Mukaneza_Yvette_2013_memoire

Université de Montréal
Effet de la mutation du gène lrpprc sur l’activité de l’AMPK dans
les fibroblastes des patients atteints du syndrome de Leigh, type
canadien français
Par
Yvette Mukaneza
Département de nutrition
Faculté de médecine
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de
l’obtention du grade de Maîtrise ès science
en nutrition
Août, 2013
© Yvette Mukaneza, 2013

ii
Université de Montréal
Faculté des études supérieures
Ce mémoire intitulé :
Effet de la mutation du gène lrpprc sur l’activité de l’AMPK dans les fibroblastes des patients
atteints du syndrome de Leigh, type canadien français
Présenté par :
Yvette Mukaneza
A été évaluée par un jury composé des personnes suivantes :
Dr Jean Claude Lavoie, président-rapporteur
Dr Lise Coderre, directrice de recherche
Dr Christine Des Rosiers, codirectrice de recherche
Dr Guylaine Ferland, membre du jury

iii
Résumé
Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile
orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu-
spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de
crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces
crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les
mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC
demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du
métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la
protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de
même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de
patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress.
En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et
les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des
voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi
examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et
1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats
ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90%
(p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est
activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4
dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de
SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un
prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet
additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1
total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été
observés. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos
résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme
énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC.
Mots clés : LSFC, LRPPRC, AMPK, fibroblastes, dysfonction mitochondriale, métabolisme
énergétique, palmitate, ZMP

iv
Abstract
Leigh syndrome French Canadian type (LSFC) is an orphan infantile disease caused
by mutations in the LRPPRC gene. It is characterized by a tissue-specific cytochrome c
oxidase deficiency (COX), mitochondrial dysfunction and fatal lactic acidosis crises which
occur in more than 80% of cases. According to parents, these crises occur during stressful
situations. The pathophysiology underlying this disease and the factors that precipitate these
crises remain unknown. To better understand the regulation of energy metabolism in LSFC
patients, we examined the activity of AMP activated protein kinase (AMPK), a key regulator
of energy balance, and its downstream targets (SIRT1/PGC1α and Akt/mTOR) in LSFC and
control fibroblasts under basal and stress conditions.
Our results showed that AMPK activity was similar in LSFC and control cells under
basal conditions. On the other hand, Akt/mTOR and SIRT1/PGC1α pathways were up
regulated in LSFC cells compared to controls. We next examined AMPK activity in cells
treated with 10 mM lactate and 1mM palmitate (LP) for 4h, thus mimicking the conditions of
“crisis”. Following this treatment, AMPK phosphorylation levels increased significantly (90%,
p<0.01) in control cells but not in LSFC cells. Nevertheless, AMPK seems functional in
LSFC cells because the enzyme was activated in response to chemical hypoxia induced by 2,4
dinitrophenol. LP also increased the expression of SIRT1 (57%, p<0.05), LRPPRC (23%,
p=0.045) and COXIV (19%, p<0.05), in controls cells. Furthermore, pretreatment with ZMP,
a pharmacological activator of AMPK, had an additive effect with LP leading to a further
increase in the activity of SIRT1 (120%, p<0.05), as well as the expression levels of SIRT1
(75%, p<0.01), LRPPRC (63%, p<0.001) and COXIV (38%, p<0.001). All these effects
were abolished in LSFC cells and thus, our data highlight alterations in the regulation of key
enzymes of energy metabolism, including the activation of AMPK, in LFSC fibroblasts.
Key words: LSFC, LRPPRC, AMPK, fibroblasts, mitochondrial dysfunction, energy
metabolism, palmitate, ZMP.

v
Table des matières
RÉSUMÉ..................................................................................................................................iii
ABSTRACT..............................................................................................................................iv
TABLE DES MATIÈRES........................................................................................................v
LISTE DES TABLEAUX........................................................................................................ix
LISTE DES FIGURES.............................................................................................................x
LISTE DES ABRÉVIATIONS..............................................................................................xii
DÉDICACE............................................................................................................................xvi
REMERCIEMENTS............................................................................................................xvii
L’AVANT-PROPOS...........................................................................................................xviii
INTRODUCTION.....................................................................................................................1
I- Les maladies mitochondriales..............................................................................................2
I.1- La mitochondrie et le métabolisme énergétique..................................................2
I.1.1- Le métabolisme intermédiaire................................................................3
I.1.1.1- Catabolisme du glucose..............................................................5
I.1.1.2- Catabolisme des acides gras libres..............................................6
I.1.1.3- Catabolisme des acides aminés...................................................8
I.1.1.4- Cycle de Krebs............................................................................8
I.1.2- La phosphorylation oxydative..............................................................10
I.1.2.1- Les réactions d’oxydoréduction................................................11
I.1.2.2- La phosphorylation oxydative..................................................12
I.2- Dysfonction mitochondriale : Cause des maladies mitochondriales...............13
I.2.1- Mutations génétiques............................................................................13
I.2.1.1- Déficience en complexe I.........................................................13
I.2.1.2- Déficience en complexe II........................................................14
I.2.1.3- Déficience en complexe III.......................................................14
I.2.1.4- Déficience en complexe IV.......................................................14
I.2.1.5- Déficience en complexe V........................................................15
I.2.2- Altérations métaboliques......................................................................16
I.2.2.1- Production d’ATP.....................................................................16