Le complexe de régulation de l`homéostasie du Cholestérol

Logez Christel
Delbos Lila
Le complexe de
régulation de
l’homéostasie du
Cholestérol
Master EGPR 7
1
Sommaire
RESUME................................................................................................................................... 3
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 4
I. INTRODUCTION : .............................................................................................................. 5
1) Bref historique de la découverte du système de régulation de l’homéostasie du
cholestérol : ............................................................................................................................ 6
2) Présentation des protéines impliquées dans le complexe : ................................................ 7
3) Mécanisme du complexe de régulation du Cholestérol : ................................................... 8
II. RESULTATS :..................................................................................................................... 9
1) Le 25-HC et le Cholestérol induisent tous deux la formation du complexe SCAP/Insig.. 9
2) Le 25-HC n’induit pas de changement de conformation de SCAP et l’inhibition du
clivage de SREBP est dépendante de Insig-1....................................................................... 10
3) Le 25-HC n’interagit pas directement avec SCAP : ........................................................ 11
4) Découverte d’une nouvelle protéine interagissant avec les protéines SCAP et Insig :
PGRMC1 :............................................................................................................................ 12
III. PROJET DE RECHERCHE :........................................................................................ 14
1) Présentation de PGRMC1 : .............................................................................................. 14
2) Modèle d’étude ................................................................................................................ 15
3) PGRMC1 intervient-elle dans l’inhibition du clivage de SREBP ? ................................ 15
A. Transfection stable des cellules COS7 : ...................................................................... 16
B. Extinction de PGRMC1 : ............................................................................................. 16
C. Expérience :................................................................................................................. 16
4) Le 25-HC interagit-il directement avec PGRMC1 ?........................................................ 18
A. Production du photo-25-HC radioactif : ..................................................................... 18
B. Expérience : ................................................................................................................. 18
5) Y a t-il formation d’un complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig ? .................... 19
IV. CONCLUSIONS :............................................................................................................ 21
RÉFÉRENCES :..................................................................................................................... 23
ANNEXE ................................................................................................................................. 25
2
Résumé
La concentration en cholestérol, constituant majeur des membranes lipidiques et
précurseur de nombreuses hormones stéroïdiennes doit être régulée car une trop forte
concentration en cholestérol peut conduire à la mort cellulaire ou à une athérosclérose. La
synthèse de cholestérol est autorégulée grâce à un contrôle en feedback faisant intervenir un
complexe constitué des protéines SREBP, SCAP et Insig. La fixation du cholestérol sur
SCAP induit la formation d’un complexe SREBP/SCAP/Insig retenu dans la membrane du
RE qui empêche SREBP de jouer son rôle d’activateur de la transcription des gènes impliqués
dans la synthèse du cholestérol en inhibant son clivage.
Le 25-Hydroxycholestérol peut également inhiber le clivage de SREBP en induisant la
formation du complexe SCAP/Insig mais sans interagir directement avec SCAP. Ceci suggère
qu’une protéine non identifiée activée par le 25-HC induirait la formation du complexe
SCAP/Insig pour inhiber le clivage de SREBP. Une récente étude, qui a mis en évidence que
la protéine PGRMC1 interagit directement avec SCAP et Insig, soulève l’hypothèse selon
laquelle PGRMC1 pourrait être cette protéine. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a été
réalisée pour déterminer le rôle de PGRMC1 dans le mécanisme de régulation de
l’homéostasie du cholestérol par la voie du 25-HC. C’est pourquoi nous nous sommes
intéressées à cette protéine et avons élaboré un projet de recherche, faisant intervenir des
expériences de photo-pontage et de siRNA, dans le but de vérifier l’intervention de PGRMC1
et de comprendre son rôle potentiel dans ce mécanisme de régulation.
3
Liste des abréviations
25-HC : 25-Hydroxycholestérol
HA : Hémaglutinine
HSV : Herpès Simplex Virus
INSIG : Insulin Induced Gene
PGRMC1 : Progesterone Receptor Membrane Component 1
RE : Réticulum Endoplasmique
S1P : Sérine Protéase 1
S2P : Sérine Protéase 2
SCAP : SREBP Cleavage Activating Protein
SDS : Sodium Dodecyl Sufate
PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
SRE : Sterol Regulatory Element
SREBP : Sterol Regulatory Element Binding Protein
4
I. Introduction :
Le cholestérol est une molécule essentielle chez les eucaryotes supérieurs. En effet il est
l’un des constituants majeurs des membranes lipidiques et a pour fonction de diminuer la
perméabilité membranaire et d’augmenter la fluidité membranaire. De plus, le cholestérol est
le précurseur métabolique des hormones stéroïdiennes comme la progestérone et dans le foie,
le cholestérol est le précurseur de l’acide glycocholique, un composant majeur de la bile. Les
oxystérols, issus du métabolisme du cholestérol, interviennent également en tant que
régulateurs de nombreuses voies métaboliques. Les besoins quotidiens en cholestérol d’un
adultes sont d’environ un gramme et demi, et le corps trouve cet approvisionnement pour un
tiers dans l’alimentation et les deux tiers restants sont synthétisés dans le foie.
Cependant il est nécessaire pour les cellules de réguler leur concentration en cholestérol
afin de maintenir un taux physiologique n’excédant pas deux grammes de cholestérol par
millilitre de sang. En effet une trop forte concentration en cholestérol peut détruire les
fonctions des membranes cellulaires et l’accumulation de cholestérol peut conduire à la mort
cellulaire ou à une athérosclérose.
De ce fait, au cours de l’évolution les eucaryotes supérieurs ont acquis un mécanisme
qui permet de réguler cette concentration.
Ce mécanisme fait intervenir un système
de régulation en feedback qui contrôle le
niveau de cholestérol dans les membranes
cellulaires et module la transcription des
gènes codant les enzymes HMGCoA
synthase, la HMGCoA réductase,… . En
effet, ces enzymes interviennent dans la
biosynthèse du cholestérol à partir de
l’acétyl-CoA au niveau du cytosol pour la
HMG-CoA synthase et au niveau du RE
pour la HMG-CoA réductase. (figure1).
Figure1 :
Voie de biosynthèse du cholestérol.
Enzymes, substrats produits, inhibiteurs des
enzymes.
(www.answers.com/topic/cholesterol)
5
La compréhension de ce système de régulation s’est faite pas à pas sur près de quarante
ans, à travers les travaux de nombreuses équipes de recherche .
1) Bref historique de la découverte du système de régulation de l’homéostasie du
cholestérol :
Au cours des dernières
décennies de nombreuses études
sur le rôle, les fonctions et la
régulation du cholestérol ont
permis de mettre en évidence le
complexe
de
régulation
du
cholestérol et d’en comprendre
le fonctionnement. En 1967, les
travaux de Chesterton (1) ont
montré que le cholestérol et ses
intermédiaires métaboliques sont
localisés dans le RE.
Puis en
1988 J.B. Smith et al. (2) ont
découvert une séquence notée
SRE (Sterol Regulatory Element)
Figure 2 : Chronologie de la découverte du complexe de régulation du
cholestérol.
présente dans les promoteurs des gènes codant la HMG CoA synthase et la HMG CoA
réductase. Cette séquence intervient dans la régulation de la transcription de ces gènes. En
effet, si cette séquence subis des mutations on n’observe plus d’augmentation de la
transcription de ces gènes en réponse à une carence en cholestérol. Ensuite, en 1992, les
travaux de H. Stark et al. (3) ont mis en évidence l’existence d’un facteur SREBF pouvant se
fixer sur cette séquence SRE. Puis en 1993 Yokoyama C. et al.(4) ont isolé et caractérisé une
protéine qui avait la capacité de fixer cette séquence SRE, ils ont ainsi déterminé que cette
protéine possédait un domaine facteur de transcription de type Hélice-Boucle-Hélice et
induisait l’expression de la HMG-CoA synthase. Ils ont alors rebaptisé cette protéine
SREBP-1. Les travaux de Yang J. et ses collaborateurs dans Gene Development en 1994 ont
mis en évidence le clivage de la partie N-terminale de SREBP correspondant au facteur de
transcription. Ces travaux ont ensuite été complétés en 1995 par ceux de Wang X. et son
équipe (5) qui ont isolé et caractérisé la protéase responsable du clivage de SREBP-1 au
6
niveau de la boucle intraluminale. Hua X. et Al. en 1995 (6) ont ensuite démonté que ce
premier clivage était suivi d’une seconde protéolyse de SREBP. En 1996, les études de X.
Hua et al. sur des cellules CHO dont le clivage de SREBP n’était pas inhibé par une forte
concentration en stérol, ont permis de mettre en évidence l’existence d’une protéine qui
activerait le processus de clivage de SREBP. Ils ont alors nommé cette protéine SCAP
(SREBP Cleavage Activating Protein). Puis en 1997, R.B. Rawson (7) identifia la seconde
protéase S2P responsable du clivage de SREBP au niveau du premier segment
transmembranaire de SREBP. Au cour de la même année, l’équipe de Juro Sakai (8) mit en
évidence l’interaction entre SCAP et SREBP. Trois ans après, en 2000, les travaux de Yang T.
(9) ont soulevé l’hypothèse qu’une protéine du RE intervenait pour retenir SREBP dans ce
compartiment en condition de forte concentration en cholestérol. Par la suite, en 2002, la
même équipe (10) identifia cette protéine séquestrant SREBP dans le RE comme étant la
protéine Insig (une protéine résidante de la membrane du RE). En 2004, les travaux de Adams
C.M. (11) mirent en évidence une voie alternative induite par le 25-HC, permettant de réguler
le processus de clivage de SREBP.
2) Présentation des protéines impliquées dans le complexe : (12-15)
SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein) est une protéine
ancrée dans la membrane du RE. L’extrémité N-terminale de SREBP est un
facteur de transcription de type hélice-boucle-hélice-leucine zipper (bHLH).
L’extrémité C-terminale est un domaine régulateur. Ces deux domaines sont
Figure 3: Schéma
SREBP
www.erudit.org
cytosoliques et reliés par deux segments transmembranaires et une boucle
intra-luminale.(Figure 3)
SCAP (SREBP Cleavage Activating Protein) est également une protéine
membranaire
du
RE.
Elle
est
composée
de
huit
segments
transmembranaires. L’extrémité C-terminale contient cinq répétitions des
acides aminés Tryptophane et Aspartate (WD). Les domaines WD sont
Figure 4 : Schéma
de SCAP
www.erudit.org
souvent impliqués dans les interactions protéines-protéines. Les extrémités
N-terminale et C-terminale sont toutes deux cytosoliques. (Figure 4)
INSIG (Insulin induced gene) est, elle aussi, une protéine membranaire du
RE. Elle est composée de cinq domaines transmembranaires. (Figure 5)
Figure 5 : Schéma
de Insig-1
www.erudit.org
7
3) Mécanisme du complexe de régulation du Cholestérol : (12-15)
Quand
le
taux
de
cholestérol est faible, la protéine
SREBP se lie à l’extrémité Nterminale de SCAP par son
domaine
régulateur.
SCAP
escorte alors SREBP du RE
jusqu’au Golgi par un transport
vésiculaire. Une fois dans la
membrane du Golgi, SREBP va
subir un clivage enzymatique par
deux protéases. La première S1P
clive SREBP au niveau de la
boucle intraluminale. Lorsque
SREBP est clivée en deux, la
Figure 6 : Mécanisme du complexe de régulation en feed-back du
Cholestérol faisant intervenir les protéines SCAP et SREBP pour
l’activation de la transcription des gènes impliqués dans la synthèse
du cholestérol et Insig pour l’inhibition de la transcription de ces
gènes. Copyright 2004. The University of Texas Southwestern
Medical Center at Dallas. Brown/ Goldstein Lab.
deuxième protéase S2P peut agir.
Elle clive la partie N-terminale de SREBP au niveau du domaine transmembranaire.
L’extrémité N-terminale qui est un facteur de transcription est alors libérée et migre jusqu’au
noyau grâce aux Importines β. Ce facteur de transcription reconnaît les séquences SRE (Sterol
Regulatory Element) présentes dans les promoteurs des gènes codant pour des enzymes
impliquées dans la synthèse du cholestérol. Cette séquence est composée de 10 nucléotides
avec 1 ou 2 répétitions CAC mais la séquence consensus n’est pas clairement définie. La
fixation de l’extrémité N-terminale de SREBP sur une séquence SRE active la transcription
des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de cholestérol.
Par contre lorsque le taux de cholestérol est élevé, celui-ci se fixe sur SCAP . Cette
fixation induit un changement de conformation de SCAP permettant à la protéine Insig de se
fixer sur SCAP. Insig va retenir le complexe SCAP/ SREBP dans la membrane du RE. Il y a
donc inhibition du transport de SREBP jusqu’au Golgi, du clivage de SREBP par les
protéases, de la libération du facteur de transcription et de l’activation des gènes impliqués
dans la biosynthèse du cholestérol.
8
II. Résultats :
Il existe d’autres inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol, notamment le 25Hydroxycholestérol. (Figure 7)
Figure 7: Le 25-Hydroxycholestérol est synthétisé à partir du cholestérol par l’enzyme
cholestérol 25-hydroxylase et il est le précurseur des acides biliaires.
Le 25-Hydroxycholestérol est synthétisé à partir du cholestérol par l’enzyme cholestérol 25hydroxylase dans le RE et le Golgi. Il est le précurseur des acides biliaires. Longtemps utilisé
comme inhibiteur de la synthèse du cholestérol, ce n’est que récemment qu’il a été démontré
que c’est un inhibiteur du clivage de SREBP (16).
Une autre équipe s’est intéressé au 25-Hydroxycholestérol. Ils ont notamment cherché
à voir si le cholestérol et le 25-HC utilisent le même mécanisme pour inhiber l’activation de
SREBP. (17). Pour cela ils ont mis en place plusieurs expériences.
1) Le 25-HC et le Cholestérol induisent tous deux la formation du complexe SCAP/Insig.
Des cellules SDR-13 (cellules CHO SCAP déficientes) ont été transfectées avec Insig
et SREBP en présence ou en absence de SCAP. Elles ont été incubées avec du cholestérol ou
du 25-HC. Les extraits cellulaires sont soumis à une électrophorèse en condition native afin
de visualiser les complexes protéiques. Les protéines sont transférées sur membrane et
soumises à un immunoblot avec un anticorps anti-Myc dirigé contre Insig-Myc. (figure 8).
Figure 8 : Des cellules SDR-13A déficientes en SCAP
sont transfectées avec 0,05µg de plasmide pCMV-Insig-1Myc et 2µg de plasmide TK-HSV-SREBP-2 en présence
ou absence de 1,25µg de plasmide pCMV-SCAP, comme
c’est indiqué. Les cellules sont incubées en présence ou en
absence de 25µM de cholestérol ou 2,5µM de 25-HC. Des
aliquots de suspension membranaire de ces cellules, sont
mélangés au bleu de Coomassie G250 (qui charge
négativement les protéines sans les dénaturer) et sont
soumis à un gel natif. Les protéines sont transférées sur
membrane et soumises à un immunoblot avec un anticorps
anti-Myc dirigé contre Insig-Myc.
9
Dans les cellules CHO sauvages en présence de 25-HC et de cholestérol on observe la
présence d’un complexe SCAP/Insig. Ce complexe n’est pas observé en absence de 25-HC et
de cholestérol ou en absence de SCAP.
Ceci montre que le cholestérol et le 25-HC sont tous deux capables d’induire la formation du
complexe SCAP/Insig.
2) Le 25-HC n’induit pas de changement de conformation de SCAP et l’inhibition du
clivage de SREBP est dépendante de Insig-1.
Des cellules SCAP-déficientes ont été transfectées avec SCAP et SREBP en absence
ou en présence de Insig-1 puis incubées avec du cholestérol ou du 25-HC. Les fractions
nucléaires ont été analysées par immunoblot avec un Anticorps anti-SREBP. La conformation
de SCAP a été analysées par digestion à la trypsine des membranes du RE et par immunoblot
avec un anticorps anti-SCAP. En effet, lorsque SCAP est soumise à une digestion par la
Trypsine, on obtient un fragment de 37kDa alors que lorsque SCAP subit un changement de
conformation l’arginine 503, qui été masquée, est alors exposée et le clivage par la trypsine
donne un produit de 35kDa.
Figure 9 : Des cellules SDR-13A déficientes en SCAP sont transfectées
avec 1,25µg de plasmide pCMV-SCAP et 2µg de plasmide TK-HSVSREBP en présence ou absence de 0,6µg de pCMV-Insig-Myc. Les
cellules sont incubées en présence ou en absence de 50µM de
cholestérol ou de 25-HC. Les cellules sont lavées et on sépare les
fractions membranaire et nucléaire. La fraction nucléaire est analysée
par immunoblot avec un anticorps anti-HSV pour détecter l’extrémité
N-terminale clivée de SREBP fusionnée à HSV. La suspension
membranaire est traitée avec 2µg de trypsine (30°C 30mn) et analysée
par immunoblot avec un anticorps anti-SCAP.
Comme le montre la figure 9, en absence de Insig on détecte la présence de SREBP
dans le noyau alors qu’en présence de Insig et de 25-HC ou de cholestérol on ne détecte plus
la présence de SREBP dans le noyau. Ceci montre que le 25-HC et le cholestérol inhibent le
clivage de SREBP dépendamment de la présence de Insig.
D’autre part, en présence de cholestérol on observe un fragment de SCAP à 35kDa qui
montre que le cholestérol a induit un changement de conformation de SCAP, alors qu’en
présence de 25-HC on observe un fragment de SCAP à 37kDa qui montre que le 25-HC n’a
pas induit de changement de conformation de SCAP. Ainsi, on conclue que le 25-HC n’induit
pas de changement de conformation de SCAP contrairement au cholestérol.
10
3) Le 25-HC n’interagit pas directement avec SCAP :
Des cellules SDR-13 SCAP-déficientes ont été
transfectées avec SREBP et Insig en présence ou
absence de HSV-SCAP. Elles ont été incubées avec du
cholestérol, du photo-cholestérol (Figure 10) ou du
Figure 10 : structure du photo-cholestérol
avant et après activation par les UV. (31)
photo-25-HC. Puis elles ont été irradiées ou non aux
UV. La fraction membranaire a été soumise à une
digestion par la Chymotrypsine puis analysée par immunoblot avec un anticorps anti-HSV.
Figure 11 : Des cellules SDR-13A déficientes
en SCAP sont transfectées ou non avec 1,25µg
de plasmide TK-HSV-SCAP. Les cellules sont
incubées avec du cholestérol, du photocholestérol ou du photo-25-HC. Elles sont
irradiées ou non aux UV pendant 20mn. La
suspension membranaire est incubée avec la
chymotrypsine, puis analysée par immunoblot
avec un anticorps anti-HSV pour détecter
SCAP.
On observe normalement un produit de digestion de 10kDa correspondant à
l’extrémité N-terminale de SCAP couplée à HSV. En présence de SCAP, l’addition de photocholestérol provoque un retard de migration sur gel de ce fragment (ligne 7 figure 11). Ce
changement ne survient qu’après une irradiation aux UV et n’est pas observé avec le
cholestérol ou le 25-HC. Ceci indique que le photo-cholestérol est ponté à l’extrémité Nterminale SCAP mais pas le photo-25-HC. On en déduit donc que le 25-HC n’interagit pas
directement avec SCAP contrairement au cholestérol.
Ces travaux ont permis de démonter que le 25-HC, comme le cholestérol inhibe le
clivage de SREBP dépendamment de Insig et induit la formation du complexe SCAP/Insig.
Cependant il n’interagit pas directement avec SCAP et n’induit de changement de
conformation de SCAP.
Cette étude a conduit à émettre l’hypothèse que le 25-HC interagirait avec une autre protéine
non identifiée dont l’activation induirait la formation du complexe SCAP/Insig pour inhiber le
clivage de SREBP.
11
4) Découverte d’une nouvelle protéine interagissant avec les protéines SCAP et Insig :
PGRMC1 :
En 2005, M. Suchanek et Al.(18) ont utilisé PGRMC1 et le complexe de régulation du
cholestérol comme exemple pour démontrer l’efficacité d’une nouvelle méthode de
photopontage impliquant l’introduction d’acides aminés photo-activables dans une séquence
protéique.
A
B
Figure 12 : A : structure de la méthionine. B : structure de la photométhionine (18)
Le photo-pontage est une technique qui utilise des agents photo-pontant pour former
une liaison covalente entre deux protéines qui interagissent afin de figer ces interactions sous
forme de complexe pour pouvoir les étudier. On utilise ici des photo-méthionines (Figure 12)
qui comporte un groupement diazirine greffé sur la chaîne latérale. Sous l’effet des UV, le
groupement diazirine va former un carbocation hyper-réactif qui va réagir sur les liaisons C-H
pour former une liaison covalente (Figure 13).
Figure 13 : schéma de la réaction du groupement diazirine sous les UV.
Dans cette étude, les auteurs ont co-exprimé PGRMC1 portant un tag hemagglutinine
(HA) et Insig portant un tag Myc dans des cellules COS7. Puis ils ont cultivé ces cellules en
présence ou en absence de Photo-methionine (figure 12) afin d’introduire des groupements
photo activables (diazirine) dans ces protéines. Après irradiation aux UV, les lysats cellulaires
obtenus ont été analysés pour détecter la présence de complexes protéiques (figure 14).
12
Figure 14 : a. Des cellules COS7 (cellules de rein du singe) ont été transfectées avec un plasmide
pPGRMC1-3HA et un plasmide pInsig-9Myc. Les cellules sont cultivées en présence ou en absence de
Photo-methionine puis irradiées ou non aux UV, comme indiqué. Le lysat cellulaire a ensuite été soumis à
une immunoprécipitation avec des anticorps anti-HA ou anti-Myc, comme indiqué. Les protéines
immunoprécipitées ont alors été soumises à un SDS-PAGE et à un western blot avec des anticorps anti-Myc
ou anti-HA comme indiqué pour détecter le photo-pontage. NB : La présence de Insig non ponté à gauche
indique une co-immunoprécipitation non covalente. La large bande dans les puits 3 et 4 indique une fixation
des anticorps secondaires sur l’anticorps primaire.
b. Des cellules COS7 ont été transfectées avec des vecteurs codant les protéines taguées indiquées. Les
cellules ont été soumises à un cross-link comme précédemment. Le lysat cellulaire a ensuite été soumis à
une immunoprécipitation, un SDS-PAGE puis un western bot comme dans la figure a. NB : la bande de haut
poids moléculaire détectée avec un anticorps dirigé contre SCAP constitue certainement un dimère de
SCAP.
Dans les colonnes 1 et 3 (figure 14a) on peut voir une bande de forte intensité au
niveau du poids moléculaire attendu pour le complexe Insig-PGRMC1. Ces résultats montrent
qu’il y a une interaction directe entre ces deux protéines in vivo. Par le même procédé (figure
14b) ils ont mis en évidence une interaction directe entre PGRMC1 et SCAP (colonne 3). Par
contre on ne voit pas d’interaction de Insig ou de SCAP avec la protéine TRP1-RE (protéine
résidante du RE qui n’a pas de relation avec le complexe de régulation du cholestérol). Ceci
montre la spécificité de l’interaction de PGRMC1 avec SCAP et Insig.
Ces travaux ont permis de montrer que PGRMC1 interagit directement avec SCAP et
Insig, ce qui suggère que PGRMC1 pourrait être la protéine qui intervient dans la régulation
de la synthèse du cholestérol induite par le 25-HC.
Cependant à ce jour aucune étude n’a été réalisée pour déterminer le rôle de PGRMC1
dans le mécanisme de régulation de l’homéostasie du cholestérol par la voie du 25-HC. Notre
projet de recherche sera donc axé sur la détermination du rôle de PGRMC1 dans ce
mécanisme.
13
III. Projet de recherche :
Les résultats présentés précédemment, ont permis de mettre en évidence qu’il existe
une voie alternative de régulation du cholestérol médié par le 25-HC. De récents travaux ont
montré que PGRMC1 pouvait intervenir dans cette voie de régulation car elle interagit avec
des protéines de ce complexe de régulation. Notre projet de recherche sera donc centré sur la
protéine PGRMC1 et son rôle dans la régulation du cholestérol.
1) Présentation de PGRMC1 :
PGRMC1 (Progesterone Receptor Membrane Component 1) est un récepteur
membranaire de la progestérone, de la famille des MAPR (Membrane Associated
Progesterone binding Proteins). C’est une protéine de 28 kDa, composée d’une courte
extrémité N-terminale extracellulaire, d’un seul domaine transmembranaire et un domaine
cytoplasmique. Ce dernier présente plusieurs domaines putatifs SH2 (Src homology domain)
qui reconnaissent les tyrosines phosphorylées et SH3 qui reconnaissent les ligands riches en
prolines. Ces domaines confèrent à PGRMC1 la capacité d’activer certaines voies de
signalisation. Elle possède également un domaine de fixation à la progestérone qui présente
une grande homologie avec les domaines de fixation à l’hème. (19)
PGRMC1 est surtout connue pour son rôle dans l’effet anti-apoptotique de la
progestérone. En effet, l’action anti-apoptotique de la progestérone est médiée par un
complexe de deux récepteurs membranaires : PGRMC1 et PAIRBP1.(20)
D’autre part, PGRMC1 présente 98% d’homologie avec l’antigène IZA du rat qui
semble être impliqué dans la régulation du métabolisme de la progestérone. En effet, lorsque
l’antigène IZA est surexprimé, on observe une augmentation de la 21-hydroxylation de la
progestérone (21).
A l’heure actuelle nous ne disposons pas d’information sur le rôle potentiel de
PGRMC1 dans la régulation de la synthèse de cholestérol. C’est pourquoi nous avons
envisagé plusieurs expériences, afin de comprendre le rôle de PGRMC1 dans cette voie de
régulation.
14
Nous essayerons notamment de répondre aux questions suivantes:
Le 25-HC interagit-il directement avec PGRMC1 ?
Y a t-il formation d’un complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig ?
PGRMC1 intervient-elle dans l’inhibition du clivage de SREBP ?
2) Modèle d’étude
Pour les différentes expériences que mettrons en place nous utiliserons des cellules
COS7, qui sont des cellules rénales de singe, car ce sont les cellules qui ont été utilisées dans
les études présentées précédemment.
Ces cellules seront transfectées avec des plasmides contenant les gènes codant pour les
protéines taguées dont nous aurons besoin. Nous avons choisi de faire des transcriptions
transitoires car la plupart de nos expériences se font sur de courtes durées et ne nécessitent pas
de transfections stables. Pour cela nous utiliserons les vecteurs qui ont été utilisées dans les
études citées précédemment (17, 18). Les constructions A,B,C,D (figure 15) ont été clonées
dans des vecteurs pcDNA3.1Hygro(+) (carte du vecteur en annexe). Les cellules COS7 seront
transfectés avec ces vecteurs par la Lipofectamine 2000 d’Invitrogen.
A
PGRMC1
HA X3
SCAP
Flag
Insig
Myc X9
B
C
D
HSV
SREBP
Figure 15 : schéma des constructions plasmidiques qui seront
transfectées de façon transitoire dans les cellules COS7. Les
plasmides A, B, C seront demandés à l’équipe de M. Suchanek (18)
et le plasmide D sera demandé à l’équipe de C. Adams (17).
3) PGRMC1 intervient-elle dans l’inhibition du clivage de SREBP ?
On suppose qu’en présence de 25-HC et de PGRMC1, le complexe de régulation du
cholestérol inhibe le clivage de SREBP, pour inhiber l’expression des gènes impliqués dans la
synthèse de cholestérol. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons élaboré une stratégie
basée sur l’extinction de PGRMC1 par siRNA et la recherche de la forme clivée de SREBP
15
dans le noyau par western blot. Un gène rapporteur sous le contrôle de SRE nous permettra
également de voir s’il y a inhibition de l’activation de la transcription ( figure 22).
A. Transfection stable des cellules COS7 :
Nous réaliserons une transfection stable des cellules COS7 avec le gène codant pour
la Luciférase sous le contrôle de la séquence SRE répétées six fois. Ces cellules nous
permettrons de tester l’activation de la transcription du gène rapporteur de la Luciférase sous
le contrôle de la séquence SRE. Nous avons choisi de faire une transfection stable car cela
nous permettra d’obtenir une lignée cellulaire stable qui pourra être utilisée dans des études
ultérieures. La construction présentée dans la figure 21 sera clonée dans le vecteur
pcDNA3.1Hygro(+). Ces vecteurs seront linéarisés afin d’augmenter l’efficacité de la
transfection. De plus, le plasmide linéarisé ne pourra pas se répliquer donc la pression de
sélection nous permettra de sélectionner uniquement les cellules qui auront intégré le vecteur
dans leur génome. Ces vecteurs seront alors transfectés par la Lipofectamine 2000
d’Invitrogen. La sélection par l’Hygromycine nous permettra à long terme de sélectionner les
cellules ayant intégré le plasmide par recombinaison hétérologue.
Luc
SRE X6
Figure 21 : schéma de la construction plasmidique avec laquelle
nous transfecterons de façon stable les cellules COS7
B. Extinction de PGRMC1 :
Tout d’abord PGRMC1 sera produite dans E.Coli puis sera purifiée afin de faire
synthétiser des anticorps dirigés contre cette protéine par la société P.A.R.I.S. En parallèle,
nous ferons synthétiser les siRNA dirigés contre les ARNs messagers de PGRMC1 par
INVITROGEN.
Ensuite nous transfecterons les cellules exprimant la luciférase sous le contrôle des
séquences SRE, avec le plasmide codant HSV-SREBP et avec les siRNAs. On devra alors
vérifier qu’on n’a plus l’expression de PGRMC1 grâce à un western blot avec les anticorps
dirigés contre PGRMC1.
C. Expérience :
16
On pourra alors cultiver ces cellules en présence ou non de 25-HC pendant six heures
à l’issue desquelles on réalisera un fractionnement cellulaire. Puis on analysera la fraction
nucléaire pour détecter la présence ou non de la partie N-terminal de SRBEP par
l’intermédiaire d’un western blot avec l’anticorps dirigé contre HSV. En parallèle, le test avec
la luciférase sur un autre échantillon nous permettra d’observer ou non l’inhibition de la
transcription des gènes sous le contrôle des séquences SRE.
Si on ne détecte pas la forme clivée de SREBP sur le western blot dans la fraction
nucléaire issue de la culture en présence de 25-HC, cela signifiera que le clivage de SREBP a
été inhibé en absence de PGRMC1. Dans ce cas là, PGRMC1 ne serait pas la protéine qui
inhibe le processus de clivage de SREBP induit par le 25-HC.
De la même façon, si le test avec la luciférase est négatif en présence de 25-HC, cela
signifiera que PGRMC1 n’est pas la protéine qui inhibe le processus de clivage de SREBP
induit par le 25-HC.
Cellules COS7 transfectées avec le plasmide SREBP-HSV
siRNA dirigés contre PGRMC1 transfectés dans les cellules
Contrôle: cellules transfectées avec siRNA non spécifique
Transfection d’un plasmide contenant le gène rapporteur Luciférase
sous le contrôle de la séquence activatrice SRE (X6)
Cellules cultivées en présence de 25-HC ou non
Fractionnement cellulaire pour
séparer le noyau et le cytoplasme
Western blot avec anticorps antiHSV pour voir si on a la forme
clivée de SREBP dans le noyau.
Test avec la Luciférase pour voir
s’il y a activation de la transcription
des gènes sous le contrôle de SRE.
Figure 22 : schéma du plan de l’expérience pour mettre en évidence l’intervention de
PGRMC1 dans l’inhibition du clivage de SREBP.
17
4) Le 25-HC interagit-il directement avec PGRMC1 ?
Les travaux de M. Suchanek et al. suggèrent que PGRMC1 pourrait être la protéine
qui intervient dans la régulation de la synthèse du cholestérol induite par le 25-HC. On
voudrait donc déterminer s’il existe une interaction directe entre le 25-HC et PGRMC1. Pour
cela, nous utiliserons du 25-HC photo activable et radioactif pour qu’il soit photo-ponté à
PGRMC1 s’il interagit avec elle. Après purification du complexe par co-immunoprécipitation
la radioactivité nous permettra de voir si le 25-HC interagit avec PGRMC1.
A. Production du photo-25-HC radioactif :
En 2000, l’équipe de C. Thiele (22) a produit du
cholestérol photo-activable et radioactif (figure 16).
Le photo-cholestérol a été obtenu par conversion du 6keto-5a-cholestan-3b-ol en 6-azi-5a-cholestan-3b-ol.
Figure 16 : schéma du cholestérol photoactivable et radioactif.
Puis il a été rendu radioactif par oxydation avec de
l’acide chromique et réduction avec du [3H]NaBH4.
Nous demanderons donc à l’équipe de CM. Adams s’ils peuvent nous fournir du photo-25-HC
et nous le rendrons radioactif en utilisant la méthode de l’équipe de Thiele (Figure 17).
OH
1) H2CrO4
OH
2) [3H]NaBH4
Photo-25-HC
[3H]Photo-25-HC
Figure 17 : schéma de la réaction permettant de transformer le photo-25-HC en photo-25-HC radioactif.
B. Expérience :
L’expérience réalisée (figure 18) pour savoir si le 25-HC interagit directement avec
PGRMC1 consiste à transfecter les cellules COS7 avec le plasmide contenant le gène codant
pour la protéine PGRMC1 fusionnée au tag HSV. Ces cellules seront cultivées en présence de
photo-25-HC radioactif. Elles seront ensuite irradiées aux UV afin d’induire le photo-pontage
puis lysées. Nous réaliserons alors une co-immunoprécipitation avec l’anticorps anti-HSV sur
le lysat cellulaire afin de purifier PGRMC1. Les protéines ainsi purifiées seront soumises à un
18
SDS-PAGE, puis transférées sur une membrane de nitrocellulose. Cette membrane sera
autoradiographiée afin de visualiser la radioactivité. En effet, si on voit de la radioactivité sur
la bande correspondant au poids moléculaire de PGRMC1 cela signifiera que le photo-25-HC
radioactif est photo-ponté à PGRMC1 et donc qu’il y a une
interaction directe entre
PGRMC1 et le 25-HC.
Cellules COS7 transfectées avec PGRMC1-
culture en présence de photo-25-HC-radioactif
Photo-pontage par irradiation aux UV pendant 20 min
Lyse cellulaire et co-immunoprécipitation avec Ac anti-HSV
1. Lysat
cellulaire
2. + Ac antiHSV
3. + billes
couplées à la
protéine A
4. centrifugation
5. lavage
6. Western blot
SDS-PAGE, Transfert sur membrane, autoradiographie
Figure 18 : schéma du protocole de l’expérience de photo-pontage avec le photo-25-HC.
5) Y a t-il formation d’un complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig ?
Les études de M. Suchanek et al.(18), ont mis en évidence une interaction directe entre
Insig1 et PGRMC1 et entre PGRMC1 et SCAP.
Cependant, ils ne sont pas parvenu à démontrer la formation d’un complexe multiprotéique
composé de ces trois protéines. Nous avons donc imaginé une série d’expériences qui nous
permettrait de mettre en évidence l’existence d’un tel complexe (Figure 19).
La stratégie consiste à incorporer des acides aminés photo-activables dans la séquence
primaire des trois protéines afin fixer le complexe par un photo-pontage après une exposition
19
aux UV. Puis, suite à une purification par co-immunoprécipitation, un western blot nous
permettra d’identifier chaque partenaire du complexe multiprotéique isolé.
Transfection des cellules COS7 avec PGRMC1 SCAP Insig1 et culture des
cellules dans un milieu + photo-méthionines à 1,7mM + 25-HC 25µM
Photo-pontage irradiation aux UV 20min à 20°C.
Puis lyse cellulaire
Co-immunoprécipitation avec chacun des 3 Anticorps
bille
A
Coupure enzymatique à la papaïne au niveau de la fraction Fc des anticorps
Papaïne
Western blot
Co-IP
M
1
2
Co-IP
3
M
1
2
Co-IP
3
M
1
2
3
Figure 19 : schéma du plan de l’expérience pour mettre en évidence le complexe multiprotéique
PGRMC1/SCAP/Insig
Dans un premier temps, on transfectera les cellules avec les constructions présentées
dans la figure 15, permettant d’exprimer les protéines PGRMC1, SCAP et Insig taguées. Puis
on incubera ces cellules dans un milieu contenant des photométhionines (demandées à
l’équipe de Adams C.M.) et du 25-HC. On induira ensuite le photo-pontage en irradiant les
cellules aux UV. Après une lyse cellulaire (Figure 20), on effectuera d’abord trois coimmunoprécipitations séparément avec les anticorps dirigés contre chacun des tags utilisés.
Une digestion à la papaïne nous permettra de couper la partie Fc de l’anticorps. Une
centrifugation culottera les billes couplées aux protéines A complexées à la partie Fc des
20
anticorps. Les surnagents, contenant les complexes d’intérêt liés aux parties Fab des anticorps,
seront soumis à un SDS-PAGE (5%-15%). Après transfert sur membrane, les complexes
seront détectés par trois immunoblots avec les trois anticorps dirigés contre chacun des tags
utilisés. Le complexe PGRMC1/SCAP/Insig est attendu à une taille de 207kDa. Ceci nous
permettra de mettre en évidence la présence du complexe PGRMC1/SCAP/Insig.
Lyse cellulaire
Co-IP
avec l’Ac anti-Myc
Co-IP
avec l’Ac anti-Flag
Co-IP
avec l’Ac anti-HA
Digestion enzymatique à la papaïne, SDS-PAGE, transfert sur membrane
Détection avec Ac anti-Flag Détection avec Ac anti-Flag Détection avec Ac anti-Flag
Détection avec Ac anti-HA
Détection avec Ac anti-HA Détection avec Ac anti-HA
Détection avecAc anti-Myc
Détection avecAc anti-Myc Détection avecAc anti-Myc
Figure 20 : Récapitulatif des expériences de co-immunoprécipitation et western blot.
IV. Conclusions :
Le cholestérol est un constituant majeur des membranes lipidiques des cellules
eucaryotes et le précurseur de nombreuses hormones stéroïdiennes. Cependant, il est
nécessaire pour les cellules de réguler leur concentration en cholestérol à un taux
physiologique car une trop forte concentration en cholestérol peut conduire à la mort
cellulaire ou à une athérosclérose. La synthèse de cholestérol est régulée grâce à un contrôle
en feedback par le cholestérol. Ce complexe de régulation fait intervenir les protéines SREBP,
SCAP et Insig.
Cependant les oxystérols, comme le 25-Hydroxycholestérol peuvent également réguler
l’homéostasie du cholestérol. La voie du 25-HC a été étudiée et en partie décrite par l’équipe
de C. Adams. Ils ont mis en évidence que le 25-HC régule la synthèse de cholestérol par
l’inhibition du clivage de SREBP en induisant la formation du complexe SCAP/Insig.
Cependant le 25-HC n’interagit pas directement avec SCAP et n’induit de changement de
conformation de SCAP. Cette étude a conduit à émettre l’hypothèse que le 25-HC interagirait
21
avec une autre protéine non identifiée dont l’activation induirait la formation du complexe
SCAP/Insig pour inhiber le clivage de SREBP.
Une autre étude a mis en évidence que la protéine PGRMC1 interagit directement avec
SCAP et Insig, suggérant que PGRMC1 pourrait être la protéine qui intervient dans la
régulation de la synthèse du cholestérol induite par le 25-HC. Cependant, à ce jour, aucune
étude n’a été réalisée pour déterminer le rôle de PGRMC1 dans le mécanisme de régulation de
l’homéostasie du cholestérol par la voie du 25-HC. C’est pourquoi nous nous sommes
intéressées à cette protéine et avons élaboré un projet de recherche dans le but de comprendre
le rôle potentiel de PGRMC1 dans ce mécanisme.
L’expérience consistant à éteindre le gène codant pour PGRMC1 par siRNA
confirmera ou non l’implication de PGRMC1 dans la régulation du cholestérol par le 25-HC.
L’expérience du photo-pontage avec le 25-HC photo-activable et radioactif nous permettra de
déterminer si le 25-HC interagit directement avec PGRMC1. La dernière expérience de photopontage avec l’incorporation d’acides aminés photo-activables dans les protéines SCAP,
PGRMC1
et
Insig,
nous
permettra
de
montrer
si
un
complexe
tri-protéique
PGRMC1/Insig/SCAP se forme dans la cellule en présence de 25-HC.La mise en place de ces
expériences nécessitera
une coopération avec les équipes ayant déjà travaillé sur ce
complexe.
A l’heure actuelle les traitements pour lutter contre l’hypercholestérolémie comme les
statines, les résines ou les fibrates, nécessitent une prise conjuguée et provoquent de
nombreux effets secondaires. Ces contraintes aboutissent souvent à l’arrêt prématuré du
traitement. De plus, l’hypercholestérolémie est bien souvent indépendante de l’hygiène de vie
mais plutôt liée à des anomalies génétiques au niveau des constituants du métabolisme du
cholestérol. C’est pourquoi il est important de bien connaître toutes les voies de régulations du
cholestérol afin de développer des traitements mieux adaptés.
Les nouvelles informations, apportées par ce projet de recherche sur la régulation de la
synthèse de cholestérol induite par le 25-HC, permettront de mieux comprendre cette voie de
régulation et conduiront peut-être à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.
22
Références :
1. CJ. Chesterton. 1968; J. Biol. Chem.; Vol. 243 No 6; pp 1147-1151.
2. JR. Smith, TF. Osbornes, MS. Brown, JL. Goldstein and G. Gilll. 1988; J. Biol.
Chem.; Vol. 263; No. 34; pp. 18480-18487.
3. HC. Stark, O. Weinberger, and J; Weinberger. 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Biochem.; Vol. 89, pp. 2180-2184.
4. C. Yokoyama, X. Wang, MR. Briggs, A. Admon, J. Wu, X. Hua, JL. Goldstein, MS.
Brown. 1993; Cell.; Vol. 75; No 1; pp187-197.
5. X. Wang, J. Pai, EA. Wiedenfeld, JC. Medina, CA. Slaughter, JL. Goldstein, MS.
Brown. 1995; J. Biol. Chem.; Vol. 270, No 30; pp 18044-18050.
6. X. Hua, A. Nohturfft, JL. Goldstein and MS. Brown. 1996; Cell; Vol. 87; pp 415–
426.
7. RB. Rawson, NG. Zelenski, D. Nijhawan, J. Ye, J. Sakai, MT. Hasan, TY. Chang,
MS. Brown and JL. Goldstein. 1997; Molecular cell; Vol.1; pp 47-57.
8. J. Sakai, A. Nohturfft, D. Cheng, YK. Ho, MS. Brown, and JL. Goldstein. 1997; J.
Biol. Chem.; Vol. 272; No. 32; pp. 20213–20221.
9. T. Yang, JL. Goldstein, and MS. Brown. 2000; J. Biol. Chem.; Vol. 275; No. 38; pp.
29881–29886.
10. T. Yang, PJ. Espenshade, ME. Wright, D. Yabe, Y.Gong, R. Aebersold, JL. Goldstein
and MS. Brown. 2002; Cell.; Vol. 110; pp 489–500.
11. CM. Adams, J. Reitz, JK. De Brabander, JD. Feramisco, L. Li, MS. Brown, and JL.
Goldstein. 2004; J. Biol. Chem.; Vol. 279; pp 52772-52780.
12. T. Yang, PJ. Espenshade, ME. Wright, D. Yabe, Y. Gong, R. Aebersold, JL. Goldstein
and MS. Brown. 2002; Cell; Vol. 110; pp 489–500.
13. Hitoshi Shimano. 2001; Prog. Lipid Res., Vol. 40; pp 439–452.
14. JD. Horton, JL. Goldstein, and MS. Brown. 2002; J. Clin. Invest.; Vol. 109; pp1125–
1131.
15. D. Eberlé, B. Hegarty, P. Bossard, P. Ferré, F. Foufelle. 2004; Biochimie; Vol 86; pp
839–848.
16. J. George; Jr. Schroepfer. 2000; Physiol. Rev.; Vol. 80; No. 1; pp 361-554.
17. C.M. Adams, J. Reitz, JK De Bradander, J.D. Feramisco, L. Li, M.S. Brown, J.L.
Goldstein. 2004; J. Biol. Chem.; Vol. 279; No. 50; pp 52772-52780.
23
18. M. Suchanek, A. Radzikowska, C. Thiele. 2005; Nature methods; Vol. 2; No. 4; pp
261-267.
19. K. Ghosh, AM. Thompson, RA. Goldbeck, X. Shi, S. Whitman, E. Oh, Z. Zhiwu, C.
Vulpe and TR. Holman. 2005; Biochemistry; Vol 44; pp 16729-16736.
20. EE. Nilsson, J. Stanfield, MK. Skinner. 2006, Reproduction; Vol. 132; No. 6; pp 877886.
21. L. Mina, H. Takemori, Y. Nonakac, Y. Katoh, J.Doi, N. Horike, H. Osamue, FS. Raza
, GP. Vinson, M. Okamoto. 2004; Mol. and Cell. Endocrinol.; Vol. 215; pp 143–148.
22. C. Thiele, MJ. Hannah, F. Fahrenholz and WB. Huttner. 2000; Nature Cell Biology;
Vol 2; pp 42-49.
24
Annexe
Carte du vecteur pcDNA3.1Hygro
25