaire, qui rendent l’analyse
biochimique (moléculaire) difficile
remplissage
?
?
vésicule
fusion
endosome
?
bourgeonnement
catécholamine
(adrénaline)
migration
migration
arrimage
?
maturation
?
exocytose
?
endocytose
?
?
membrane
extérieur
de la cellule
Ca2+
Mais, l’étude est facilitée car la fusion est détectable depuis
l’extérieur de la cellule (pore de fusion, libération de
matériel)
Systèmes d’étude: la cellule chromaffine
bovine
•
•
•
•
La cellule chromaffine est le prototype
de la sécrétion neuroendocrine
Les cellules chromaffines
bovines peuvent être
cultivées
La sécrétion est induite par
l’Ach ou les ions K+
Les vésicules (granules
chromaffines) sont gros (200
à 300 nm)
Les produits de sécrétion
sont l’adrénaline et la
noradrénaline, l’ATP et des
peptides/protéines
Description phénoménologique de
l’exocytose
-1Ce que les méthodes électriques ont amené
Patch-clamp: circuit équivalent
• En patch-clamp, whole-cell, le
scellement entre la pipette et
la membrane cellulaire est fort
(résistance > 1 Gohm)
• La membrane à l’extrémité de
la pipette est enlevée: on voit
les propriétés de l’ensemble
de la membrane plasmique
• On impose un potentiel
sinusoïdal (800Hz)
• On mesure l’admittance du
circuit équivalent
Circuit équivalent (5)
• L’équation de l’admittance se
décompose en une partie
réelle et une partie imaginaire
• Il est possible d’avoir accès à
ces 2 parties (ampli lock-in)
• Aux temps brefs, la chute de
potentiel est surtout ohmique
• Aux temps longs, g est infini
(Breckenbridge and Almers (1987), Nature 328, 814
Caractérisation du pore de fusion (1)
Im
Re
• (Haut) Evolution de la partie
imaginaire Im et de la partie
réelle Re de l’admittance
• (Bas) conductance du pore
de fusion en nS (à gauche)
et en nm (à droite)
• Le pore apparaît
brutalement avec une
conductance initiale de 230
pS
• Avec des hypothèses
raisonnables, le pore aurait
un diamètre de ~ 1 nm
Résultats obtenus par patch-clamp
• L’événement de fusion unique est visible (dans
certaines conditions): augmentation de capacité
(vésicules de 200 nm ~ qqes fF)
• Le pore de fusion est visible: de 100 à 1000 pS (qqes
nm) ; il s’ouvre très rapidement; il peut être stable
pendant une fraction de s; il peut fluctuer
(fermeture/ouverture)
• Un pore purement lipidique a des caractéristiques
semblables (mais, il y l’hypothèse d’un pore
protéique est aussi défendue )
Principe de l’ampérométrie
• Certaines cellules
neuroendocrines sécrètent des
molécules oxydables: cellules
chromaffines et adrénaline
• On utilise une microélectrode
de carbone à un potentiel
oxydant (800 mV), placée près
de la cellule
• La libération de l’adrénaline
donne un pic de courant
• Pas de filtrage diffusionnel : le
pic donne la cinétique de
sécrétion
Réalisation d’une expérience
d’ampérométrie
• Une cellule chromaffine (diamètre 20 µm) est stimulée
parune micropipette (à gauche) libérant du KCl (55mM)
• La microélectrode (fibre de carbone, à droite) est à 800 mV
• Sur l’enregistrement du courant, un pic correspond à la
libération d’une vésicule
Apports des méthodes électriques
• Mise en évidence du pore de fusion
– Ouverture très rapide
– Taille généralement inférieure au nS (gros canal)
– Susceptible de fermeture et de fluctuations
• L’expansion du pore serait gouvernée par le
gonflement de la matrice
• Les vésicules synaptiques (diamètre 40 nm) ne
semblent pas gonfler, mais la diffusion à travers le
pore les vide en quelques ms
• Pas d’indication sur l’hémifusion
Description phénoménologique de
l’exocytose
-2Ce que les méthodes optiques ont amené
Les techniques développées récemment
• Microscopie électronique:
– Méthodes sans coloration
– Méthodes de tomographie
• Méthodes optiques in vivo
–
–
–
–
Interference reflection microscopy
Microscopie biphotonique
Microscopie de fluorescence à excitation évanescente (TIRFM)
Microscopie STED (stimulated emission depletion)
Electron tomographie conique:
Hémifusion des vésicules synaptiques
« dockées »
• Une coupe de cortex
frontal a été fixée et
examinée en tomographie,
avec reconstitution d’image
• Les images du centre et à
droite suggèrent une
hémifusion
• En projection sur un plan,
cette résolution disparaît
(Zampighi et al (2006) Biophys J, 91, 2910))
STED
Résolution du mouvement des vésicules
synaptique
• Neurones en culture, avec
un marquage par
fluorescence
• Même champ observé en
confocal et STED
• Cette méthode de champ
large permet des séquences
rapides (30 Hz) et elle est
utilisable pour le suivi des
vésicules synaptiques à la
synapse.
(Westphal et al (2008) Science,320, 246)
Exocytose vue par Interference Reflection
microscopy (IRM)
• Cellules chromaffines
observées in vivo
• En A, empreinte de la cellule
au repos, B, stimulation par
dépolarisation, C, exocytose,
D, récupération
(Llobet et al(2003) Neuron,40, 1075)
Sécrétion d’une cellule chromaffine
• Empreinte de la face
basale; calibration 5µ
• Les cellules sont stimulées
par dépolarisation
électrique (point blanc)
Suivi des cellules BON par microscopie TIRF
cellule
épifluorescence
z
vésicules
marquées
onde
évanescente
eau
verre
épifluorescence
I
i
faisceau
laser
i > icritique
(icritiquẽ 64°)
évanescence
Les cellules sont marquées par transfection par une construction
NPY-GFP. NPY est un peptide exprimé dans les vésicules
Description du montage utilisé au
laboratoire
Montage réalisé au laboratoire
faisceau laser
(Argon à 488 nm)
objectif
eau
cellule sur la lamelle
de verre
boite de culture
Système
de lentilles
prisme
(verre)
déplacement du miroir
Ce montage permet l'observation successive d'une même cellule à
différentes épaisseurs d'évanescence (comprises entre 80 et 300 nm)
Cellules BON stimulées
•
•
•
•
•
Lignée cellulaire dérivée
d’une tumeur carcinoïde
humaine
Cellules de type
entérochromaffines
(intestin) sécrétant de la
sérotonine
Stimulation par les ions Ba2+
Profondeur d’évanescence:
150nm
Cadence 25 Hz, accéléré 3
fois
Cellules BON stimulées par le Ca cagé
•
•
Un composé photosensible complexant Ca2+ incorporé dans la cellule
Un flash UV est utilisé pour libérer très rapidement le Ca2+
Observation d’un événement unique:
Le « flash »
33Hz, Ralenti 3x
Cellule BON transfectée NPY-GFP,
stimulation digitonine/Ca2+
Integrated
Intensité Intensity
intégrée
1900
1700
1500
1300
1100
900
700
2,5
3,5
Tim e (s)
Temps
(sec)
τflash ~ 100 ms
4,5
Origine du flash
• Le produit de sécrétion est le NPY-GFP
• La fluorescence de la GFP dépend du pH:
IF(pH5)<IF(pH7)
• la sécrétion change l’environnement de la GFP, de
pH5 intravésiculaire à pH7, produisant une
augmentation de la fluorescence (x3)
• La sécrétion est faite dans un champ évanescent
excitateur exponentiel, augmentation de la
fluorescence (x3)
• Ces deux facteurs rendent compte du pic (x9)
• La décroissance est due à la diffusion entre le verre
et la membrane basale
Observation après marquage de la
membrane vésiculaire
• Cellules PC-12 (tumeur
de la médullo-surrénale
de rat)
• Marquage par NPY-GFP
(protéine soluble, verte)
• Marquage par un colorant
de type styrène FM-64,
rouge et soluble dans les
membranes
• Le colorant se dilue dans
la membrane cellulaire
pendant la sécrétion
(Taraska et al (2004) PNAS, 101, 8780)
Des protéines de la membrane vésiculaire
diffusent dans la membrane plasmique, …
• Cellules chromaffines bovines transfectées par VAMPGFP
• La VAMP est une protéine abondante de la membrane
des granules chromaffines (M~30 kDa)
• Après la fusion, elle diffuse dans la membrane
plasmique
(Allersma et al (2004)MolBiolCel, 15, 4658) Vidéo
… mais d’autres ne diffusent pas!
• Cellules PC-12
transfectées par NPYGFP (soluble, vert) et
Phogrine-dsRED
(membranaire, 60kDa,
rouge)
• Après exocytose, la
Phogrine diffuse très
peu
(Taraska et al
(2003)PNAS,100, 2070)
Conclusions
Au moment de l’exocytose, il y a:
• Fusion des bicouches: diffusion d’un colorant et de la
VAMP
• La membrane vésiculaire garde une certaine identité
dans la membrane cellulaire
En fait, la membrane vésiculaire peut, dans certains
cas, conserver sa courbure
La concavité, vue par IRM, survit après la
sécrétion, vue par TIRFM de FM4-64
• La face basale d’une
cellule chromaffine est
observée par IRM
(interference reflection
microscopy)
• La sécrétion est suivie
par TIRFM (marquage
membranaire)
• La concavité persiste
après l’exocytose
(Llobet et al (2003) Neuron, 40, 1075)
La concavité, vue par IRM, survit après la
sécrétion, vue par TIRFM de FM4-64 (1)
• Les « concavités »
sont dans le canal
vert
• Le FM4-64 est vu
dans le canal rouge
Conservation de la concavité (2):
expérience TIRFM
• Cellule chromaffine marquée
sur la membrane vésiculaire
par VAM-GFP
• Dans 10% des cas, la
fluorescence apparaît
comme un anneau
• Cette figure est interprétée
comme la projection d’une
concavité
(Allersma et al (2004) MolBiolCell,15, 4658)
Conservation de la concavité (3): observation en
2 photons d’un marqueur extracellulaire
•
•
•
•
On utilise des « agrégats » de cellules chromaffines
Un marqueur fluorescent imperméant marque l’espace intercellulaire
(sulforhodamine)
Une exocytose apparaît comme une croissance de l’espace externe
En C, exocytose avec fusion totale; en E, persistance de la concavité
(Kishimoto et al (2006) EMBO J, 25, 673)
Implications mécanistiques
• La conservation de la cavité est
inattendue: après les travaux
ampérométriques, on attendait une
fusion totale
• Il faut que la forme soit maintenue de
l’intérieur (protéines non sécrétées de
la matrice) ou de l’extérieur (rôle de
l’actine, voir schéma)
• La conservation n’est pas toujours
observée
(Sukac and Bement (2006) MolBiolCell, 17, 1495)
Il n’y a pas de cavité persistante dans les
neurones
• Observation d’une
terminaison nerveuse
géante par IRM
• Pas de cavités visibles
• Augmentation de la
surface de l’empreinte
• Les systèmes sont
différents (taille,
matrice, cytosquelette)
(Lobet et al (2003) Neuron,40, 1075)
Exocytose séquentielle: une vésicule peut
fusionner sur une concavité
Expérience sur cellule
BON, en TIRFM
!t
!z
I0
I1
• La fluorescence disparaît
en deux temps
• La deuxième vésicule
étant plus loin, elle a une
intensité plus faible
(Tran et al (2007) Eur Biophys J, 37, 55)
Exocytose séquentielle (2): imagerie en 2
photons de l’espace extracellulaire
• L’espace extracellulaire est marqué par la sulfoRhodamine B
• Après stimulation, la fluorescence ne diminue pas, mais
augmente par exocytose de nouvelles vésicules
(Kishimoto et al (2006) EMBO J, 25, 673)
Utilisation de l’imagerie par 2 photons
avec un marqueur polaire extracellulaire
• Agrégats de cellules chromaffines, marqueur sulfoRhodamine
• Stimulation par KCl, images à 0,5 Hz
Si la concavité est conservée, la vésicule
peut-elle se refermer?
• Pour certains, l’exocytose pourrait être modulable:
libération partielle du contenu et fusion membranaire
incomplète
• C’est l’hypothèse du « kiss-and-run », très
développée pour les vésicules synaptiques
• Cette hypothèse a aussi été proposée pour les gros
granules des cellules neuroendocrines
• Toutefois, comment peut on arrêter le gonflement de
la matrice?
• La « cavicapture »: les vésicules de sécrétion
peuvent se refermer après libération de leur contenu
Argument en faveur de la « cavicapture »
(Taraska et al (2003) PNAS, 100, 2070)
• Cellules PC-12: marquage de la phogrine (protéine
transmembranaire)
• A gauche, marquage de l’extrémité N-terminale (cytosol)
• A droite, marquage du C-terminal par l’GFP (sensible au pH)
Argument en faveur de la « cavicapture » (2)
• L’EGFP est un indicateur de pH:
– L’augmentation de IF correspond à
l’ouverture de la vésicule (pH7)
– La décroissance à l’acidification après
refermeture
• Si on alcalinise par un pulse de
NH4+ (F) pendant la descente, la
fluorescence remonte (F,G)
• Si on alcalinise une vésicule au
repos, même variation de IF
• Il y a exocytose, puis
refermeture(cavicapture) et
acidification
(Taraska et al (2003) PNAS, 100, 2070)
Mécanisme hypothétique de la cavicapture
• L’exocytose (2) permet la
libération du contenu
• On peut alors avoir
persistance de forme (3)
• Puis, un mécanisme de type
endocytose (4,5) referme la
vésicule
• La pression de gonflement a
été évacuée en cours
d’exocytose
(Tsuboi et al (2004) J Biol Chem,279, 47115)
Conclusions sur les méthodes optiques
• Les méthodes optiques permettent l’observation in
vivo de l’événement unique
• Elles ont permis d’observer le phénomène de
persistance de forme, encore incompris
• L’exocytose séquentielle (différente de l’exocytose
composée) a été mise en évidence
• La « cavicapture » est une réalité, le « kiss-andrun », permettant de contrôler l’exocytose est
douteux dans les vesicules neuroendocrines
• Comme toujours en biologie, il y a des variations au
moins quantitatives entre les différents systèmes