Le pullulan - Université de Sherbrooke
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PROJET D’INTÉGRATION en génie biotechnologique 2004-2005 LE PULLULAN • Présentation des membres de l’équipe • Caractéristiques du Pullulan • Le Pullularia Pullulan • Applications du Pullulan • Le bioréacteur • Le milieu réactionnel • La séparation et la purification • Tests à effectuer sur le Pullulan pendant et après la production • Conclusion • Surprise… Présentation des membres de l’équipe Guillaume Beaudet David Beaudoin Véronique Berberi Alexandre Bourget Amélie Caron-Laramée Émilie Grenier Yannick Labrecque Nicolas Lauzière Jean-François Lemay Bona Men Milos Skrga LE PULLULAN Structure moléculaire du Pullulan http://www.hayashibara.co.jp/hbl/product-spec/pu101.html Caractéristiques du Pullulan Le Pullulan est un produit extracellulaire d’Aureobasidium Pullulan de plus en plus utilisé dans l’industrie pharmaceutique, alimentaire et pour diverses applications industrielles. Propriétés physiques ¾ Poudre blanche ¾ Inodore ¾ Sans saveur ¾ Non toxique ¾ Imperméable a l’oxygène ¾ Solution collante et visqueuse ¾ Possibilité de former un film ¾ Soluble dans l’eau mais pas dans le méthanol, l’acétone et l’éthanol Intérêts de production et applications du Pullulan ¾ Aucune pollution produite pendant le processus de synthèse Peut-être plastifiée par estérification ou éthérification ¾ Industrie pharmaceutique ¾ ° ° ° Fabrication de capsules solubles dans l’eau Enrobage de médicaments Nanoparticules libératrices de molécules bioactives •Industrie alimentaire ° Emballages ° Contenants ° Enrobages de produits alimentaires qui peuvent être lavés avant usage (pour dissoudre le film) ou consommés directement ° Fabrication d’aliment diététiques ° Épaississant pour confitures, sauces, etc ° Peut remplacer la gélatine et l’amidon pour augmenter la consistance d’aliments • Applications industrielles ◦ Colles et adhésifs ° Dans la construction pour recouvrir des surfaces ° Formation de fibres semblables à la soie et dont la résistance à l’élongation est comparable à celle des fibres de nylon ° Plastiques, comparable au polystyrène point de vue transparence et résistance. Il est plus élastique que le polystyrène. Et bien sûr il ne faudrait pas oublier … Les couches!!! Grâce à ses propriétés biodégradables, la couche offre une protection et un confort que bébé greenpeace adore! PULLULARIA PULLULAN Pullularia Pullulan (Levure) • Eaux naturelles • Égouts • Terre • Viande • Pulpe de bois • Fromage • Blé • Fruits et noyaux d’orge (là où il est le plus répandu) Étapes d’élaboration du projet Pullulan 2004-2005 • Recherche d’articles (sur le Pullulan, la fermentation, les levures, etc.) • Élaboration des étapes de production de Pullulan • Division des sous-équipes • Bioréacteur • Milieu réactionnel • Séparation et purification • Tests à effectuer pour caractériser le Pullulan obtenu • Précision de chacune des étapes de productions • Élaboration du protocole final et budget • Déroulement des étapes de production en laboratoire pour Hiver 2005 LE MILIEU RÉACTIONNEL Préparation de l’inoculum Levure: aureobasidium pullulans mutante (0,6g/L) Milieu de culture 5% de l’inoculum v/v (750mL) Deuxième fermentation Température: 30°C pH initial: 6,5 Aération: 10 L/min Essais futurs: Changement de sucre (sous-produit alimentaire) Optimisation: Vitesse d’agitation Débit d’aération LE BIORÉACTEUR MOTEUR AFFICHEUR FILTRE ROTAMÈTRE BONBONNE D’AIR SÉPARATION Étape 1 Dilution avec eau déionisée 500 ml milieu réactionnel 1V milieu réactionnel / 1V eau déionisée Étape 2 Centrifugation Levures, débris cellulaires et autres composantes du milieu réactionnel (gel) Surnageant (contient le Pullulan) Étape 3 Dilution avec eau déionisée 1V gel / 1V eau déionisée Étape 4 Centrifugation Gel (rejet) Surnageant (contient le pullulan) Étape 5 Combinaison des deux surnageants PURIFICATION Étape 1 Précipitation Éthanol 1V surnageant / 2V solvant Étape 2 Filtration Filtre millipore type HA 0.45µm Lavage avec le solvant ou Récupération du précipité de Pullulan sur le filtre Répétition des étapes 1 et 2 jusqu’à élimination totale du gel Étape 2 Centrifugation 13 000 rpm 25ºC 20 minutes Précipité de Pullulan Étape 3 Lavage à l’éther Étape 4 Séchage du Pullulan Résidus de gel TESTS Tests de caractérisations: - Spectroscopie IR - RMN 1H et RMN 13C Test de mesure du poids moléculaire: - Mesure de la viscosité en solution Tests de toxicité: - Cytotoxicité Spectroscopie IR Objectif: Déterminer les types de liaisons et les fonctions chimiques que contient la substance analysée. Exemple de spectre: RMN 1H et RMN 13C Objectif: Déterminer la structure moléculaire de la substance analysée. On étudie les atomes d’hydrogène (RMN 1H) ou de carbones (RMN 13C). Exemple de spectre: Viscosité Objectif: Détermination du poids moléculaire moyen en viscosité par la mesure expérimentale de la viscosité. Le poids moléculaire ne sert pas à savoir si le produit obtenu est bel et bien du pullulan, puisqu’il varie au cours de la fermentation. On cherchera plutôt à faire un suivi de son évolution dans le temps afin de la comparer à celles déjà obtenues par d’autres expérimentateurs. Relations: η= B ρ t η − η0 η sp = η0 [η ] = lim c→0 η sp c [η ] = lim η sp c →0 c ηsp/c (centipoises*100ml*g-1) η sp /c en fonction de c [η] c (g/100mL) Viscosité (suite) Relation entre la viscosité intrinsèque et le poids moléculaire moyen en viscosité: (relation de MarkHouwink) [η] = KMv α Cytotoxicité ¾ Objectif: déterminer la réponse de cellules vivantes face au matériau testé. ¾ Dans le cas du pullulan pur, nous analyserons seulement s’il est mortel. Test MTT ¾ MTT est un sel tetrazolium jaune métabolisé dans les mitochondries de cellules vivantes. ¾ Une fois métabolisé, le MTT est converti en formazan bleu. Réaction du MTT Culture cellulaire (L929) Ajout de MTT (jaune) Réaction métabolique mitochondriale Cellules mortes MTT Cellules vivantes Formazan Analyse du test MTT ¾ On détermine l’absorbance de chaque puit. ¾ On la met en relation avec la concentration de cellules vivantes. ¾ absorbance élevée = bonne viabilité!! CONCLUSION ET REMERCIEMENTS QUESTIONS FIN DE LA PRÉSENTATION … CHANSON PULLULAN 2004-2005 (Air de « Vive le vent ») Refrain : Pullulan, Pullulan, vive le Pullulan ! Premier projet d’intégration à l’Université….Hé ! Pullulan, Pullulan, vive le Pullulan ! Nous verrons en Janvier, ce que ça va donner Un polysaccharide Chaîne de maltotriose Synthétisé par le pullularia pullulan On peut en faire des films Des capsules de pilules Des couches de bébés Ou en mettre dans la confiture…Ho ! Refrain Trouver un protocole Un bioréacteur Choisir notre levure et le milieu réactionnel Comprendre la réaction Sans trop poser d’questions Et faut pas oublier De séparer et purifier…Ho ! Refrain On a tous travaillé Lu plus de 100 articles Des heures de réunions Et plus de cent mille déceptions La théorie terminée C’est l’temps d’expérimenter Il reste juste à souhaiter Qu’on f’ra pas sauter le labo…Ho ! Refrain Nous verrons en Janvier, ce que ça va donner FIN
