FRAICHARD_M2_2016_memo... - PRINCEPS
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UNIVERSITE PARIS VII-PARIS DIDEROT RAPPORT DE STAGE Exploration in vitro de la stéroïdogénèse placentaire du trophoblaste villeux normal et aneuploïde. Effectué dans le cadre de l’obtention du diplôme du M2 de Biologie Cellulaire Physiologie et Pathologie (BCPP) spécialité Reproduction et Développement Présenté et soutenu par Camille FRAICHARD Préparé au sein de l’unité UMR-S 1139 « Physiopathologie et pharmacotoxicologie du placenta humain », sous la direction de Jean GUIBOURDENCHE (PU-PH) et Marylise HEBERT-SCHUSTER (MCU-PH) 06-06-2016 REMERCIEMENTS : En premier lieu, je tiens à remercier le Directeur du Laboratoire Dr Thierry FOURNIER de m'avoir accueillie dans son unité UMR-S U1139 « Physiopathologie et pharmacotoxicologie du placenta humain » et de m’avoir permise de réaliser ce travail. Mes remerciements s'adressent également à mes deux maîtres de stage Dr Marylise HEBERTSCHUSTER et Pr. Jean GUIBOURDENCHE pour m'avoir fait confiance, m'avoir permis d'accroître mes compétences et pour leur investissement important lors de ce stage. J'exprime ma reconnaissance à Fatima FERREIRA, Pascale GERBAUD, Audrey CHISSEY et Françoise VIBERT pour leur aide et leur disponibilité. Et enfin, j'adresse mes remerciements à tout le personnel du laboratoire pour m'avoir intégrée dans cette équipe. Ce travail a été réalisé grâce au soutien financier du Programme de recherche interdisciplinaire sur les crises et la protection sanitaires (PRINCEPS) de l’Université Sorbonne Paris Cité, dans le cadre du programme « Investissements d’Avenir » lancé par l’État. 2 Sommaire ABREVIATIONS : ................................................................................................................................ 5 INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 7 1) Le placenta humain ..................................................................................................................... 7 2) Fonction endocrine placentaire ................................................................................................... 7 2.a) Hormones peptidique ................................................................................................................ 7 2.b) Hormones stéroïdes .................................................................................................................. 8 2.c) Caractérisation cellulaire de la stéroïdogénèse placentaire: .................................................... 9 3) Steroïdogénèse au cours de la grossesse .................................................................................. 9 3.a) Profil stéroïdien de grossesses non pathologiques .................................................................. 9 3.b) Cas de grossesses aneuploïdes ............................................................................................... 9 OBJECTIFS ........................................................................................................................................... 10 MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................... 10 1) Culture primaire de CTV humain ............................................................................................... 10 1.a) Matériel biologique et critère d’exclusion du prélèvement ...................................................... 10 1.b) Culture primaire de cytotrophoblastes villeux ......................................................................... 10 1.c) Entretien des cellules .............................................................................................................. 12 1.d) Surnageant et culot cellulaire .................................................................................................. 12 2) Extraction et dosage des protéines ........................................................................................... 12 2.a) Extraction des protéines ......................................................................................................... 12 2.b) Dosage des protéines ............................................................................................................. 12 3) Western Blot .............................................................................................................................. 13 3.a) Préparation des échantillons ................................................................................................... 13 3.b ) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes : SDS-PAGE ........... 13 3.c ) Transfert sur membrane ......................................................................................................... 13 3.d ) Immunodétection.................................................................................................................... 13 4) Immunocytochimie ..................................................................................................................... 14 4.a) Fixation des cellules ................................................................................................................ 14 4.b) Saturation des cellules ............................................................................................................ 15 4.c) Immunodétection et coloration DAPI ....................................................................................... 15 5) Extraction et dosage des ARN .................................................................................................. 15 5.a) Extraction des ARN totaux ...................................................................................................... 15 ® ® 5.b) Extraction des ARN totaux : kit Acturus Picopure ............................................................... 16 3 5.c ) Dosage des ARN .................................................................................................................... 16 6) Transcription Reverse ............................................................................................................... 16 7) PCR quantitative en temps réel ................................................................................................. 17 8) Dosages des hormones dans le surnageant cellulaire.............................................................. 17 RESULTATS.......................................................................................................................................... 17 1) Stéroïdogénèse physiologique de placentas à terme ............................................................... 17 1.a) Sécrétion hormonale au cours de la différenciation trophoblastique ...................................... 17 1.b) Expression des enzymes de la stéroïdogénèse ..................................................................... 18 1.c) Evolution de l’expression protéique in vitro des enzymes clefs de la stéroïdogénèse au cours de la différenciation trophoblastique .............................................................................................. 18 1.e) Modulation de l’expression des enzymes de la stéroïdogénèse par l’AMPc .......................... 19 2) Stéroïdogénèse placentaire en cas de grossesse aneuploïde: ................................................ 20 BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................................... 23 ANNEXES.............................................................................................................................................. 24 1) Composition des milieux et des solutions ................................................................................. 24 2) Référence anticorps .................................................................................................................. 24 3) Séquences amorces .................................................................................................................. 24 4 ABREVIATIONS : 3-β-HSD1 : 3-β-HydoxyStéroïde Déshydrogénase 1 16-α-OH-DHEA-S : 16-alpha-hydroxy-dehydroepiandrostérone 17-β-HSD : 17-β-HydoxyStéroïde Déshydrogénase ACTH : Adreno Cortico Trophic Hormone ADN : Acide DésoxyRiboNucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : Acide RiboNucléique BSA : Bovin Serum Albumine CRH : Corticotropin Releasing Hormone CTV : Cytotrophoblaste Villeux DHEA : Dehydroepiandrostérone DHEA-S : Sulfate de Dehydroepiandrostérone DMEM : Dulbeccos Modified Eagle Medium dNTP : désoxyriboNucléotides Tri-Phosphate DTT : Dithiothréitol FSH : Follicle Stimulating Hormone GH : Growth Hormone GHRH : Growth Hormone–Releasing Hormone GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone HBSS : Hank's Balanced Salt Solution hCG : human Chorionic Gonadotrophin hCT : human Chorionic Thyrotropin HDL : High Density Lipoprotein hPL : human Placental Lactogen IGF : Insulin-like Growth Factor IMG : Interruption Médicale de Grossesse IVG : Interruption Volontaire de Grossesse LB : Lysis Buffer LDL : Low Density Lipoprotein LH : Luteinizing Hormone MLN64 : Metastatic Lymph Node 64 P450SCC : P450 Side-Chain-Cleavage PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis PAPP-A : Pregnancy-Associated Plasma Protein A PBS : Phosphate Buffered Saline PP5 : Placental Protein-5 PS : Pénicilline-Streptomycine SCP2 : Sterol Carrier Protein 2 SDS : Sodium Dodecyl Sulfate 5 SP1 : Pregnancy-Specific b1-Glycoprotein ST : Syncytiotrophoblaste StAR : Steroidogenic Acute Regulatory STS : Stéroïde Sulfatase SVF : Sérum de Veau Foetal TBS : Tris-Buffered Saline TGS : Tris-Glycine-SDS TRH : Thyrotropin Releasing Hormone VLDL : Very Low Density Lipoprotein 6 INTRODUCTION 1) Le placenta humain Le placenta humain est un organe transitoire indispensable à la grossesse permettant le bon développement de l’embryon puis du fœtus. Il est mis en place quand le blastocyste a épuisé ses réserves nutritives. C’est une interface entre la mère et le fœtus assurant un rôle de barrière et d’échange afin d’avoir un bon développement fœtal. Le placenta humain présente également une fonction endocrine développée, sécrétant dans le sang maternel de nombreuses hormones à la fois peptidiques et stéroïdes [1]. Le placenta humain est de type hémochorial, caractérisé par un contact direct entre le sang maternel et la villosité choriale. Cette dernière correspond à l’unité structurale et fonctionnelle du placenta humain. Deux types de villosités coexistent : les villosités crampons assurant l’ancrage à l’endomètre utérin et les villosités flottantes baignant entourées de sang maternel dans la chambre intervilleuse. La villosité choriale est composée d’un axe mésenchymateux, comprenant notamment les vaisseaux fœtaux, entouré d’une double assise de cellules épithéliales trophoblastiques : les cytotrophoblastes villeux (CTV à l’intérieur à la villosité) et le syncytiotrophoblaste (ST) bordant la villosité choriale (figure 1). Le ST libère des corps apoptotiques polynucléés dans la circulation maternelle. Il est continuellement régénéré par fusion des CTV sous jacents [1]. Après rupture des bouchons trophoblastiques au cours de la 10 ème semaine de grossesse, le ST se retrouve au contact direct du sang maternel, ce qui lui confère un rôle prépondérant dans les fonctions endocrines, métaboliques, sécrétrices, d’échanges et d’hémostase [1]. 2) Fonction endocrine placentaire La fonction endocrine est assurée au niveau placentaire par à la fois les CTV et le ST. Les cellules trophoblastiques libèrent de nombreux facteurs protéiques et stéroïdes qui agissent de façon autocrine, paracrine ou endocrine. Le ST libère majoritairement des facteurs dans la circulation maternelle assurant la fonction endocrine placentaire par des hormones de nature peptidiques ou stéroïdes [2] 2.a) Hormones peptidique Concernant les hormones peptidiques placentaires, les cellules trophoblastiques (CTV et ST) agissent de la même façon que le système hypothalamo-hypophysaire. Les CTV sont capables de sécréter des hormones placentaires semblables à la GnRH, CRH, TRH, GHRH et somatostatine hypothalamiques [2]. Quant au ST, la sécrétion des hormones peptidiques lui confère un rôle proche de celui de l’hypophyse par sécrétion d’hCG (dont l’action est comparable à la FSH et LH), de GH (hormone de croissance), d’hPL (hormone semblable à l’hormone de croissance hypophysaire et la prolactine hypophysaire), d’ACTH et d’hCT [2]. Le placenta est également capable de sécréter des facteurs de croissance du système inhibine/activine/follistatine ainsi que des facteurs de la famille des IGF [2]. 7 Il sécrète par ailleurs des facteurs peptidiques qui lui sont propres : les glycoprotéines SP1 et PAPP-A qui sont impliquées dans les phénomènes d’immunotolérance de la mère envers le fœtus, ainsi que la protéine placentaire PP5 qui inhibe la coagulation du sang au niveau du site d’implantation [2]. 2.b) Hormones stéroïdes Synthèse de la progestérone : La progestérone est l’hormone indispensable à la grossesse, permettant une bonne implantation de l’embryon par action myorelaxante sur le myomètre utérin et par son rôle immunomodulateur. Elle est également impliquée au moment de la parturition [2]. Le placenta humain est défini comme un organe stéroïdogène incomplet nécessitant des interactions à la fois avec le fœtus et la mère. Toutes les hormones dérivent du cholestérol, or les cellules placentaires sont incapables de produire du cholestérol de novo. Les cellules trophoblastiques utilisent donc le cholestérol maternel contenu dans les LDL, HDL et VLDL pour synthétiser la progestérone. Grâce aux récepteurs spécifiques de chaque lipoprotéines, le cholestérol peut être internalisé au niveau trophoblastique. Une fois libre, le cholestérol est guidé au niveau de la mitochondrie grâce à SCP2 puis transféré dans la mitochondrie grâce au transporteur MLN64 (appartenant à la famille StAR). Dans la mitochondrie, il sera transformé en prégnénolone par la P450 SCC. Celle-ci sera convertie en progestérone grâce à la 3-β-HSD (isoforme 1 prépondérant au niveau trophoblastique) [1, 3] (figure 2). Synthèse des œstrogènes : Les œstrogènes jouent des rôles divers au cours de la gestation notamment dans l’adaptation métabolique maternelle. L’oestriol a pour fonction principale d’augmenter le débit sanguin utéroplacentaire [4]. Il pourrait également être impliqué dans la parturition par contraction des fibres musculaires myométriales [5]. L’œstradiol, qui est l’œstrogène le plus abondant au cours de la grossesse, est impliqué dans l’angiogénèse et la vasodilation, lui permettant de réguler les flux sanguins [6]. Il aurait également un rôle myocontracturant au moment de la parturition [5]. Concernant la synthèse des œstrogènes, le placenta est dépourvu de l’enzyme αhydroxylase/17:20 lyase nécessaire à la conversion des progestatifs en androgènes amenant à la production des œstrogènes. Pour synthétiser l’œstrone et l’œstradiol, les cellules trophoblastiques utilisent donc le DHEA-S produit dans les surrénales fœtales et maternelles. Celui-ci sera désulfaté dans les cellules trophoblastiques par la STS. Via la 3-β-HSD1, le DHEA sera transformé en androstènedione qui peut être converti soit en œstrone par l’aromatase soit en testostérone par la 17β-HSD. L’œstradiol est produit soit à partir de l’œstrone grâce à la 17-β-HSD, soit à partir de la testostérone qui est aromatisé [1] (figure 3). Quant à la production d’œstriol, le DHEA-S doit d’abord être hydroxylé au niveau du foie fœtal pour donner le 16-α-OH-DHEA-S qui sera désulfaté au niveau trophoblastique par la STS. Le 16-α-OH-DHEA ainsi formé sera aromatisé en œstriol grâce à l’aromatase (codé par le gène CYP19A1) [1] (figure 3). 8 2.c) Caractérisation cellulaire de la stéroïdogénèse placentaire: Il existe très peu de données sur la stéroïdogénèse placentaire concernant l’expression enzymatique (à la fois au niveau transcriptionnel et protéique) au niveau de la villosité choriale, et plus particulièrement des cellules endocrines placentaires (CTV et ST). La localisation subcellulaire placentaire des enzymes de la stéroïdogénèse n’est pas d’avantage documentée. En 2002, Pezzi V. et al ont étudié le niveau d’expression des enzymes au niveau transcriptionnel sur tissu placentaire entier. Ils ont montré la transcription des enzymes aromatase, CYP11B1, CYP21, P450SCC, StAR, 3β-HSD1 et 2 [7]. 3) Steroïdogénèse au cours de la grossesse 3.a) Profil stéroïdien de grossesses non pathologiques Les hormones stéroïdes produites par les cellules trophoblastiques sont libérées dans la circulation maternelle. Les taux maternels sériques sont dosés en clinique pour évaluer le bon déroulement de la grossesse. Sécrétion de progestérone : Au cours des 6 premières semaines de grossesse, le corps jaune est la source principale de progestérone permettant de maintenir la grossesse. A partir de la 7 ème semaine de grossesse, le placenta prend le relais de cette synthèse et devient le site principal de production de la progestérone. Le taux sérique maternel en progestérone augmente continuellement au cours de la grossesse pour atteindre entre 100 et 300 ng/mL à terme [2]. Sécrétion d’œstrogènes : Tout comme la progestérone, la source principale d’œstrogène pendant les 6 premières semaines de grossesse est le corps jaune. Le taux sérique maternel d’œstradiol augmente continuellement à partir de 0,4 ng/mL pendant la phase lutéale du cycle jusqu’à atteindre entre 6 et 30 ng/mL à terme. [2]. Le taux de l’œstriol circulant dans le sang maternel est de 0,05 ng/mL au cours de la 9 ème semaine de grossesse. Il augmente progressivement et de façon plus importante entre 35-40 semaines de grossesse pour atteindre 10-30 ng/mL. Quant à l’œstrone, son taux sérique maternel est d’environ 0,3 ng/mL entre les 6 èmes èmes et 10 semaines de grossesse. Puis il augmente graduellement pour atteindre entre 2 et 30 ng/mL. 3.b) Cas de grossesses aneuploïdes Dans les grossesses avec un fœtus atteint d’un syndrome de Down (trisomie 21), il a été montré une altération du taux sérique maternel des marqueurs stéroïdiens (œstrogènes et progestérone) [8]. Cette modification des profils stéroïdiens est utilisée en clinique pour identifier les grossesses dont les fœtus sont aneuploïdes. L’un de ces marqueurs est l’œstriol, en effet, le taux d’œstriol non conjugué dans le sérum maternel est plus bas en cas de fœtus aneuploïde qu’en cas de grossesse non pathologique [8]. Une étude rétrospective démontre un taux de 90% de retard de croissance intra-utérin en cas d’aneuploïdie [9]. La moitié des avortements spontanés sont dus à des grossesses dont le fœtus est aneuploïde [10], suggérant un défaut de production ou de fonctionnement de la progestérone. Cette 9 altération de la voie progestérone, ainsi que le défaut de production placentaire d’œstriol ne sont actuellement pas caractérisés. OBJECTIFS La stéroïdogénèse placentaire n’étant toujours pas caractérisée spécifiquement au niveau des cellules endocrines du placenta, le premier objectif de notre travail a donc été d’étudier l’expression in vitro des enzymes de la stéroïdogénèse au niveau des CTV et du ST du placenta humain. Nous avons ciblé notre étude sur les enzymes monodirectionnelles, i.e. 3-β-HSD1 (voie des œstrogènes et progestatifs), STS (voie des œstrogènes), aromatase (voie des œstrogènes) et P450SCC (voie des progestatifs). Le second objectif a été d’explorer les altérations de cette stéroïdogénèse au niveau du placenta de grossesses dont le fœtus est aneuploïde. MATERIELS ET METHODES 1) Culture primaire de CTV humain 1.a) Matériel biologique et critère d’exclusion du prélèvement L’extraction des cytotrophoblastes villeux (CTV) s’effectue à partir de placenta à terme, obtenus après accord préalable avec une maternité de collaboration et après information éclairée des patientes, consentement révocable à tout moment. L’étude s’est articulée autour des 4 maternités parisiennes suivantes : Hôpital Privé d’Antony, Hôpital Cochin – Port Royal, hôpital Beaujon, Institut mutualiste Montsouris. La participation au projet de recherche n’a pas modifié la conduite à tenir obstétricale, ni la voie d’accouchement. Les placentas recueillis sont exclusivement obtenus à l’issu d’une césarienne programmée. Le placenta est traité dans l’heure qui suit son recueil, acheminé à l’état frais dans des conditions de transport de matériel biologique humain vers l’unité de recherche UMRS–1139. Le recueil et l’utilisation des placentas ont été validés par le comité d’éthique CPP (2015-mai-13909). 1.b) Culture primaire de cytotrophoblastes villeux Les conditions de culture de CTV humain permettent d’obtenir leur fusion et donc la formation de syncytia en 48 heures. Pour cela, le tissu placentaire doit d’abord être disséqué manuellement afin de recueillir les villosités choriales. Ces dernières sont ensuite digérées chimiquement pour libérer les cellules formant la villosité. Après avoir récupéré ces cellules, les CTV sont isolés grâce à un gradient ® de Percoll (Percoll Plus , GE Healthcare Bio-Sciences, Upswalla, Sweden) avant d’être ensemencés et cultivés à 37°C sous 5% de CO2. Première étape : dissection tissulaire et extraction des villosités choriales : En condition stérile (sous hotte à flux laminaire), la membrane basale côté maternel a été éliminée. Les cotylédons ont été isolés puis lavés 3 fois dans du Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ® (DMEM ; Sigma-Aldrich .Inc ; St-Louis, Missouri, USA) à température ambiante. Dans de l’Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 1X (Gibco ® TM by Life Technology ; Carlsbad, Californie, USA) à température ambiante, les cotylédons ont été disséqués afin d’éliminer le maximum d’axe 10 mésenchymateux. Les villosités choriales récupérées au sein du surnageant d’HBSS 1X ont été centrifugées 10 min à 350 x g à température ambiante. Le culot villositaire a ensuite été récupéré puis pesé. Cette première étape ne doit pas excéder 30 min afin de ne pas altérer le tissu. Deuxième étape : Digestion enzymatique des villosités choriales : Après avoir été pesés, les villosités choriales ont été suspendues dans une solution de trypsine ® TM 1:250 (Gibco by Life Technology ; Carlsbad, Californie, USA) 2% (composition en annexe) à raison de 5 mL de solution de trypsine/gramme de tissu. La suspension villositaire a été incubée 30 min au bain-marie à 37°C. Le surnageant a ensuite été éliminé et les villosités choriales ont de nouveau été incubées dans la solution de digestion pendant 10 min à 37°C. Les digestions sont répétées toutes les 10 minutes. Entre chaque digestion, la qualité de la digestion a été évaluée au microscope optique. La solution de digestion est définie comme médiocre lorsque les CTV sont encore présents à l’intérieur des villosités choriales ou lorsque les villosités commencent à se vider. Elle est dite satisfaisante au moment où les CTV commencent à se détacher des villosités et se retrouvent dans le surnageant de la solution de digestion. Les surnageants des digestions décrites comme satisfaisante ont été prélevés, passés à travers un filtre de 40 µm (EASYstrainer, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Autriche) et récupérés dans un tube de 50 mL contenant 5 mL de Sérum de Veau Fœtal (SVF ; ® Sigma-Aldrich .Inc ; St-Louis, Missouri, USA) qui arrête l’effet de la trypsine. Il est possible de réaliser 8 digestions de 10 min. Après les digestions réalisées, des rinçages ont été effectués par de l’HBSS 1X pré-chauffé à 37°C. De la même manière que concernant la solution de digestion, seuls les surnageants de rinçage satisfaisants ont été recueillis, filtré sur un tube contenant du SVF. Il est possible d’effectuer 4 rinçages à l’HBSS 1X. Quand tous les surnageants ont été récupérés, ils ont été centrifugés 10 min à 350 x g à température ambiante. Troisième étape : purification des CTV : Le culot des cellules obtenues précédemment a été repris dans une solution de DMEM + L® TM Glutamine (Gibco by Life Technology (PS ; Gibco ® TM by Life Technology ; Carlsbad, Californie, USA) 5% + Pénicilline-Streptomycine ; Carlsbad, Californie, USA) 5%. La suspension a alors été déposée sur le gradient de Percoll contenant des concentrations allant de 70% à 5% de Percoll. Puis ce gradient a été centrifugé 20 min à 1200 x g à température ambiante. Les CTV sont localisés au sein des bandes comprises entre les dilutions 30 et 45%. Ils ont été recueillis puis rincés par centrifugation de 10 min à 350 x g à température ambiante dans 50 mL d’une solution de DMEM + LGlutamine 5% + PS 5%. Quatrième étape : ensemencement des CTV : Après rinçage, le culot cellulaire a été repris dans 15 mL de milieu complet (composition en annexe). La concentration cellulaire a été mesurée dans une solution de suspension cellulaire/ bleu trypan (v/v ; 1/1) grâce au compteur BIO-RAD ® (TC20 TM Automated Cell Counter ; Hercules, Californie, USA). Enfin les cellules ont été ensemencées à raison de 1000 cellules/mm² puis cultivés à 37°C sous 5% CO2. 11 1.c) Entretien des cellules Toutes les 24h, les cellules ont été lavées avec du DMEM préalablement chauffé à 37°C et le milieu de culture a été remplacé par du nouveau milieu complet préalablement chauffé. 1.d) Surnageant et culot cellulaire A 24, 48 et 72h, le surnageant de culture cellulaire a été prélevé puis conservé à -20°C. Afin de récupérer des culots cellulaires secs, le tapis cellulaire a d’abord été lavé avec du Phosphate-Buffered ® TM Saline (PBS) 1X froid (Gibco by Life Technology ; Carlsbad, Californie, USA). Ensuite, le tapis cellulaire a été mis en suspension dans du PBS 1X froid par force mécanique (grattage). Les cellules ont été centrifugées 10 min à 350 x g. Le culot cellulaire sec a enfin été conservé à -80°C. 2) Extraction et dosage des protéines 2.a) Extraction des protéines 6 A partir de culots cellulaires secs de 3.10 cellules obtenus après 24, 48 ou 72h de culture, les cellules ont été lysées dans du tampon Lysis Buffer (LB) (150 µL) (Invitrogen TM ; Carlsbad, Californie, USA) contenant des inhibiteurs de protéase 100X (1X final) (Protease Inhibior Cocktail Set I, ® Calbiochem , San Diego, USA), puis soniquées 15 sec. L’homogénat cellulaire obtenu a ensuite été centrifugé 10 min à 4°C à 13 250 x g. Le surnageant a alors été récupéré et conservé à -20°C. A partir de villosités choriales congelées, le tissu a d’abord été broyé dans du tampon PBS 1XTriton 0,1% puis soniqué 15 sec. Le broyat a alors été centrifugé 10 min à 4°C à 13 250 x g, le surnageant récupéré et conservé à -20°C. 2.b) Dosage des protéines La méthode de Dosage Bradford a été utilisée pour évaluer la concentration protéique de divers échantillons. Il s’agit d’un dosage colorimétrique basé sur un changement de couleur du bleu de coomassie. La forme libre du bleu de coomassie absorbe à 465 nm. En présence de protéines, le bleu de coomassie se complexifie avec les acides aminés aromatiques et devient bleu, déplaçant ainsi sa raie d’absorption à 595 nm. L’intensité de la coloration bleue mesurée par spectrophotométrie, est proportionnelle à la quantité de protéine dosée. Pour réaliser ce dosage, une gamme étalon a été réalisée à partir d’une solution de Bovin Serum Albumine (BSA) à 0,2 mg/mL. La gamme contient des concentrations allant de 2 µg/mL à 40 µg/mL de BSA diluée dans de l’eau milliQ ainsi qu’un blanc (eau milliQ) ne contenant pas de protéine. Les échantillons à doser ont été dilué au 1/200 ème dans de l’eau milliQ. Le dosage a été effectué sur 160 µL de chaque échantillon (gamme et homogénat protéique) mélangé à 40 µL de solution de Bradford ® (BIORAD ; Hercules, Californie, USA). La mesure d’absorbance a été effectuée à 595 nm par l’EnSpire TM ® (2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer , Turku, Finlande). 12 3) Western Blot 3.a) Préparation des échantillons Les « western blot » ont été réalisé à partir de 20 µg de protéines qui ont été dénaturées dans une solution contenant du Dithiothréitol (DTT) 10X (1X final) (NuPAGE Agent Reducteur 10X, Novex TM by Life Technology ; Carlsbad, Californie, USA ) capable de rompre les ponts disulfure intra- et ® intermoléculaire et du tampon Laemmli 4X (1X final) (BIORAD ; Hercules, Californie, USA) (composition en annexe) contenant du Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), détergent anionique ajoutant une charge négative à toutes les protéines. Les échantillons ont alors été chauffés à 95°C pendant 5 min puis conservés dans la glace jusqu’au moment du dépôt. 3.b ) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes : SDS-PAGE L’électrophorèse est une technique de séparation des protéines selon leur poids moléculaire. La migration dans le gel se fait grâce à un courant électrique, l’anode située en bas du gel attire les protéines chargées négativement par le SDS, vers le bas. La séparation protéique est effectuée sur 2 gels successifs : le premier dit de concentration, le second dit de séparation. Ils diffèrent par leur pourcentage d’acrylamide : 4% pour le gel de concentration et 15 % pour celui de séparation (Mini® PROTEAN TGX TM ® Precast Gels, BIORAD ; Hercules, Californie, USA). Le faible % d’acrylamide permet aux protéines de se regrouper jusqu’à former une fine bande. Le gel de séparation permet de séparer les protéines ; les protéines à faible poids moléculaire passent plus facilement à travers le maillage d’acrylamide, et donc migrent plus rapidement que les protéines ayant un poids moléculaire plus important. Les puits formés dans le gel de concentration servent à déposer la totalité des échantillons préparés précédemment et un marqueur de poids moléculaire (PageRuler Prestained NIR Protein Ladder, ThermoScientific ; Waltham, Massachusetts, États-Unis) permettant de déterminer la taille des protéines d’intérêts de nos échantillons. La migration a été réalisée dans du tampon de ® migration Tris-Glycine-SDS (TGS) 10X (1X final) (BIORAD ; Hercules, Californie, USA) à 200 V pendant 30-35 min. 3.c ) Transfert sur membrane Le transfert sur membrane correspond à la migration des protéines depuis le gel d’acrylamide ® ® jusqu’à la membrane de nitrocellulose. Le kit de transfert BIORAD (Trans-Blot Turbo TM Transfer System Transfer Pack ; Hercules, Californie, USA) est utilisé. Le gel a d’abord été placé sur la membrane de nitrocellulose située sur « wetted transfer stack », puis l’ensemble a été transféré dans la cassette de transfert. Le second « wetted transfer stack » a alors été ajouté, la cassette a été ® fermée puis placée dans l’appareil BIORAD de transfert. Ce dernier a une durée de 3 à 7 min selon le nombre de membrane. 3.d ) Immunodétection L’immunodétection permet de révéler une protéine d’intérêt en utilisant la formation de complexe antigène-anticorps. L’antigène correspond à la protéine d’intérêt localisée sur la membrane de nitrocellulose. Un anticorps primaire dirigé contre cette protéine se lie à celle-ci au niveau de la membrane. Un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome reconnait l’anticorps primaire. 13 Avant d’incuber la membrane avec l’anticorps primaire, celle-ci a été saturée avec une solution de Tris-Buffered Saline (TBS) 1X-Tween (0,1%)-lait (5%)-azide (0,1%) (composition en annexe). Cette saturation évite les liaisons aspécifiques de l’anticorps primaire au niveau de la membrane. Après incubation (1h sous agitation à température ambiante), les protéines du lait ont totalement saturé les sites possibles de liaisons aspécifiques. La membrane a ensuite été incubée avec un anticorps primaire pendant toute une nuit, sous agitation, à 4°C. Les anticorps primaires ont été dilués dans du TBS 1X-Tween (0,1%)-lait (5%)-azide (0,1%). Les anticorps primaires utilisés sont : l’anti-aromatase ® (référence : ab66981 abcam , dilué au 1/1500 ème 1/1000 ème ® ), l’anti-STS (référence : ab62219 abcam , dilué au ® ), l’anti-P450 SCC (référence : ab75497 abcam , dilué au 1/1000 ® (référence : ab167417 abcam , dilué au 1/5000 sigma, dilué au 1/5000 ème ème ème ), l’anti-3-β-HSD1 ) et l’anti-actine (référence : clone AC-15 A5441 ). L’actine a été utilisée comme témoin de charge permettant de vérifier que la même quantité de protéines a été déposée dans chaque puits et est utilisée pour normaliser la quantité des protéines d’intérêt présente dans chaque puits. Ensuite, la membrane a été rincée brièvement dans du TBS 1X-Tween (0,1%), puis lavée 3 fois pendant 5 min sous agitation à température ambiante. La membrane a ensuite été incubée pendant 1 heure à température ambiante sous agitation à l’abri de la lumière avec l’anticorps secondaire : anticorps anti-lapin (référence : 35571, DyLight TM conjugated, ThermoScientific) pour révéler les protéines d’intérêt (dilué au 1/15 000ème dans du TBS 1X-Tween [0,1%]) ou anticorps anti-souris (référence : 35518, 680 conjugated, ThermoScientific) pour révéler l’actine (dilué au 1/15 000ème dans du TBS 1X-Tween [0,1%]). A nouveau, 1 rinçage et 3 lavages de 5 min dans du TBS 1X-Tween (0,1%) ont été réalisés sous agitation à température ambiante à l’abri de la lumière. La membrane a enfin été révélée à l’Odyssey ® Infrared Imager (Li-COR .Inc., Biosciences, Lincoln Nebraska USA) Pour que la membrane soit ré-utilisable entre 2 anticorps primaires, celle-ci a été incubée 10 min sous agitation à température ambiante dans une solution de déshybridation (ThermoScientific) diluée au ½ dans de l’eau milliQ, avant d’être de nouveau saturée. 4) Immunocytochimie L’immunocytochimie est une technique d’imagerie basée sur la formation de complexe antigèneanticorps. Elle permet de révéler une protéine d’intérêt à l’échelle cellulaire grâce à l’anticorps primaire capable d’interagir avec la protéine étudiée et à l’anticorps secondaire couplé à un AlexaFluor capable de se lier à l’anticoprs primaire. Le complexe antigène-anticorps primaire-anticorps secondaire est donc observable en microscopie à fluorescence permettant ainsi de révéler la présence de la protéine d’intérêt et sa localisation cellulaire. 4.a) Fixation des cellules La fixation cellulaire permet de conserver les cellules sans déformations dans un état proche de cellules vivantes. Aux différents temps de culture (24, 48 et 72h), les cellules ont été rincées avec du PBS 1X puis incubées 10 min à -20°C avec du méthanol absolu. 14 4.b) Saturation des cellules Après rinçages au PBS 1X, les cellules fixées ont été incubées 1h à température ambiante dans une solution PBS 1X-BSA 0,1%-Tween (0,1%) empêchant ainsi les anticorps primaires de se fixer de façon aspécifique (grâce à la BSA) et facilitant leur incorporation dans les cellules (grâce au Tween20). 4.c) Immunodétection et coloration DAPI Une fois saturées, les cellules ont été incubées 1 nuit à 4°C en condition humide avec la solution d’anticorps primaire comprenant les anticorps d’intérêt (anticorps lapin anti-aromatase [référence : ® ab66981 abcam , dilué au 1/1500 ème ® ], anticorps lapin anti-STS [référence ab62219 abcam ; dilué au ème 1/200 ® ], anticorps lapin anti-P450SCC [référence : ab75497 abcam ; dilué au 1/1000 ® anticorps lapin anti-3-βHSD1 [référence : ab167417 abcam ; dilué au 1/300 ® ème l’anticorps souris anti-desmoplakine (référence : ab16434 abcam ; dilué au 1/200 ème ] et ]) associés avec ème ) dilués dans la solution PBS 1X-BSA 0,1%-Tween (0,1%). Après rinçage avec du PBS 1X, les cellules ont été incubées 1h à température ambiante à l’abri de la lumière, avec la solution d’anticorps secondaire ® TM composée d’anticorps anti-souris couplé à l’AlexaFluor 555 (référence : A21422 ; Invitrogen ) et ® TM d’anticorps anti-lapin couplé à l’AlexaFluor 488 (référence : A11008 ; Life Technologie ), dilués au ème 1/200 dans une solution de PBS 1X-BSA 0,1%. Les cellules ont ensuite été rincées avec du PBS 1X. Puis les noyaux ont été marqués par incubation de 5 min à température ambiante à l’abri de la lumière avec une solution de DAPI dilué au 1/30 000ème dans du PBS 1X. Après rinçage des cellules avec PBS 1X, les cellules ont été montées sur lames et conservées à 4°C à l’abri de la lumière. Les cellules ont ensuite été observées sous microscopie à fluorescence. 5) Extraction et dosage des ARN 5.a) Extraction des ARN totaux Le kit d’extraction (QIAGEN-RNeasy Miny Kit) utilise une colonne de silice permettant de retenir les acides nucléiques. Le système est composé d’une colonne déposée sur un tube vide de 2 mL. Le kit contient un tampon de lyse cellulaire (tampon RLT), des tampons de lavages (tampons RW1 et RPE) et de l’eau RNase-free permettant l’élution des ARN. A partir de culot cellulaire secs de 3.10 6 cellules, les cellules lysées par 350 μL de tampon RLT-β-mercaptoéthanol 2%. Le lysat cellulaire a été homogénéisé par vortex. Les acides nucléiques ont ensuite été précipités grâce à 350 μL d’éthanol 70% puis homogénéisés par vortex. Le mélange a été totalement déposé sur la colonne RNeasy, puis centrifugé (15 sec à 8 000 x g). La colonne, ayant retenu les acides nucléiques, a été lavée (350 μL de tampon RW1) une première fois (15 sec à 8 000 x g). L’ADN a été éliminé par addition d’une solution contenant de la DNase à 12,5% (composition en annexe). La colonne contenant les ARN totaux a de nouveau été lavée (350 μL de tampon RW1 et 2 fois 500 µL tampon RPE). Puis les ARN totaux ont été élués avec 30 μL d’eau RNase-free. Les ARN totaux purifiés ont été conservés à -80°C. 15 ® 5.b) Extraction des ARN totaux : kit Acturus Picopure TM ® ® ® Le kit d’extraction (Life Technologie -Acturus Picopure ) utilise une colonne de purification MiraCol™ permettant de retenir les acides nucléiques. Le système est composé d’une colonne déposée sur un tube vide de 2 mL. Le kit contient un tampon de conditionnement de la colonne « Conditionning Buffer », un tampon d’extraction « Extraction Buffer », de l’éthanol 70%, des tampons de lavages « Wash Buffer 1 » et « Wash Buffer 2 » et un tampon d’élution des ARN « Elution 6 Buffer ». A partir de culots cellulaires secs de 1.10 cellules, les cellules ont été lysées par 100 μL de tampon « Extraction Buffer ». Le lysat cellulaire a été homogénéisé par pipetage avant d’être incubé 30 min à 42°C puis stocké 1h à -80°C. Les colonnes ont ensuite été préparées par incubation de 5 min à température ambiante avec 250 µL de « Conditionning Buffer », puis centrifugées 1 min à 16 000 x g. Les acides nucléiques ont ensuite été précipités grâce à 100 μL d’éthanol 70% puis ® ® homogénéisés par pipetage. Le mélange a été totalement déposé sur la colonne Acturus Picopure , puis centrifugé 2 min à 100 x g (pour lier les ARN à la colonne) puis 40 sec à 16 000 x g. La colonne, ayant retenu les acides nucléiques, a été lavée (350 μL de tampon RW1) une première fois avec 100 µL de « Wash Buffer 1 » par centrifugation d’1 min à 8 000 x g. L’ADN a été éliminé par incubation de 15 min à température ambiante avec une solution de DNase à 12,5% (composition en annexe). La colonne contenant les ARN totaux a de nouveau été lavée 1 fois avec 40 µL de « Wash Buffer 1 » (30 sec à 8 000 x g) et 3 fois avec 100 µL de « Wash Buffer 1 » (1 min à 16 000 x g). Puis les ARN totaux ont été élués avec 13 μL de tampon « Elution Buffer ». Les ARN totaux purifiés ont été conservés à 80°C. 5.c ) Dosage des ARN Le dosage des ARN par le système NanoDrop (Thermo Scientific) est basé sur l’absorbance des ARN à 260 nm. La mesure de l’absorbance est directement proportionnelle à la quantité d’ARN contenu dans l’échantillon ; il est donc possible de déterminer la concentration en ARN. Le système permet également d’estimer la pureté des ARN grâce au rapport A260/A280 et A260/A230. Les rapports A260/A280 et A260/A230 doivent être compris entre 1,8 et 2. Les mesures ont été réalisées à partir de 1 μL d’échantillons déposés sur le lecteur. 6) Transcription Reverse L’étape de transcription réverse (RT) permet de créer un hybride ARN/ADN qui va servir de matrice lors de la PCR quantitative. Cette étape nécessite d’utiliser une enzyme appartenant à la famille des reverses transcriptases qui en présence d’amorce aléatoire d’ADN et de désoxyriboNucléotides Tri-Phosphate (dNTP) va générer l’hybride ARN/ADN. La RT a été effectuée à partir de 500 ng d’ARN auxquels ont été ajoutés 3 µg d’amorce aléatoire (Random Primers) et des dNTP (0,5 mM de chaque dNTP final) dans un volume final de 13 μL. Ce mélange a été chauffé 10 min à 65°C, puis placé dans la glace quelques secondes avant d’être TM centrifugé. Du tampon « First Strand 5X » contenant des sels et des ions Mg2+ (Invitrogen ) (composition en annexe), du DTT (5 mM finale) ainsi que 40 unités d’inhibiteur de RNase (« TM RNaseOutTM », Invitrogen ) ont été ajoutés dans un volume final de 20 μL. La RT a été initiée par 16 TM ajout d’1 μL de reverse transcriptase (« Superscript III », Invitrogen ) et en chauffant pendant 50 min à 42°C. Ensuite, pour inactiver le processus, les tubes ont été placés 15 min à 70°C. Les échantillons contenant les hybrides ARN/ADN ont été conservés à -20°C. 7) PCR quantitative en temps réel La PCR quantitative en temps réel (qPCR) est une méthode d’amplification spécifique d’une séquence d’ADN complémentaire (ADNc). Des amorces sens et antisens spécifiques des gènes d’intérêt (séquences en annexe) sont utilisés afin de n’amplifier que la région choisie. Pour normaliser les résultats, 4 gènes de référence sont utilisés : la sous unité 18S du ribosome (18S), SDHA, RPLO et HGPRT dont l’expression ne varie pas au cours de la différenciation trophoblastique. Les échantillons d’hybride ARN/ADN ont été dilués au 1/5 ème . Le kit « qPCR MasterMix Plus for ® SYBR Green I w/ fluorescein » (Eurogentec) a été utilisé. Le tampon MasterMix 2X dans lequel sont placés l’ADNc et les amorces, contient les dNTP, l’ADN polymérase (HotGoldStar), du MgCl2 et le ® SYBR Green . Ce dernier est un agent intercalant de l’ADN qui est fluorescent. L’intensité de fluorescence émise mesurée par l’appareil Applied rend compte de la quantité d’ADN des gènes d’intérêt présent dans chaque échantillon. Dans une plaque de 384 puits, les amorces sens et antisens (à 100 nM chacune) ont été déposées, ainsi que le tampon MasterMix 2X dans un volume final de 15 μL. Ensuite, 5 μL des ème échantillons contenant les hybrides ARN/ADN (issus de la RT), dilués au 1/5 ont été ajoutés dans un volume final de 20 µL. La plaque a ensuite été centrifugée à 3000 rpm pendant 3 min à température ambiante. Puis l’amplification de l’ADNc ainsi que la lecture de la fluorescence ont été réalisées avec l’Appareil Applied. La plaque a d’abord été incubée 10 min à 95°C. L’amplification a ensuite été effectuée sur 40 cycles contenant une phase de dénaturation (10 sec à 95°C), d’hybridation (10 sec à 60°C) et d’élongation (10 sec à 72°C). 8) Dosages des hormones dans le surnageant cellulaire La concentration d’hCG total, d’œstradiol (E2) et de progestérone (P4) ont été mesurées dans les surnageants après 24, 48 et 72h de culture, par adaptation des tests ECLIA (Advia Centaur, Siemens). RESULTATS 1) Stéroïdogénèse physiologique de placentas à terme 1.a) Sécrétion hormonale au cours de la différenciation trophoblastique La différenciation morphologique du CTV en ST s’associant à une différenciation fonctionnelle, nous avons mesuré dans les surnageants de culture de cellules trophoblastiques humaines normales (césarienne à terme) les concentrations d’hCG, témoin de cette différenciation fonctionnelle. Nous avons parallèlement suivi l’évolution de la stéroïdogénèse placentaire en mesurant l’œstradiol et la progestérone dans les surnageant de culture à 24, 48 et 72h. 17 Au cours de la différenciation trophoblastique, entre les temps d’incubation 24 et 72h, la concentration de l’hCG augmente (en moyenne d’un facteur 21,2) (figure 4(A)) attestant la bonne différenciation morphologique et fonctionnelle du trophoblaste villeux. La progestérone augmente elle aussi mais plus faiblement (en moyenne d’un facteur 9) (figure 4(B)) alors que l’œstradiol diminue (en moyenne d’un facteur 1,9) (figure 4(C)). Ces dosages hormonaux montrent la bonne fonction sécrétrice des cellules trophoblastiques isolées, et nous permettent de valider ce modèle cellulaire comme modèle de cellules trophoblastiques humaines, et modèle de fusion trophoblastique. 1.b) Expression des enzymes de la stéroïdogénèse Afin d’explorer la stéroïdogénèse placentaire au cours de la différenciation trophoblastique, nous avons dans un premier temps, vérifier par immunocytochimie l’expression des enzymes clefs à 24, 48 et 72h de culture (figure 5 et 6). Concernant la voie de synthèse des progestatifs, à la fois la 3-β-HSD1 (figure 5(A)) et la P450 SCC (figure 5(B)) sont détectées au niveau des CTV à 24h et 48h et du ST à 72h. L’intensité de fluorescence semble augmenter avec la différentiation du CTV en ST. Quant à la voie de synthèse des œstrogènes, l’aromatase (figure 6(A)) et la STS (figure 6(B)) sont elles aussi détectées à toutes les étapes de la différenciation trophoblastique (de 24 à 72h de culture) et avec une intensité de fluorescence croissante. Pour toutes les enzymes étudiées, la localisation sub-cellulaire semble majoritairement cytoplasmique. Ces observations en immunocytochimie nous ont permis de montrer que les enzymes clefs des deux voies de la stéroïdogénèse placentaire étaient présentes dans notre modèle de culture cellulaire primaire dès l’isolement des cellules trophoblastiques villeuses humaines, et avec une augmentation d’expression globale au cours de la fusion vers le stade ST. 1.c) Evolution de l’expression protéique in vitro des enzymes clefs de la stéroïdogénèse au cours de la différenciation trophoblastique Nous avons alors quantifié leur expression au niveau protéique, par western-blot, au cours de la différenciation des CTV en ST. Concernant la 3-β-HSD1, son expression augmente d’un facteur 3,2 entre 24h à 48h, et d’un facteur 4,1 entre 24h et 72h au cours de la différenciation des CTV en ST (figure 7(A)). En revanche, l’expression de l’enzyme P450SCC diminue d’abord d’un facteur 0,71 entre 24 et 48h et d’un facteur 0,62 de 24 à 72h (figure 7(B)). Concernant la voie des œstrogènes, la STS voit son expression augmenter d’un facteur 1,2 entre 24 et 48h et d’un facteur 1,8 entre 24 et 72h (figure 7(C)). Enfin, l’expression de l’aromatase fluctue avec une diminution d’un facteur 0,95 à 48h par rapport à 24h, et une augmentation d’un facteur 1,3 entre 24 et 72h (figure 7(D)). 18 L’expression in vitro des enzymes clefs de la stéroïdogénèse semble donc évoluer au cours de la différenciation trophoblastiques. L’expression de la STS, de l’aromatase et de la 3-β-HSD1 augmente avec la formation syncytiale, alors que celle de la P450SCC de la voie des progestatifs diminue. 1.d) Evolution de l’expression in vitro des transcrits des enzymes clefs de la stéroïdogénèse au cours de la différenciation des CTV en ST Après avoir exploré l’expression in vitro des enzymes clefs au niveau protéique, nous avons caractérisé l’expression in vitro des transcrits de ces enzymes au cours de la différenciation trophoblastique, par RT-qPCR. Concernant la STS, l’aromatase et la P450SCC, le niveau d’expression diminue en moyenne de deux tiers entre 24h et 48h de culture (figure 8). La diminution est en moyenne de moitié à 72h de culture (figure 8). Concernant la 3-β-HSD1, le niveau d’expression des transcrits à 48h de culture diminue de 2,5 fois (facteur 0,4 par rapport à 24h) avant de revenir proche du niveau initial à 72h (facteur 0,9 par rapport à 24h) (figure 8). Le niveau d’expression in vitro des transcrits des enzymes clefs de la stéroïdogénèse placentaire montre donc une tendance à diminuer au cours de la différenciation des cellules trophoblastiques. 1.e) Modulation de l’expression des enzymes de la stéroïdogénèse par l’AMPc Ayant démontré une évolution de la stéroïdogénèse lors de la différenciation du CTV en ST, nous nous sommes focalisés sur la fusion des CTV, dernière étape de cette différenciation. Nous avons, pour ce faire, étudié l’action de l’AMPc (cellules cultivées ou non en présence de 8-Bromo-AMPc -4 (1.10 mol/L)), un intermédiaire clef de la fusion des CTV et de la différenciation du tissu villeux placentaire, sur l’expression protéique des enzymes clefs de la stéroïdogénèse. Le niveau d’expression de la P450SCC est augmenté de 1,5 à 24h en présence de 8-BromoAMPc (figure 9(B)). A 48h, il est augmenté d’un facteur 2,4 par rapport au contrôle sans 8-BromoAMPc à 48h (figure 9(B)). La STS, quant à elle, n’a montré qu’une très faible augmentation sous l’influence de l’AMPc. Il est augmenté d’un facteur 1,1 à 24h et de 1,02 par rapport au contrôle à 48h (figure 9(C)). Aromatase et 3-β-HSD1 montrent une diminution de leur expression. Le niveau d’expression de l’aromatase est faiblement diminué d’un facteur 0,8 à 24h (figure 9(D)) et fortement diminué d’un facteur 0,05 par rapport au contrôle à 48h (figure 9(D)). Concernant la 3-β-HSD1, son niveau d’expression est diminué en présence d’AMPc que ce soit à 24h (diminution d’un facteur 0,8 du contrôle à 24h (figure 9(A))) ou 48h (diminution d’un facteur 0,5 du contrôle à 48h (figure 9(A))). Au final, le 8-Bromo-AMPc semble induire l’expression de la P450SCC de la voie des progestatifs et dans une moindre mesure de la STS de la voie des œstrogènes. Parallèlement, le 8-Bromo-AMPc semble induire une baisse de synthèse de la 3-β-HSD1 et de l’aromatase, toutes deux impliquées dans la voie des œstrogènes. 19 2) Stéroïdogénèse placentaire en cas de grossesse aneuploïde: Après avoir caractérisé la stéroïdogénèse placentaire à terme, nous avons exploré in vitro cette stéroïdogénèse en cas de grossesse dont le fœtus est atteint d’aneuploïdie. En effet, l’œstriol sérique maternel est souvent diminué en cas de fœtus porteur d’une trisomie 18 ou 21. Pour cela, nous avons étudié l’expression tissulaire et cellulaire des enzymes de la stéroïdogénèse sur des placentas aneuploïdes issus d’Interruption Médicale de Grossesse (IMG) comparativement à des témoins de même âge gestationnel. Les IMG sont effectuées au cours du premier trimestre ou début du second trimestre. Cet âge gestationnel nous a amené à développer des conditions d’isolement des cellules trophoblastiques différentes. Malgré la difficulté d’isolement des cellules à cet âge gestationnel, nous avons réussi à mettre au point le protocole pour obtenir une culture de CTV comme le montre la figure 10. L’immunocytochimie montre la présence résiduelle de cellules fibroblastiques. Nous avons étudié en outre l’expression protéique des enzymes de la stéroïdogénèse à partir de villosités choriales entières. Les figures 11 et 12 présentent le niveau d’expression des enzymes issues à la fois de placentas euploïdes à terme et du 1 er trimestre, et de placentas aneuploïdes de T13, T18 et T21, obtenus en western blot. De ces résultats, il ressort que l’expression des enzymes est globalement plus élevée à terme par rapport au 1 er trimestre sauf la P450SCC qui montre un plus bas niveau d’expression à terme. En ce qui concerne l’expression enzymatique en cas d’aneuploïde au 1 er trimestre, il ressort des résultats obtenus avec les placentas dont le fœtus est atteint d’une trisomie 21, une grande variabilité interindividuelle pour un même terme. Ainsi même si globalement le niveau d’expression semble plus faible en cas d’aneuploïdie, il n’est pas possible de conclure. Il est nécessaire d’agrandir le nombre d’échantillons et d’obtenir des placentas euploïdes de même âge gestationnel. DISCUSSION Mon travail avait trois objectifs : 1) développer au sein du laboratoire les outils permettant d’étudier in vivo et in vitro la stéroïdogénèse placentaire 2) caractériser au sein du tissu placentaire au niveau du syncytiotrophoblaste (ST) mais aussi au niveau du cytotrophoblaste villeux (CTV), les différentes étapes de cette stéroïdogénèse tant oestrogénique que progestative 3) caractériser leur modulation en physiologie au cours de la différenciation du CTV en ST et en pathologie en commençant par les placentas aneuploïdes. Par ce travail, nous avons caractérisé pour la première fois toutes les étapes de la stéroïdogénèse placentaire in vitro, à la fois en terme de sécrétion et en terme d’expression enzymatique au cours de la différenciation des CTV en ST. En effet les résultats issus de la littérature ne concernaient pour la plupart que des études sur tissu placentaire entier et/ou sur ST et CTV par microscopie sur coupe de tissu entier [11]. Nos résultats ont montré qu’in vitro, la sécrétion de progestérone augmente lors de la différenciation morphologique et fonctionnelle du CTV en ST (comme en témoigne l’augmentation concomitante de l’hCG). Ils confirment que le ST est une source importante de progestérone mais que 20 le CTV en sécrète également. En revanche, cette différenciation ne s’accompagne pas d’une augmentation de la sécrétion d’œstradiol. Nous observons que les CTV tout comme le ST expriment à la fois au niveau des transcrits et des protéines, les enzymes clefs de la synthèse des œstrogènes (STS et aromatase) et de la progestérone (3-β-HSD1 et P450SCC). Au niveau transcriptionnel, le niveau d’expression des diverses enzymes diminue entre 24 et 48h avant d’augmenter à 72h quand la formation du ST est maximale. Au niveau protéique, l’expression de ces enzymes varie également avec la formation du ST. En effet, l’expression de P450SCC diminue alors que l’expression de la STS et de la 3-β-HSD1 augmente et que celle de l’aromatase semble stable pendant la fusion (premières 48h) puis augmente dans le ST. Il y aurait donc une expression différentielle de ces enzymes entre CTV et ST pouvant résulter d’une régulation différentielle entre CTV et ST. La différence de résultats entre le niveau d’expression des transcrits et des protéines suggère une régulation post-transcriptionnelle à déterminer. L’impact de la variabilité interindividuelle, inhérent aux modèles de cellules primaires, nécessite en outre une confirmation sur un panel plus large. Pour mieux évaluer la relation entre la différenciation physiologique du CTV en ST et le développement concomitant de la stéroïdogénèse placentaire, nous avons étudié l’effet du 8-BromoAMPc, analogue de l’AMPc et activateur de la voie PKA, qui induit la fusion trophoblastique. En présence de 8-Bromo-AMPc, il y a bien une induction de la formation du ST comme en atteste la forte augmentation de l’hCG sécrétée. Les dosages de progestérone et d’œstradiol dans le surnageant cellulaire en présence de 8-Bromo-AMPc sont en cours. On observe alors en intracellulaire une augmentation l’expression de la P450SCC et de la STS, mais pas de la 3-β-HSD1 et de l’aromatase. Ces résultats sont préliminaires, et doivent eux aussi être confirmés sur un plus grand nombre d’échantillon afin d’éviter le biais lié à la variabilité interindividuelle. Il est aussi dans nos objectifs de doser les stéroïdes intermédiaires afin de mesurer l’amplitude des flux de synthèse à chaque étape. En outre, nous avons débuté l’étude de l’effet de l’apport en substrats (cholestérol et DHEA-S) sur la stéroïdogénèse placentaire. En effet, nous souhaitons observer si la quantité de substrat disponible interfère sur la synthèse. Nous avons pour cela débuté par une étude de toxicité du solvant, ainsi les résultats de cette partie de l’étude ne sont pas encore disponibles. Le second objectif de notre travail était d’observer l’effet d’une aneuploïdie sur la stéroïdogénèse placentaire. Le recueil de placenta dont le fœtus est atteint d’aneuploïdie, ainsi que les témoins au même âge gestationnel ont été des étapes limitantes. Nous avons aussi rencontré des difficultés à mettre en place le modèle de culture primaire de CTV issus d’IMG précoces (premier et deuxième trimestre). J’ai néanmoins validé la mise au point du protocole spécifique de mise en culture de ces cellules de premier trimestre. L’isolement des cellules trophoblastiques est moins satisfaisant à partir de placentas d’IMG avec persistance de fibroblastes. Je n’ai donc principalement pu étudier l’expression protéique des enzymes de la stéroïdogénèse que sur villosité choriale entière. En cas d’aneuploïdie, en comparaison avec des tissus issus de grossesses normales au même terme, l’expression des enzymes est globalement abaissée à l’exception de l’aromatase. Il existe une grande variabilité interindividuelle, ainsi le faible nombre d’échantillon par type d’aneuploïdie ne nous permet pas de conclure quant à une éventuelle différence entre T13, 18 et 21. Ces résultats doivent donc être 21 confirmés sur un plus grand nombre d’échantillon de tissus aneuploïdes et euploïdes au même terme. De plus, la villosité choriale contenant d’autres types cellulaires, nous avons voulu étudier l’expression des enzymes de la stéroïdogénèse au sein de fibroblastes issus de ces villosités. Les résultats préliminaires de cette étude montrent que les fibroblastes expriment la P450SCC et l’aromatase mais n’expriment ni la STS ni la 3-β-HSD1. Ces résultats supposent un rôle synergique entre les fibroblastes et les cellules trophoblastiques, comme observé dans d’autres tissus, même si les fibroblastes ne disposent pas de l’équipement complet enzymatique pour sécréter ces stéroïdes. Il serait donc intéressant de mettre au point une co-culture de CTV et fibroblaste humain afin de définir les niveaux d’interaction. En conclusion, ce modèle cellulaire m’a permis de caractériser pour la première fois l’expression in vitro d’enzymes clefs de la stéroïdogénèse placentaire au cours de la différenciation trophoblastique de placentas à terme. Nous avons établi que cette stéroidogénèse n’était pas exclusivement d’origine syncytiotrophoblastique, le CTV disposant de tout l’équipement enzymatique pour produire ces stéroïdes. Nous avons également montré que la différenciation morphologique et fonctionnelle du CTV en ST s’accompagnait d’une sécrétion différentielle de l’œstradiol et de la progestérone et d’une modulation de l’expression des enzymes impliquées. Cette modulation n’étant pas univoque, il nous faudra analyser chaque stéroïde produit à chaque étape de la stéroïdogénèse. L’adaptation de notre modèle aux placentas aneuploïdes du premier trimestre a permis de mettre en évidence une modulation de l’expression des enzymes, mais là encore avec une variabilité interindividuelle qui nécessite une étude sur un plus large panel de prélèvements pour statuer sur le sens de cette modulation. Au final, ces observations ouvrent à de nombreuses recherches complémentaires pour conforter nos résultats, notamment à l’étude du rôle des cellules fibroblastiques dans cette synthèse qui n’a jusqu’à maintenant jamais été décrit. Afin d’aller plus avant dans la caractérisation de la stéroïdogénèse placentaire, nous souhaitons de plus étudier l’expression, au niveau transcriptionnel et protéique, des autres enzymes des voies des synthèses (17-β-HSD) et de leurs isoformes, mais également l’expression des récepteurs aux lipoprotéines et du transporteur MLN64 qui participe aux étapes mitochiondriales de la stéroidogénèse. Au final, nous avons mis au point les outils nécessaires pour étudier la fonction de synthèse stéroïdienne du tissu placentaire et ses perturbations. Les résultats nous permettent de définir les cibles placentaires potentielles des perturbateurs endocriniens, en vue de l’étude des effets sur la stéroïdogénèse des traitements maternels au long cours, tels que les antiVIH (inhibiteurs de protéases) ou les anti-diabétiques oraux. 22 BIBLIOGRAPHIE [1] Lecarpentier E, Fournier T, Guibourdenche J, Gil S, Tsatsaris V, Le placenta humain. EMCObstétrique/Gynécologie 2015; 10(2): 1-18. 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Placenta 2005; 26(5): 387-92. 23 ANNEXES 1) Composition des milieux et des solutions ® DNase : 10 µL de DNase à 50 µM + 70 µL de tampon RDD (QIAGEN ) First Strand 5X : 250 mM Tris-HCl pH = 8,3 + 375 mM KCl + 15 mM MgCl2 Laemmli 4X : 277,8 mM Tris-HCl pH 6,8 + 44,4% (v/v) glycérol + 4,4% SDS + 0,02% bleu de bromophénol Milieu complet : DMEM + SVF (Courtaboeuf , France) 10% + L-Glutamine 5% + PS 5% Solution trypsine 2% : 500 mL d’HBSS 1X + 1g trypsine + CaCl 2 0,01 M (500 µL) + MgSO4 0,01 M (500 µL) + DNase 100X (250 µL) (ajouté après filtration) + 35 mL lait bio (ajouté après filtration) TBS 10X : Tris-HCl (24,23 g) + NaCl (80,04g) pour 1L, pH 7,6 + qsp eau osmosée TBS 1X-Tween 0,1% (1L) : 100 mL TBS 10X + 1 mL Tween20 + qsp eau osmosée TBS 1X-Tween 0,1%-lait écrémé 5%-azide 0,1% : 100 mL TBS 10X + 1 mL Tween20 + 1 mL azide + 5% lait écrémé 2) Référence anticorps Anticorps anti-aromatase : référence : ab66981 abcam Anticorps anti-STS : référence : ab62219 abcam ® ® Anticorps anti-P450 SCC : référence : ab75497 abcam ® Anticorps anti-3-β-HSD1 : référence : ab167417 abcam ® ® Anticorps anti-actine : référence : clone AC-15 A5441 Sigma-Aldrich .Inc ; St-Louis, Missouri, USA Anticorps anti-lapin : référence : 35571, DyLight TM conjugated, ThermoScientific Waltham, Massachusetts, États-Unis Anticorps anti-souris : référence : 35518, 680 conjugated, ThermoScientific Waltham, Massachusetts, ÉtatsUnis Anticorps anti-desmoplakine : référence : ab16434 abcam ® ® TM Anticorps anti-souris couplé à l’AlexaFluor 555 : référence : A21422 ; Invitrogen ® TM Anticorps anti-lapin couplé à l’AlexaFluor 488 : référence : A11008 ; Life Technologie 3) Séquences amorces P450SCC : Forward primer : TTTTTGCCCCTGTTGGATGCA Reverse primer : CCCTGGCGCTCCCCAAAAAT Aromatase : Forward primer : CCTGAAGCCATGCCTGCTGC Reverse primer : CCGATCCCCATCCACAGGAATCT 3-β-HSD1 : Forward primer : AGTACGTCCACTCTTCTGTCCA Reverse primer : TTCTCCTTCACCAAGAGGCG STS : Forward primer : GGCTGACGACCTCGGCATTG Reverse primer : ACCGGCCAGTCATGAAGGCTG 24
