Section SV4 Module de Biochimie Métabolique Partie - FSA
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[ S ou P ] PPRS Phase Stationnaire PPOS dS dP v = = = Cte dt dt [P] S1 dS S2 P1 d[ES] = 0 dt dP [S] P2 [ES] t0 t1 t2 Temps en min dt Section SV4 Module de Biochimie Métabolique Partie Enzymologie Année universitaire: 2014-2015 Pr Najat ALIF 0 TABLE DES MATIERES CINETIQUE DES REACTIONS CHIMIQUES .................................................................................1 1) Vitesse de réaction.......................................................................................................................1 1. 1) Vitesse initiale .....................................................................................................................1 1.2) Vitesse instantanée................................................................................................................1 2) Ordre d'une réaction.....................................................................................................................2 2. 1) Réaction d'ordre zéro ...........................................................................................................2 2. 2) Réactions du premier ordre..................................................................................................2 2.3) Réactions du deuxième ordre................................................................................................4 2.4) Réversibilité..........................................................................................................................4 ASPECTS GENERAUX SUR LES ENZYMES.................................................................................5 1) Définitions ...................................................................................................................................5 1.1 Enzyme...................................................................................................................................5 1.2 Catalyseur...............................................................................................................................5 1.3 Substrat...................................................................................................................................5 1.4 Produit....................................................................................................................................5 1.5 Cofacteur................................................................................................................................5 1.6 Coenzyme et groupe prosthétique..........................................................................................5 1.7 Site actif: lieu de la catalyse...................................................................................................5 2) Propriétés générales des enzymes................................................................................................5 2.1) Catalyse.................................................................................................................................5 2.2) Spécificité .............................................................................................................................6 2.2.1) Spécificité de réaction....................................................................................................6 2.2.2) Spécificité du substrat....................................................................................................6 2.2.3) Stéréospécificité.............................................................................................................6 3. Classification des enzymes ..........................................................................................................6 CINETIQUE ENZYMATIQUE CLASSIQUE ...................................................................................9 1) Le complexe enzyme-substrat : ...................................................................................................9 1.1 Modèle de représentation selon Fischer.................................................................................9 1.2 Structure élastique des protéines: l'ajustement induit "induced fut"......................................9 2) Cinétique enzymatique fondamentale..........................................................................................9 2.1 Hypothèse de l'état stationnaire selon Michaelis-Menten......................................................9 2-1-1- Phases de la réaction .....................................................................................................9 2.1.2 Mesure de la vitesse de la réaction................................................................................10 2.1.3 Effet de la concentration d’enzyme ..............................................................................11 2.1.4 Effet de la concentration en substrat. ............................................................................12 2.2 Cinétique Michaelienne .......................................................................................................13 2.3 Représentation graphique.....................................................................................................15 3) Effecteurs réversibles de la réaction enzymatique.....................................................................16 1 3.1 Effecteur...............................................................................................................................16 4. Inhibitions enzymatiques ...........................................................................................................16 4.1 Inhibition compétitive. .........................................................................................................16 4.1.1 Cinétique de l’inhibition compétitive ...........................................................................17 4.1.2 Exemples d’inhibition compétitive ...............................................................................18 4.1.3 Représentation graphique en hyperbole ........................................................................18 4.2 Inhibition non compétitive ..................................................................................................18 4.2.1 Cinétique de l’inhibition non compétitive ....................................................................19 4.2.2 Exemples d’inhibitions non compétitives .....................................................................20 4.2.3 Représentations graphiques...........................................................................................21 4.3 Inhibition anti (ou un) compétitive (équation) .....................................................................21 4.3.1 Cinétique de l’inhibition incompétitive ........................................................................21 4.3.2 Représentations graphiques...........................................................................................22 4.4 Cas particulier : inhibition par excès de substrat .................................................................23 4.5 Rôles biologique de l’inhibition...........................................................................................23 4.6 Tableau (10) comparatif des paramètres cinétiques pour différents types d’inhibition.......24 4.7. Tableau (11) Tableau comparatif des différentes représentations cinétiques pour différents types d’inhibitions......................................................................................................................25 5) Influence du pH sur l'activité enzymatique ...........................................................................26 2 CINETIQUE DES REACTIONS CHIMIQUES 1) Vitesse de réaction La vitesse d'une réaction chimique est définie par la quantité de substances transformées ou de produit formé par unité de temps. Les facteurs qui influencent la vitesse de la réaction sont: la concentration, la température et la présence de catalyseurs. 1. 1) Vitesse initiale A+B→C+D A et B sont les substances réagissantes et C et D sont les produits. vm = C/t = (C1 - C0)/(t1 - t0) vm = - A/t = - (A1 - A0)/(t1 - t0) La vitesse initiale est mesurée par la pente de la tangente à la courbe au temps 0. 1.2) Vitesse instantanée La vitesse de la réaction varie le plus souvent entre son début et sa fin. A chaque temps, on peut définir une vitesse instantanée qui est égale à la pente de la tangente à la courbe de vitesse au point correspondant à ce temps. v= dC/dt = (C2 - C1)/(t2 - t1) v= - dA/dt = - (A2 - A1)/(t2 - t1) 1 2) Ordre d'une réaction A+B→C+D v = k [A]m[B]n k = Constante de vitesse. La vitesse d'une réaction est fonction des concentrations des substances réagissantes. La somme m + n est appelé ordre de la réaction. C'est une valeur expérimentale obtenue à partir d'une série de détermination de la vitesse en fonction des concentration des substances réagissante. Elle permet de caractériser le mécanisme d'une réaction. Elles est distincte de la stœchiométrie (on ne doit pas la confondre avec le nombre de molécules réagissantes. 2. 1) Réaction d'ordre zéro Quand m + n = 0, on dit que la réaction est d'ordre zéro. d[A] v = - ———— = ko, La vitesse est constante. dt La quantité de produit formé est linéaire en fonction du temps. Ce type de réaction , dite d'ordre 0, s'observe en milieu hétérogène, par exemple, lorsque la substance réagissante, peu soluble, est présente en quantité supérieure à sa solubilité. Cet excès se dissout à mesure que la réaction progresse et maintient la saturation de la solution. L'ordre de la réaction cesse d'être nul lorsque la concentration devient inférieur à la saturation. Une cinétique d'ordre nul s'obtient également lorsque la substance dont on mesure la variation résulte d'une étape intermédiaire de la réaction avec participation d'une substance étrangère, comme le complexe enzyme-substrat pendant la phase stationnaire des réactions enzymatiques. 2. 2) Réactions du premier ordre Quand m + n = 1, on dit que la réaction est de premier ordre. C'est le cas d'une molécule qui se transforme en une autre. Par exemple une protéine qui se dénature, un radioélément qui se désintègre, mutarotation de sucres, isomérisation, racémisation d'acides aminés... Considérons la réaction de transformation de A en B : A B Au cours de la réaction la vitesse de la réaction varie et ne peut être considérée comme constante que pendant un intervalle de temps infiniment petit. Le nombre de molécules de produit B qui apparaissent pendant cet intervalle est évidement égal au nombre de molécules A qui disparaissent. On a donc : d[A] d[B] v= = = k1A dt dt 2 La constante de proportionnalité (k1) est nommée constante de vitesse ou vitesse spécifique de réaction. Si [A]o est la concentration initiale de la molécule réagissant, après un temps t il se sera transformé une quantité x de ce produit, dont il subsistera une concentration ([A]o - x). La vitesse à ce moment est donnée par : dx d([A]o - x) v = = = k1 [A]o – x dt dt Par intégration il vient : - Ln ([A]o - x) = k1t + Cte Lorsque t = 0, on a : x = 0 et par conséquent la Cte = -Ln [A]o En introduisant cette valeur dans l'équation ci-dessus, il vient 1 [A]o k1 = —— Ln —— t [A]o - x Une telle réaction, dite du premier ordre, se caractérise par plusieurs propriétés : a) k1 a les dimensions d'inverse d'un temps. b) Au bout d'un temps T1/2 appelé période, la moitié de la quantité initiale Ao a subi la réaction 1 0,693 T1/2 = —— Ln 2 = ——— k1 k1 Ce temps est indépendant de la concentration. c) Représentation graphique : Figure 1 : A=f(Ln2/k1) ; Figure 2 :LnA=f(t) 3 2.3) Réactions du deuxième ordre Quand m + n = 2, on dit que la réaction est de deuxième ordre A+B C d[A] d[B] d[C] v = = = = k2 [A][B] dt dt dt Ce type de réactions ne fait pas partie du programme de cet élément de module. 2.4) Réversibilité k+1 A B k-1 k+1 et k-1 étant respectivement les constantes de vitesse pour les réaction aller et retour. Au temps initial, la concentration de A est A0 et celle de B nulle. Après un temps t la concentration de A sera devenue [A]0 - x et celle de B, x. A ce moment, on observe une réaction aller proportionnelle à ([A]0 - x) et une réaction retour, proportionnelle à x. à l'instant t = 0 [A] = [A]0 t=t et [B] = 0 [A] = [A]0 - x et [B] = x v = - d[A] = dx = k+1 ([A]0 - x) - k -1 x = k+1 [A]0 - x (k+1 + k-1) dt dt Lorsque le système atteint l'équilibre, la vitesse des deux réactions est égale et la concentration en B est représentée par xeq. v = - d[A] = dx = 0 dt dt d'où k+1 [A]0 = xeq (k+1 + k-1) En remplaçant k+1 [A]0 dans l'équation différentielle on obtient: - Ln (xeq - x) = (k+1 Lorsque t = 0, x = 0 dx = xeq (k+1 + k-1) - x (k+1 + k-1) dt dx = (k+1 + k-1) dt xeq - x + k-1) t + Cte et par conséquent Cte = -Ln xeq xeq Ln = (k+1 + k-1) t xeq - x 4 ASPECTS GENERAUX SUR LES ENZYMES 1) Définitions 1.1 Enzyme C'est une protéine (sauf le ribozyme) présentant des propriétés de catalyse spécifique d’une réaction chimique du métabolisme de l’être vivant qui la produit. Cette protéine est régulée. 1.2 Catalyseur C'est un composé intervenant dans une réaction chimique sans être modifié. Il Accélère la réaction chimique sans modifier l’équilibre de la réaction. 1.3 Substrat C'est une molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action catalytique d’une enzyme. 1.4 Produit C'est une molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme. 1.5 Cofacteur C'est un corps chimique (atome ou molécule) intervenant obligatoirement dans la réaction enzymatique, pour transporter ou compléter un substrat, ou bien pour accepter un produit, comme participant à la structure de l’enzyme 1.6 Coenzyme et groupe prosthétique L'enzyme exige quelque fois la participation de molécules non protéiques. On leur donne en principe le nom de coenzyme, lorsque ces molécules ne sont pas fixées par des liaisons covalentes à la protéine, et de groupe prosthétique lorsqu'elles y sont liées. Dans ces deux cas, la partie protéique proprement dite porte le nom d'apoenzyme, l'ensemble apoenzyme et cofacteur, celui de l'holoenzyme. Exemple: NAD, NADP, FAD et FMN. 1.7 Site actif: lieu de la catalyse C'est une entité tridimensionnelle se trouvant dans une crevasse particulière dans un microenvironnement spécifique et occupant un petit volume par rapport au volume total de l'enzyme (moins de 5%). Il comporte des groupements réactifs permettant, la reconnaissance du substrat et sa fixation de façon stéréospécifique et le déroulement de la catalyse. Il peut aussi fixer les effecteurs enzymatiques, soit les activateurs soit les inhibiteurs. Toute modification structurale du site actif engendre un arrêt de la catalyse par formation d'enzymes inactives. 2) Propriétés générales des enzymes 2.1) Catalyse Les enzymes sont des catalyseurs; Ils respectent strictement les lois de la catalyse: - L'enzyme ne figure pas quantitativement parmi les produits de la réaction, il n'est donc pas consommé par celle-ci et chaque molécule d'enzyme peut théoriquement provoquer la transformation d'un nombre illimité de molécules de substrat. - L'enzyme ne modifie pas la nature de la réaction, ni son équilibre, ni son bilan thermodynamique. - Mais l'enzyme modifie en accélérant la vitesse de la réaction. 5 2.2) Spécificité 2.2.1) Spécificité de réaction Les enzymes catalysent spécifiquement une réaction ou un type de réaction. Une déshydrogénase catalyse une réaction de déshydrogénation, une hydrolase catalyse une réaction d'hydrolyse. 2.2.2) Spécificité du substrat Chaque enzyme possède un substrat privilégié porteur du groupes d'atomes sur lesquels a lieu la réaction. Cette spécificité peut êtres plus au moins étroite et chaque enzyme accepte comme substrat des molécules voisines du substrat normal, avec, pour chacune une cinétique particulière. 2.2.3) Stéréospécificité Cette propriété des enzymes les distingue des catalyseurs chimiques. La quasi-totalité des molécules biochimiques existent sous formes de deux antipodes D ou L. Chaque enzyme ne reconnait que l'un des deux antipodes. La spécificité peut être élargie à la configuration. Il existe, par exemple, l' galactosidase et la -galactosidase. 3. Classification des enzymes On classe les enzymes en 6 catégories suivant les réactions biochimiques qu'elles catalysent. EC: Enzyme Commission. On indique d'abord le nom du substrat, puis celui du type de réaction, et enfin le suffixe ase (L-lactate déshydrogénase). Dans le cas de réaction équilibrées, on peut former le nom à partir des substrat ou à partir des produits de la réaction, selon les cas. EC1: LES OXYDOREDUCTASES (TABLEAU 1) Transfert d'hydrogène, d'oxygène ou d'électrons entre molécules. Cette classe comprend les déshydrogénases, oxydases, peroxydases, hydroxylases, oxygénases, etc. Exemple: Glucose oxydase= -D-glucose oxygène-1-oxydoréductase. ACTIONS CATALYTIQUES Sur un groupement = C - OH (du donateur d’hydrogène) Sur un groupement = C = 0 (aldéhyde ou cétone ). Agissant sur un groupement CH CH Agissant sur un groupement =CH NH ACCEPTEURS EXEMPLES D’HYDROGENE NAD+ ou le L-malate : NAD-oxydoréductase ; NADP+ : L-lactate : NAD-oxydoréductase. Cytochrome Oxygène NAD+ ou le NADP+ Oxygène Acide lipoïque NAD+ ou le NADP+ Cytochrome Oxygène NAD+ ou le NADP+ L-Lactate : ferricytochrome c-oxydoréductase. -D-glucose : oxygène oydroréductase. D-glycéraldéhyde-3-phosphate : NADoxydoréductase. Xanthine : oxygène oxydoréductase. 4,5-Dihydrouracile : NAD oxydoréductase. 4,5-Dihydro-orotate : oxygène oxydoréductase. L-glutamate : NAD oxydoréductase. 6 EC2: LES TRANSFERASES (TABLEAU 2) Elles transfèrent un groupement fonctionnel d'une molécule à l'autre. On mentionne d'abord la molécule donneuse de radicaux puis l'accepteur. ACTION CATALYTIQUE TYPES DE TRANSFERASES EXEMPLE Transférant un groupement monocarboné (C1): - Méthyl (-CH3) Méthyl transférase -Hydroxyméthyl (-CH20H) Hydroxyméthyl transférases S-adénosyl-méthionine-Lhomocytéine-méthyltransférase. L-sérine- tétrahydrofolate 5,10 hydroxyméthyltransférase Carboxyle (-COO-) Carboxyl transférases Groupement carbonés comportant une fonction aldéhyde ou cétone Carbamyl transférases Acyl transférases (R-C=O) Glycosyl transférases. Hexosyl transférases Pentosyl transférases Alkyl transférases. Transférant des groupements azotés Phosphoryl transférases = Kinases Amino transférases Avec un groupement alcool comme accepteur Avec un groupement carboxylique comme accepteur Avec un groupement azoté comme accepteur Carbamylphosphate-L-aspartate carbamyltransférase Transacylase UDP-glucose -fructose-phosphate glucosyltransférase. Uridine-orthophosphate ribosyltransférase. L-aspartate-Cétoglutarate aminotransférase ATP-D-hexose-6-phosphotransférase. ATP-3-phosphoglycérate 1phosphotransférase. Créatine phosphotransférase ou créatine phosphokinase EC3: LES HYDROLASES (TABLEAU 3) Elles hydrolysent des liaisons chimiques. -Maltose -Glucose ACTIONS CATALYTIQUES Scindant les liaisons esters TYPES D’ENZYMES Carboxylester-hydrolases Phosphodiestérases EXEMPLES Lipase ou glycérol-ester hydrolase. Ribonucléases, désoxyribonucléases, Scindant les liaisons osidiques Scindant les liaisons peptidiques Glucosidases -Aminopeptido-aminoacide hydrolases. -Carboxypeptido-aminoacide hydrolases Peptido-peptide hydrolases (endopeptidases) Glucosidases Aminopeptidases 7 Carboxypeptidase A Trypsine. EC4: LES LYASES (TABLEAU 4) Elles catalysant l’enlèvement d’un groupement, autrement que par hydrolyse, (avec souvent création d’une double liaison) ou au contraire l’addition d’un groupement. Uroconate + NH4+ L-histidine TYPES D’ENZYMES Carboxy-lyases Carboxylases (carboxylases ou décarboxylases) (séparant ou fixant le COO-) Aldéhyde-lyases. C-C lyase CO lyases CN lyases EXEMPLES Aspartate décarboxylase ou L-asparate -4carboxylase. Fructose-bisphosphate aldolase ou fructose 1-6 biphosphate, D-glycéraldéhyde-3phosphate lyase. Déshydratase, anydrase carbonique L-aspartate-ammonium lyase. etc. Ammoniac lyases. EC5: ISOMERASE (TABLEAU 5) Elles réarrangent les groupements fonctionnels d'une molécule pour former des isomères. Alanine racémase D-Alanine ACTIONS CATALYTIQUES Racémases et épimérases Cis-trans isomérases Oxydo-réductases intramoléculaires L-alanine SUBSTRATS CIBLES Agissant sur les aminoacides Agissant sur les oses Catalysant l’interconversion aldosecétose. Transférases intramoléculaires : EXEMPLES Alanine racémase. D-ribulose-5-phosphate -3 -épimérase. 4-Maléyl-acéto-acétate cis-trans isomérase. D-glycéraldéhyse -3- phosphate cétoisomérase ou triose-phosphate isomérase. L-méthylmalonyl- CoA-carbonyl mutase. EC6: LIGASES OU SYNTHETASES (TABLEAU 6) Elles permettant l’union de 2 molécules, couplée avec la rupture d’une liaison à haut potentiel énergétique (par exemple rupture d’une liaison pyrophosphate de l’ATP ou d’un autre nucléosidetriphosphate). ACTIONS CATALYTIQUES TYPES D’ENZYMES EXEMPLES Aminoacyl-TRNA synthétase (ou Alanyl-tRNA synthétase. Formation de liaison CO aminoacide tRNA ligases) Acétyl-coA synthétase. Formation de liaison CS1/2 Acide ammoniac ligases L-glutamate : ammoniac ligase ou Formation de liaison CN. glutamine synthétase Acide-aminoacide ligase. -L-glutamyl-L-cystéine: glycine ligase ou glutathion synthétase. Formation de liaisons CC. etc. 8 CINETIQUE ENZYMATIQUE CLASSIQUE L'étude cinétique des réactions enzymatiques a pour but d'obtenir des informations sur les mécanismes de ces réactions. La cinétique de l'action enzymatique fut d'abord éclaircie par le postulat selon lequel l'enzyme se combine réversiblement avec son substrat pour former un complexe intermédiaire enzyme-substrat. L'isolement des complexes enzyme-substrat en quantité suffisante a permis des études plus poussées de la cinétique enzymatique. 1) Le complexe enzyme-substrat : La spécificité très grande des réactions enzymatiques se traduit par un contact étroit entre l'enzyme et le substrat. En raison de la taille importante de l'enzyme par rapport au substrat, ce contact a lieu au niveau d'une zone privilégiée de l'enzyme appelée centre actif ou site actif. 1.1 Modèle de représentation selon Fischer ENZYME COMPLEXE ENZYMESUBSTRAT SUBSTRAT Figure 1: Modèle clé serrure 1.2 Structure élastique des protéines: l'ajustement induit "induced fut". Figure 2: l'ajustement induit "induced fut". 2) Cinétique enzymatique fondamentale L'étude de la cinétique enzymatique consiste à mesurer la quantité de produit formé au cours du temps à température et pH donnés. k+1 E+S k+2 ES k-1 E+P (1) k-2 2.1 Hypothèse de l'état stationnaire selon Michaelis-Menten. Si on met une petite quantité d'enzyme en présence d'un large excès de substrat, l'évolution au cours du temps est représentée par la figure 3. On distingue 3 phases: phase préstationnaire, phase stationnaire et phase post-stationnaire. 2-1-1- Phases de la réaction Phase pré stationnaire (PPRS) : Pendant cette phase le complexe [ES] se forme, puis commence à donner les premières molécules de produit P. Cette réaction est si rapide (de l’ordre de milliseconde) qu’il est extrêmement difficile de l’étudier sans appareillage spéciale dit de cinétique rapide. Dans cette phase, la concentration de [P] varie peu, on la considère comme pratiquement nulle alors que [ES] ne l’est pas (figure 3). 9 [ S ou P ] PPRS Phase Stationnaire dS dP v = = = Cte dt dt PPOS [P] S1 dS S2 P1 d[ES] = 0 dt dP [S] P2 [ES] t0 t1 t2 Temps en min dt Figure 3 : différentes phases d’une réaction enzymatique, hypothèse de Michaelis. Phases stationnaire (PS) ou de vitesse initiale, Pendant la phase pré stationnaire, [ES] augmente jusqu'à une valeur pour laquelle sa vitesse de formation est exactement équilibrée par sa vitesse de décomposition, on atteint donc, un état stationnaire où d[ES]/dt = 0, et où la quantité de produit formé par unité de temps est constante et la cinétique d’ordre zéro. Durant cette phase, la quantité d’enzyme étant constante et le substrat en large excès, la concentration du complexe ES demeure constante ainsi, par conséquent, que la vitesse de formation du produit. Cette phase se maintient, aussi longtemps, que la concentration du substrat non consommé demeure saturante pour l’enzyme. La vitesse de formation du produit [P], ayant crû en même temps que [ES], devient constante durant la phase stationnaire : c'est la vitesse initiale de la réaction. Phase post-stationnaire (PPOS) : où le substrat n’est plus en excès, sa concentration devient limitante et où la cinétique se rapproche du premier ordre ou d’un ordre supérieur pour les enzymes à plusieurs substrats. Cette étape peut être compliquée, en outre, par l’inhibition de l’enzyme par le produit ainsi que par la réversibilité. L’intérêt de cette phase réside d’ailleurs, non dans sa cinétique, mais dans les valeurs des concentrations en substrat produits à l’équilibre, qu’elle permet de mesurer. 2.1.2 Mesure de la vitesse de la réaction On appelle vitesse de la réaction le rapport moins dS sur dt, qui est égal au rapport dP sur dt. La vitesse de réaction représente le nombre de moles de substrat transformées en moles de produit, dans un volume donné et dans un temps donné (figure 4). 10 [P] formé PS PPOS Figure 4 : Détermination de la vitesse initiale vt v vi t temps Vitesse initiale : Vitesse d’une réaction enzymatique au cours de la phase stationnaire où le rapport : [Enzyme-Substrat]/ [Enzyme] est maximum 2.1.3 Effet de la concentration d’enzyme [P] (mmol/l) Figure 5 : Relation entre concentration en enzyme et vitesse E3 E2 E1 Temps en min Les mesures de la concentration du produit en fonctions du temps sont différentes pour chacune des concentrations de l’enzyme essayées (figure 5). Dans la phase stationnaire, si on double la concentration en enzyme, on observe une vitesse de réaction deux fois plus rapide, et d’une façon générale il y a une relation linéaire entre la concentration en enzyme et la vitesse. Cette relation , qui permet de doser l’enzyme (figure 6) , est à l’origine de la définition de l’unité d’activité enzymatique. Vitesse initiale Figure 6 : Dosage v2 v1 de l’enzyme v3 E1 E2 E3 11 E nmol/l 2.1.4 Effet de la concentration en substrat. Figure 7 : Détermination de la vitesse maximale Ces courbes expérimentales (figure 7) font apparaître les faits suivants: 1) Pendant une période initiale plus ou moins longue, [P] varie linéairement avec le temps: La vitesse v = d[P]/dt est constante. Il s'agit de la vitesse initiale notée v i. 2) Après cette période initiale, les courbes évoluent progressivement vers une valeur constante de [P] correspondant à l'état d'équilibre final de la réaction. Si on détermine les vitesses initiales obtenues à l’aide d’une quantité constante d’enzyme, pour des concentrations croissantes en substrat, on obtient des points situés sur une courbe d’allure hyperbolique (figure 8) qui croît rapidement aux faibles concentrations puis tend vers une asymptote, à laquelle on donne le nom de vitesse maximale. Aux concentrations élevées de substrat, la vitesse devient indépendante de [S]0, la réaction est d'ordre 0. Ce phénomène est lié à une saturation de l'enzyme. v (mmol/min) Figure 8 : Courbe de v =f([S]) Vmax Vitesse maximale Vitesse initiale théorique d’une réaction enzymatique pour une concentration infinie du substrat. Vmax/2 Constante de Michaelis Concentration du substrat pour laquelle la vitesse initiale d’une réaction enzymatique atteint la moitié de la vitesse maximale KM S1 S2 S4 [S] mmol/l Cette allure de courbe, qui se retrouve dans divers phénomènes naturels, a constitué pour V. HENRY le point de départ de l’hypothèse du complexe enzyme substrat. Dans celle-ci on admet que chaque molécule de substrat doit, pour subir la réaction, d’abord se fixer à l’enzyme, puis, après un temps de contact court mais défini, la transformation a lieu et le produit est libéré. La place redevient libre jusqu’à ce qu’une nouvelle molécule de substrat vienne s’y fixer. L’approche du substrat ayant lieu exclusivement par le hasard des chocs moléculaires, la durée probable d’inoccupation du centre actif sera inversement proportionnelle à la concentration. Aux concentrations faibles en substrat ces contacts sont peu fréquents et la réaction globale est lente. 12 k+1 E+S k+2 ES k-1 E+P (1) k-2 La vitesse globale de réaction, qui n’est autre que la vitesse de formation de P à partir de ES est donnée par la relation : dP v = = k+2.[ES] - k-2 [E] [P] (2) dt Au début de la phase stationnaire la concentration de P est négligeable [P] ≈ 0, [EP]<<<[ES], [EP] ≈ 0, V -2 = 0 et on peut simplifier l’équation (1) en (3) : 2.2 Cinétique Michaelienne k+1 E+S k+2 ES E + P (3) k-1 Dans ces conditions, la vitesse globale de réaction devient : dP v = = k+2.[ES] (4) dt Le complexe ES se forme, à chaque instant, par une réaction d’ordre deux, par association de E et S avec une constante de vitesse k+1. A chaque instant ES disparait par deux réactions du premier ordre pour redonner d’une part E et S et d’autre part E et P, respectivement avec des constantes de vitesse de k-1 et k+2. Donc ES varie selon l’équation suivante : d[ES] = k+1 [E].[S] (k-1 + k+2).[ES] (5) dt Selon la relation de conservation, la quantité totale d’enzyme, [ET] se répartit en enzyme libre, [EL] et en enzyme liée, [ES] : [ET] = [EL] + [ES] (6) Pendant la phase stationnaire, la quantité de substrat étant en large excès par rapport au processus enzymatique, elle ne constitue pas le facteur limitant et ES peut être considéré comme constant, dans ces conditions l’équation (5) devient : d[ES] = k+1 [E].[S] (k-1 + k+2).[ES] = 0 dt 13 (7) Si on introduit dans (7) la valeur de EL donné par la relation de conservation (6), il vient : k+1 [ET] [ES] .[S] (k-1 + k+2).[ES] = 0 k+1.[ET]. [S] ou encore : [ES] = k+1.[S] + k-1 + k+2 (8) (9) L’introduction de cette valeur dans l’équation (4) donne : k+2. k+1.[ET]. [S] v = k+1.[S] + k-1 + k+2 (10) Or, on peut considérer que si la totalité de l’enzyme était en permanence sous la forme réellement active ES, la vitesse de réaction atteindrait sa valeur maximale : Vm = k+2.[ET] Il vient dès lors : (11) Vm. k+1. [S] v = k+1.[S] + k-1 + k+2 Vm. [S] en divisant haut et bas par k+1 : v = k-1 + k+2 [S] + k+1 k-1 + k+2 = Km k+1 (14) , il vient : Vm. [S] v = [S] + Km (12) (13) (15) Cette équation dite de Michaelis-Menten-Henri, fournit la vitesse de réaction en fonction de la concentration en substrat et de deux constantes caractéristiques de la réaction considérée, Vm et Km, sa représentation graphique est donnée sur la figure14, ci-dessous 14 2.3 Représentation graphique v Hyperbole de Michaelis-Menten Représentation de Linewevear et Burk 1 v Vm 1 Vm 2 Pente = Km/Vm Vm Km v [S] - 1/Km Représentation d’Eadie-Hofstee. 1/ [S] Représentation selon Hanes [S] v Vm 1/ Vm - Km Km/ Vm Vm Km v [S] - Km [S] Figure 9 : Cinétiques des réactions à un substrat en absence d’inhibiteurs. La constante de Michaelis, Km, qui est indépendante de la concentration en enzyme, peut être comparée à la constante de dissociation KD du complexe ES : Cas particuliers: [S]> 100 Km v=Vm[S]/[S] v= Vm v= Vm[S]/Km [S]<0,01 Km [S] = Km k-1 + k+2 Km = k+1 v=Vm.Km/2Km v= Vm/2 ; V indépendante de [S] Saturation Dépendance linéaire de [S] Substrat limitant Demi-saturation de l'enzyme k-1 KD = k+1 On voit que Km correspondrait à une constante de dissociation du complexe, dans laquelle on tiendrait compte également de sa dissociation selon k+2 pour donner le produit. Km, nommé de ce fait, constante de dissociation apparente ou constante de dissociation dynamique, est numériquement supérieur à KD et est inversement proportionnel à l’affinité de l’enzyme pour son substrat : 15 Tableau 7 : Valeurs de Km de quelques enzymes Enzymes Substrat Maltase Maltose Glycérophosphatase Glycérophophate Tryptophanase Tryptophane Monoamine oxydase Benzylamine Isocitrate déshydrogénase Isocitrate Déshydrogénase hydrofolique Acide folique Km (M) 2.1.10-1 3.10-2 3.3.10-4 3.3.10-5 2.6.10-6 1.2.10-7 3) Effecteurs réversibles de la réaction enzymatique 3.1 Effecteur Corps chimique (molécules ou atomes, minéraux ou organiques) qui par sa liaison avec l’enzyme modifie la vitesse de la réaction enzymatique (sans être un cofacteur indispensable) : * Soit en l’accélérant : Activateur * Soit en la ralentissant : Inhibiteur Parmi ces effecteurs on distingue trois groupes : - Molécules organiques inhibitrices ou activatrices. - Ions métalliques - pH Enzyme, Cofacteurs et coenzymes liées Substrat Produit Ions, Coenzymes, Energie. Activateurs Inhibiteurs Le substrat, l’enzyme, les ions, les coenzymes et l’énergie sont les facteurs indispensables à la réaction enzymatique. Les autres molécules qui entrent en liaison avec l’enzyme, les ligands, peuvent avoir un effet positif ou négatif. Ils peuvent favoriser ou au contraire contrarier le déroulement de la réaction. 4. Inhibitions enzymatiques La compréhension de la cinétique enzymatique est utile pour la détermination du mode d’action de certains inhibiteurs de réaction enzymatique. Le but étant d’éclairer le mode de fixation du substrat normal. Il existe trois types d’inhibition réversibles : l’inhibition compétitive, non compétitive et “incompétitive”. 4.1 Inhibition compétitive. Un inhibiteur compétitif, par sa structure analogue à celle du substrat, peut se fixer sur le site actif et entre donc en compétition avec le substrat pour la fixation sur l’enzyme. 16 Si on augmente la concentration de l’inhibiteur ou du substrat, l’effet de l’un ou l’autre non fixé diminue. Les réactions seront k+1 k+2 E+S ES E + P (3) k-1 k+3 E+I EI (16) k-3 4.1.1 Cinétique de l’inhibition compétitive I étant l’inhibiteur. On suppose que EI ne donne pas d’autres réactions. Soit [I] la concentration en inhibiteur et KI la constante de dissociation du complexe EI. On peut calculer la vitesse de la réaction en supposant que les conditions de l’état stationnaire sont vérifiées c.à.d. k+2 << k-1. Nous avons donc : k-1 [E] [S] Ks = = = Km k+1 [ES] k-3 (17) [E] [I] KI = = k+3 [E I] L’équation de conservation s’écrit : (18) [Et] = [E] + [ES] + [EI] (19) [EI] peut être calculé à partir de l’égalité : Km. [ES] KI. [EI] = [S] (20) [I] Km [ES] [I] [E I] = [S].KI (21) En remplaçant ces concentrations dans l’équation de conservation, on aura : Km.[ES] Km. [ES]. [I] [ET] = + [ES] + [S] [S]. KI (22) Etant donné que v = k+2. [ES], on peut écrire : k+2.[ET] v = Km [I] 1 + 1 + [S] KI (23) 17 Vm [S] v = [I] [S] + Km 1 + KI (24) Cette équation de vitesse a la même forme générale que celle de la réaction non inhibée. v= Vm [S] [S] + K’m avec [I] K’m = Km 1 + KI (25) L’inhibition compétitive modifie le Km. La valeur apparente du Km est alors augmentée. La vitesse de réaction est diminuée car le complexe EI ne donne pas de produit. Le degré d’inhibition dépend des concentrations relatives en substrat et inhibiteur ; et l’inhibition peut être complètement annulée par une forte concentration en substrat. 4.1.2 Exemples d’inhibition compétitive Tableau 8 Exemples d’inhibiteurs compétitifs Enzyme Substrat Km Inhibiteur Alanine déshydrogénase L-alanine D-alanine 1,7. 10-3 Hexokinase D-glucose D-glucosamine 2. 10-2 Succinate déshydrogénase Succinate malonate 1,3. 10-3 KI -2 2. 10 10-3 4.1. 10-5 4.1.3 Représentation graphique en hyperbole Représentation en hyperbole Graphe selon Linewaever et Burk 1/v Vm 1 1 = Km’’ [I2] Km 1+ Ki [I]=0 [I]=1 [I]=2 Vm 2 [I]=2 [I]=1 [I]=0 1/ Vm Km’’ Km Km’ [S] - 1/Km 1/ [S] Figure 10 : Cinétique de l’inhibition compétitive 4.2 Inhibition non compétitive Dans ce cas, on suppose en général que l’inhibiteur ne possède pas une analogie structurale avec le substrat, et se fixe sur un site différent du site de fixation du substrat. La vitesse maximum de la réaction (Vm) est modifiée. 18 L’intérêt de l’utilisation des inhibiteurs non compétitifs est qu’ils peuvent apporter des informations sur une partie de l’enzyme non accessible au substrat. La fixation de [I] provoque la déformation de l’enzyme telle que le fonctionnement de celui-ci est perturbé, et dans ce sens que [I] joue un rôle de régulation dans le métabolisme. On aura les réactions suivantes : k+1 k+2 E+S ES E + P (3) k-1 k+3 E+I EI (16) k-3 k+4 k+5 ES+ I ESI EI +P (26) EI (27) k-4 k+6 EI + S k+7 ESI k -6 4.2.1 Cinétique de l’inhibition non compétitive Dans le calcul de la vitesse, on fera les hypothèses suivantes : a- l’équilibre de Michaelis Menten a lieu. b- k+5 et k+7 sont nuls. k-1 k-6 c- = = Km k+1 k+6 ; k-3 k-4 = = KI k+3 k+4 Nous aurons : v = k+2 [ES] Et (28) (4) (11) Vm = k+2 [ET] L’équation de conservation s’écrit : [Et] = [El] + [ES] + [EI] + [EST] (29) k-1 k-6 [E] [S] [EI] [S] Ks = = = = = Km k+1 k+6 [ES] [ESI] (30) k-3 k-4 [E] [I] [ES] [I] Ks = = = = = KI k+3 k+4 [E I] [ESI] (31) 19 Km [ES] KI [E I] = [S] [I] => Km [ES] [I] [E I] = KI [S] (32) k+2 [ET] k+2 [ET] v = = [I] Km [I] [I] Km 1+ + 1 + 1 + 1 + KI [S] KI KI [S] (33) (34) Vm. [S] v = [I] Km + [S] 1+ KI v= Vm’ [S] [S] + Km avec Vm V’m = [I] 1 + KI (35) 4.2.2 Exemples d’inhibitions non compétitives Tableau 9 : Exemples d’inhibiteurs non compétitifs Enzyme Substrat Km Galactokinase Galactose 7.10-4 Phosphodiestérase AMP cyclique 4.9.10-4 Anhydrase carbonique HCO39.6.10-3 20 Inhibiteur Galactose-1-P Caffeine Acétazolamide KI 1.5.10-2 5.10-2 6.1.10-7 4.2.3 Représentations graphiques Représentation en hyperbole Représentation selon Linewevear et Burk [I2] 1+ 1 Ki = Vm’’ Vm Vm [I]=0 Vm’ [I]=1 [I]=2 Vm’’ [I]=2 [I]=1 Vm/2 Vm’/2 [I]=0 Vm’’/2 1/Vm - 1/Km Km 1/[S] [S] Figure 11 : Cinétique de l’inhibition non compétitive 4.3 Inhibition anti (ou un) compétitive (équation) Dans ce type d’inhibition, l’inhibition ne se fixe pas à l’enzyme libre, mais seulement au complexe de Michaelis préformé k+4 ESI k+3 k-3 E + I+P (37) I k+1 E + S I k+2 ES E+P k-1 4.3.1 Cinétique de l’inhibition incompétitive k-1 [E] [S] = = Km ; k+1 [ES] k-3 [ES] [I] = = KI k+3 [ESI] 21 (38) [ET]=[EL]+[ES]+[ESI] L’équation de conservation s’écrit (39) Km. [ES] [ES] [I] [ES] = [ET] - - [S] KI (40) Etant donné que : v = k+2.[ES] ; et que Vm = k+2.[ET] 4.3.2 Représentations graphiques Graphe en hyperbole v Vm Graphe selon Linewevear et Burk 1 1 [I2] = 1+ Vm’’ Vm KI [I]=0 Vm’ 1/v [I]=1 Vm’’ [I]=2 [I]=1 1 1 [I2] = 1+ Km’’ Km KI [I]=2 Vm/2 Vm’/2 [I]=0 Vm’’/2 1/Vm Km’’ Km Km’ [S] -1/Km’ -1/Km Figure 12: Cinétique de l’inhibition incompétitive 22 1/[S] 4.4 Cas particulier : inhibition par excès de substrat Représentation graphique v=f([S]) Représentation graphique 1/v=f(1/[S]) 1/v 1/[S] [S] Figure 13 : Cinétique de l’inhibition par excès de substrat. 4.5 Rôles biologique de l’inhibition Le rôle métabolique des effecteurs enzymatique est considérable, qu’ils soient positif (activateurs) ou négatifs (inhibiteurs), ils sont mis à profit par la cellule pour réaliser la régulation de ses réactions et assurer l’équilibre d’activité et la meilleur économie de ses diverses voies métaboliques. Leur étude appartient d’ailleurs à la biochimie du métabolisme. Ainsi de nombreux enzymes de la glycolyse, dont le rôle essentiel est de fournir l’ATP, sont inhibés non compétitivement par l’ATP et sont au contraire activés par l’AMP. De même dans les voies de biosynthèse des acides aminés ou des nucléotides, on assiste à l’inhibition de l’enzyme de l’un des premiers stades par le produit final. Ainsi, Umbarger a étudié (1956) la biosynthèse de l’isoleucine par les microorganismes, où l’acide aspartique en 5 stades conduit à la thréonine, laquelle en 5 stades également conduit à l’isoleucine. Celle-ci est un inhibiteur de la thréonine désaminase. Asp Thr Ile 23 4.6 Tableau (10) comparatif des paramètres cinétiques pour différents types d’inhibition Type Vitesse Constante de Constante Coordonnées des droites de Linewevear et Burk d’ inhibition maximale Michaelis d’inhibition Ordonnée à Abscisse à Pente l’origine l’origine Aucun 1 - 1 Km Vm Km Vm Km Vm Compétitive [I] [I] -1 -1 1 [I] K’m = Km 1+ KI= = Km Vm 1 + KI Km’ K’m [I] Vm KI Vm -1 Km 1+ Km Km [I] Non Vm [I] K = Km [I] I compétitive Vm’ = 1 + Km Vm - 1 1 + 1 KI [I] -1 Vm KI 1 + = Vm’ Km KI Vm’ Vm Incompétitive Vm Km Vm’ = Km’ = [I] [I] 1 + 1 + KI KI [I] KI= Km -1 1 1 [I] Km’ = 1 + [I] V ’ Vm KI KI= m Vm -1 Vm’ 24 -1 -1 [I] = 1 + Km’ Km KI Km Vm 4.7. Tableau (11) Tableau comparatif des différentes représentations cinétiques pour différents types d’inhibitions Sans inhibition Inhibition compétitive v Inhibition non compétitive Inhibition incompétitive Vm Vm Vm’’ V Vm Vm’ Vm’’ Vm Vm [I]=0 [I]=1 [I]=2 V=f([S]) Vm 2 Vm/2 [I]=0 [I]=1 [I]=0 [I]=1 [I]=2 Vm/2 Vm’/2 Vm’’/2 [I]=2 Vm/2 Vm’/2 Vm’’/2 Km’’ Km’’ Km 1/v 1 1 =f v [S] 1/Vm [S] Km Km’ [S] 1 1 = Km’’ [I2] Km 1+ Ki Km 1/v [I]=2 [I]=1 [S] [I]=2 [I2] 1+ 1 Ki = Vm’’ Vm [I]=1 Km Km’ 1 1 [I2] = 1+ Vm’’ Vm KI [S] [I]=2 [I]=1 [I]=0 [I]=0 [I]=0 -1/Km 1/[S] -1/Km 1/v 1/[S] [S]=1 -1/Km 1/v 1/[S] 1/v [S]=1 [S]=2 [S]=3 [S]=2 [S]=3 1/[S] [S]=1 [S]=2 1 [S]=3 =f [I] 1/Vm v -KI [I] - KI 25 [I] [I] 5) Influence du pH sur l'activité enzymatique L'activité enzymatique dépend fortement du pH et pour la plupart des enzymes, on distingue une zone étroite de pH dite pH optimum où la vitesse de réaction est la plus grand, de part et d'autre de la quelle la vitesse décroît notablement. La figure 14 montre que certaines enzymes sont peu influencées par les variations de pH. C'est le cas de l'amylase salivaire. D'autres agissent seulement dans une zone étroite de pH: la pepsine a pour maximum le pH 2,5 et la trypsine a pour maximum le pH 8. Les phosphatases plasmatiques se répartissent en phosphatases alcalines dont le pH optimal est situé entre 7,5 et 8,5 et phosphatases acides dont le pH est de l'ordre de 4. Figure 14: Influence du pH sur l'activité de diverses enzymes. In vivo, les milieux biologiques sont toujours tamponnés: les pH physiologiques varient peu. In vitro, lorsqu'on étudie une activité enzymatique, il est indispensable de travailler dans un milieu tamponné pour que le pH soit fixé du début jusqu'à la fin de l'expérience. L'effet du pH sur l'activité enzymatique est dû à trois actions indépendantes: Un effet sur l'état d'ionisation du substrat s'il possède des groupes polaires (acides faibles, bases faibles, acides aminés, peptides, protéines). Un effet de dégradation irréversibles des pH extrêmes de l'enzyme, comportant, soit la dénaturation, qui par rupture des liaisons non covalentes, modifie la structure spatiale de l'enzyme, soit la rupture des liaisons covalentes. Cet effet qui s'explique par la variation de la charge globale de la molécule entraîne l'effondrement de la structure tridimensionnelle et la perte d'activité. Enfin un effet sur l'état d'ionisation de l'enzyme Le pH modifie le degrés d'ionisation des chaînes latérales des résidus d'acides aminés, en particulier au niveau du site actif, d'où un modification des liaisons H ou des forces de Van der Waals l'unissant au substrat. par exemple, la structure active de la trypsine et de la chymotrypsine met en jeu une interaction électrostatique: [COO-...NH3+] entre un groupement carboxylique et le groupement aminé de l'isoleucine N-terminal. La protonation du carboxyle ou la déprotonation du groupe amine supprime cette interaction. Il s'ensuit une transition structurale dans la zone d'ionisation de chacun de ses groupes et probablement une orientation défavorables des groupes catalytiques. 26 TRAVAUX DIRIGES D'ENZYMOLOGIE A/ CINETIQUE DES REACTIONS CHIMIQUES : Exercice 1 : Soit la réaction du premier ordre : A P -3 Au temps t = 0, [A0] = 10 M. Au temps t = 5 s, [A] = 1,2. 10-4 M. 1) Calculer la constante de vitesse (k) de la réaction. 2) Calculer [A] au temps t = 12 s. Exercice 2 : La mutarotation du -D-glucose a été étudiée, dans l'eau et à 20°C, sur une solution à 30g/litre. On a mesuré le pouvoir rotatoire de la solution, dans un tube de 10 cm de longueur, à différents temps. Temps en min Pouvoir rotatoire en degrés x 100 10 +90,8 20 +106,3 30 +119,7 45 +136,5 60 +150 90 +169,6 120 +182,3 180 +195,8 240 +201,5 360 +203,8 420 +205,5 600 +205,5 1) Ecrire la réaction 2) Déterminer l'ordre de la réaction et la constante de vitesse correspondante. 3) Quel est le pouvoir rotatoire spécifique de la forme b du glucose (le pouvoir rotatoire spécifique est le pouvoir rotatoire d'une solution à 1 g/ml, lorsqu'on le mesure sur 1 dm)? 4) Sachant que le pouvoir rotatoire de l'-D-glucose est 112,2°, déterminer à l'équilibre, les proportions relatives des anomères et Déterminer les constantes de vitesse individuelle correspondant à la transformation d'une forme anomérique en l'autre. B) CINETIQUE ENZYMATIQUE A UN SUBSTRAT. Exercice 3 : La Lactate déshydrogénase de foie de pigeon catalyse la réduction du pyruvate en lactate. La réaction globale peut s'écrire : Pyruvate + NADPH + H+ = L- Lactate + NADP+ Cette réaction est suivie par la variation de l'absorbance à 340 nm qui correspond à l'oxydation du NADPH. On a mesuré les vitesses de la réaction, exprimées en mUnités, à différentes concentrations de pyruvate. Pyruvate (mM) Vitesse (mUnités) 1,5 4 2,5 6 3,5 7,5 6 10,5 12 14 Déterminer la vitesse maximale de la réaction et le Km du pyruvate. Exercice 4 : On teste une enzyme avec un seul substrat Km = 2.10-4 M en présence de [S] = 2.10-4 M et d'un inhibiteur compétitif [I] = 2,5. 10-3 M. La Vmax de la réaction non inhibée est 55 µmol/l/min. 27 720 +205,5 Calculer la vitesse initiale en présence de l'inhibiteur compétitif. Que faut il faire pour réduire l'effet de l'inhibiteur? Exercice 5 : Calculer Ki pour un inhibiteur compétitif dans les conditions suivantes Km = 6,7.10-4M sans inhibiteur et Vmax = 300 µmol/l/min sachant que quand I = 10-5 M et S = 2.10-5M, Vi = 1,5 µmol/l/min Exercice 6 : Une réaction enzymatique inhibée par un inhibiteur non compétitif dans les conditions suivantes: [S] = 3,5.10-5M, Km = 2.10-4M, [I] = 4.10-5M, Ki = 2.10-5M, donne une vitesse = 295µmol/l/mi quand [I] = 0 et [S] = 0,03M. Calculer Vi dans les conditions donné et le degrés d'inhibition. Exercice 7 : L'hydrolyse de l'ortho-nitrophényl galactoside par la -galactosidase entraîne la libération d'0-nitrophénol, dont on suit l'apparition à 373 nm, point isobestique des formes protonée et déprotonée de l'0-nitrophénol. On mesure, à différentes concentrations de substrat, les vitesses initiales, exprimées en variation d'absorbance par minute. Molaire du substrat = 350 M-1 cm-1 Molaire du produit = 2400 M-1 cm-1 Substrat (mM) Vitesse DO/min 0,138 0,148 0,220 0,171 0,291 0,234 0,560 0,324 0,766 0,390 1,46 0,493 Déterminer VM (en M/mn) et Km. Exercice 8 : L'hydrolyse enzymatique d'un substrat S est inhibée par une substance A. Dans un premier temps, on détermine VM et Km en suivant l'augmentation de l'absorbance à 420 nm (le coefficient d'extinction molaire du produit étant 3150 M-1. cm-1). On a porté dans ce tableau l'absorbance x 100 obtenu à un temps donné et pour une concentration donnée en substrat : Concentration en substrat : [S] x 104 M 8,13 5,7 4,9 4,1 3,25 2,44 1 5,9 5 4,5 4,2 3,8 3 2 11,9 10 9 8,5 7,8 6,1 3 18 15 13,3 12,6 11,5 9,2 4 24 20 17,5 16,5 14,7 11,8 5 30 24,5 22 20 18 14,2 6 36 29 26 23 Puis on mesure les vitesses initiales (exprimées en 10-6 M/mn) de l'hydrolyse de S en présence de A (5.10-3 M). [S] x 10-4 M 2,5 5 7,5 10 Vitesse x 10-6 M/min 3,5 5,5 6,7 7,5 t (min) 1) Déterminer le type d'inhibition et le KI. 28 2) Si 4 µg d'enzyme de PM = 300 000 Dalton sont utilisés dans l'étude cinétique de volume réactionnel = 1 ml, quelle sera la valeur de l'activité spécifique moléculaire. Exercice 9 : L'activité de la malonyl transacylase est inhibée par l'acétyl-coenzyme A, Le tableau suivant donne les vitesses de la réaction (exprimées en unités arbitraires) à différentes concentrations de malonyl-coenzyme A, en présence ou en absence d'acétyl-coenzyme A. [Malonyl-CoA] mM [Acétyl CoA mM] 8,5 17 25 0 0,25 0,4 0,5 225 0,1 0,19 0,25 450 0,065 0,12 0,17 Déterminer le type d'inhibition et le K1 correspondant. 40 0,61 0,35 0,245 60 0,7 0,45 - 100 0,8 05,75 0,45 Exercice 10 : L'hydrolyse du méthyl-hippurate par la chymotrypsine est inhibée réversiblement par l'acide 2-phényl-éthane-boronique (APEB). Pour déterminer la nature de l'inhibition, on a mesuré les vitesses initiales d'hydrolyse du méthyl-hippurate, à différentes concentrations, en présence et en absence d'inhibiteur. Les vitesses données dans le tableau suivant sont exprimées en unités arbitraires : [S] en mM 1 1,25 1,66 3 8 Experience A ([APEB] = 0 mM) 0,312 0,36 0,43 0,58 0,78 Experience B ([APEB] = 0,019 mM) 0,25 0,29 0,35 0,5 0,72 Experience C ([APEB] = 0,033 mM) 0,215 0,255 0,312 0,45 0,69 Experience D ([APEB] = 0,1 mM) 0,13 0,16 0,2 0,312 0,55 Déterminer le type d'inhibition et le KI de l'acide 2-phényl-éthane-boronique. Exercice 11 : La glucose-oxydase d'Aspergillus niger, qui catalyse l'oxydation du glucose par l'oxygène moléculaire pour donner la glucono--lactone et H2O2, est inhibée par le D-glucal. Dans une première série d'expériences, on a maintenu constante la concentration d'oxygène (0,27 mM), et on a fait varier la concentration de glucose. Les vitesses initiales en moles.s-1, ont été divisées par la concentration d'enzyme; le tableau suivant donne v / [E totale], en 10-5 s-1. [Glucose] en mM Expérience A ([D-glucal] = 0 mM) Vitesse de Expérience B ([D-glucal] = 0,079 mM) réaction Expérience C ([D-glucal] = 0,113 mM) 5 6,6 4,4 4 10 11 7,8 7 20 16,5 12,6 11,5 40 22 18,3 17 80 26 23,5 22,5 Dans une deuxième série d'expériences, la concentration de glucose a été maintenue constante (20 mM), et on a travaillé à différentes concentrations d'oxygène: Expérience A : en absence d'inhibiteur. Expérience B : (D-glucal) = 0,11 mM Les vitesses du tableau sont exprimées dans les mêmes unités que précédemment: [Oxygène] en mM 0,075 0,1 0,135 0,15 0,20 0,25 Vitesse de Expérience A ([D-glucal] = 0 mM) 6,8 8 9,4 10 11,2 12,2 reaction Expérience B ([D-glucal] = 0,11 mM) 5 5,6 6,2 6,45 7 7,3 1) Déterminer quel est le type d'inhibition du D-glucal par rapport au glucose et à l'oxygène et les KI correspondants. 29
