FRAICHARD_M2_2016_memo... - PRINCEPS

UNIVERSITE PARIS VII-PARIS DIDEROT
RAPPORT DE STAGE
Exploration in vitro de la stéroïdogénèse
placentaire du trophoblaste villeux normal et
aneuploïde.
Effectué dans le cadre de l’obtention du diplôme du M2 de Biologie Cellulaire
Physiologie et Pathologie (BCPP) spécialité Reproduction et Développement
Présenté et soutenu par Camille FRAICHARD
Préparé au sein de l’unité UMR-S 1139 « Physiopathologie et pharmacotoxicologie du
placenta humain », sous la direction de Jean GUIBOURDENCHE (PU-PH) et Marylise
HEBERT-SCHUSTER (MCU-PH)
06-06-2016

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REMERCIEMENTS :
En premier lieu, je tiens à remercier le Directeur du Laboratoire Dr Thierry FOURNIER de m'avoir
accueillie dans son unité UMR-S U1139 « Physiopathologie et pharmacotoxicologie du placenta
humain » et de m’avoir permise de réaliser ce travail.
Mes remerciements s'adressent également à mes deux maîtres de stage Dr Marylise HEBERT-
SCHUSTER et Pr. Jean GUIBOURDENCHE pour m'avoir fait confiance, m'avoir permis d'accroître
mes compétences et pour leur investissement important lors de ce stage.
J'exprime ma reconnaissance à Fatima FERREIRA, Pascale GERBAUD, Audrey CHISSEY et
Françoise VIBERT pour leur aide et leur disponibilité.
Et enfin, j'adresse mes remerciements à tout le personnel du laboratoire pour m'avoir intégrée dans
cette équipe.
Ce travail a été réalisé grâce au soutien financier du Programme de recherche interdisciplinaire sur les
crises et la protection sanitaires (PRINCEPS) de l’Université Sorbonne Paris Cité, dans le cadre du
programme « Investissements d’Avenir » lancé par l’État.

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Sommaire
ABREVIATIONS : ................................................................................................................................ 5
INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 7
1) Le placenta humain ..................................................................................................................... 7
2) Fonction endocrine placentaire ................................................................................................... 7
2.a) Hormones peptidique ................................................................................................................ 7
2.b) Hormones stéroïdes .................................................................................................................. 8
2.c) Caractérisation cellulaire de la stéroïdogénèse placentaire: .................................................... 9
3) Steroïdogénèse au cours de la grossesse .................................................................................. 9
3.a) Profil stéroïdien de grossesses non pathologiques .................................................................. 9
3.b) Cas de grossesses aneuploïdes ............................................................................................... 9
OBJECTIFS ........................................................................................................................................... 10
MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................... 10
1) Culture primaire de CTV humain ............................................................................................... 10
1.a) Matériel biologique et critère d’exclusion du prélèvement ...................................................... 10
1.b) Culture primaire de cytotrophoblastes villeux ......................................................................... 10
1.c) Entretien des cellules .............................................................................................................. 12
1.d) Surnageant et culot cellulaire .................................................................................................. 12
2) Extraction et dosage des protéines ........................................................................................... 12
2.a) Extraction des protéines ......................................................................................................... 12
2.b) Dosage des protéines ............................................................................................................. 12
3) Western Blot .............................................................................................................................. 13
3.a) Préparation des échantillons ................................................................................................... 13
3.b ) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes : SDS-PAGE ........... 13
3.c ) Transfert sur membrane ......................................................................................................... 13
3.d ) Immunodétection .................................................................................................................... 13
4) Immunocytochimie ..................................................................................................................... 14
4.a) Fixation des cellules ................................................................................................................ 14
4.b) Saturation des cellules ............................................................................................................ 15
4.c) Immunodétection et coloration DAPI ....................................................................................... 15
5) Extraction et dosage des ARN .................................................................................................. 15
5.a) Extraction des ARN totaux ...................................................................................................... 15
5.b) Extraction des ARN totaux : kit Acturus® Picopure® ............................................................... 16

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5.c ) Dosage des ARN .................................................................................................................... 16
6) Transcription Reverse ............................................................................................................... 16
7) PCR quantitative en temps réel ................................................................................................. 17
8) Dosages des hormones dans le surnageant cellulaire.............................................................. 17
RESULTATS.......................................................................................................................................... 17
1) Stéroïdogénèse physiologique de placentas à terme ............................................................... 17
1.a) Sécrétion hormonale au cours de la différenciation trophoblastique ...................................... 17
1.b) Expression des enzymes de la stéroïdogénèse ..................................................................... 18
1.c) Evolution de l’expression protéique in vitro des enzymes clefs de la stéroïdogénèse au cours
de la différenciation trophoblastique .............................................................................................. 18
1.e) Modulation de l’expression des enzymes de la stéroïdogénèse par l’AMPc .......................... 19
2) Stéroïdogénèse placentaire en cas de grossesse aneuploïde: ................................................ 20
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................................... 23
ANNEXES .............................................................................................................................................. 24
1) Composition des milieux et des solutions ................................................................................. 24
2) Référence anticorps .................................................................................................................. 24
3) Séquences amorces .................................................................................................................. 24

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ABREVIATIONS :
3-β-HSD1 : 3-β-HydoxyStéroïde Déshydrogénase 1
16-α-OH-DHEA-S : 16-alpha-hydroxy-dehydroepiandrostérone
17-β-HSD : 17-β-HydoxyStéroïde Déshydrogénase
ACTH : Adreno Cortico Trophic Hormone
ADN : Acide DésoxyRiboNucléique
ADNc : ADN complémentaire
ARN : Acide RiboNucléique
BSA : Bovin Serum Albumine
CRH : Corticotropin Releasing Hormone
CTV : Cytotrophoblaste Villeux
DHEA : Dehydroepiandrostérone
DHEA-S : Sulfate de Dehydroepiandrostérone
DMEM : Dulbeccos Modified Eagle Medium
dNTP : désoxyriboNucléotides Tri-Phosphate
DTT : Dithiothréitol
FSH : Follicle Stimulating Hormone
GH : Growth Hormone
GHRH : Growth Hormone–Releasing Hormone
GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone
HBSS : Hank's Balanced Salt Solution
hCG : human Chorionic Gonadotrophin
hCT : human Chorionic Thyrotropin
HDL : High Density Lipoprotein
hPL : human Placental Lactogen
IGF : Insulin-like Growth Factor
IMG : Interruption Médicale de Grossesse
IVG : Interruption Volontaire de Grossesse
LB : Lysis Buffer
LDL : Low Density Lipoprotein
LH : Luteinizing Hormone
MLN64 : Metastatic Lymph Node 64
P450SCC : P450 Side-Chain-Cleavage
PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
PAPP-A : Pregnancy-Associated Plasma Protein A
PBS : Phosphate Buffered Saline
PP5 : Placental Protein-5
PS : Pénicilline-Streptomycine
SCP2 : Sterol Carrier Protein 2
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate