projet AD-AMPK

Rôle de la dérégulation de la protéine kinase activée par l’AMP dans la maladie
d’Alzheimer
Directeur de thèse : S. HUMEZ, UMR-S1172, Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert
Co-encadrant : V. VINGTDEUX, UMR-S1172, Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert
Résumé
La maladie d’Alzheimer (MA) représente la principale cause de démences, elle affecte le
cerveau et engendre un déclin progressif des facultés cognitives. La MA est caractérisée par
la présence dans le cerveau de deux types de lésions : les dépôts amyloïdes et la
dégénérescence neurofibrillaire (DNF) qui résulte de l’agrégation intra-neuronale de la
protéine tau sous une forme hyper-phosphorylée. L’hyper-phosphorylation de la protéine tau
est associées à des altérations de la mémoire et joue un rôle central dans la DNF qui
représente une des principales causes de la mort neuronale dans la MA.
Récemment il a été montré que la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK) était fortement
accumulée sous sa forme activée dans les neurones en DNF dans les cerveaux de patients
atteints de la MA et que l’AMPK était une nouvelle protéine kinase de tau in vitro. Ces
résultats suggèrent que la dérégulation de la voie de signalisation de l’AMPK, une protéine
clé de la régulation du métabolisme énergétique cellulaire, pourrait jouer un rôle crucial dans
le développement de la MA.
Le but de ce projet est de déterminer le rôle de la dérégulation de l’AMPK dans la maladie
d’Alzheimer. Dans ce but, les objectifs suivants sont proposés : (1) d’identifier la/les voie(s)
conduisant à la dérégulation de l’AMPK, et (2) de déterminer si la dérégulation de l’AMPK
affecte la phosphorylation et l’agrégation de la protéine tau et les déficits cognitifs qui lui sont
associés dans un modèle murin de la MA. L’étude de la phosphorylation de la protéine tau et
des voies de signalisation qui régulent l’AMPK se fera grâce à des approches
pharmacologiques et à l’utilisation de vecteurs d’expression dans divers modèles cellulaires
et animaux. Ce projet devrait nous permettre d’apporter la preuve que la dérégulation de
l’AMPK est un évènement précoce et majeur dans le développement de la MA et pourrait
faire de l’AMPK et/ou de sa voie de signalisation une cible thérapeutique d’intérêt pour la
MA.
Projet
1. Introduction
Avec l’allongement de la durée de vie et le vieillissement de la population, les maladies
neurodégénératives et la maladie d’Alzheimer (MA) en particulier sont devenues un
problème majeur de santé publique. La MA représente la principale cause de démences, elle
affecte le cerveau et engendre des pertes de la mémoire, des fonctions cognitives, et des
troubles du comportement. La MA se caractérise par la présence dans le cerveau de deux
types de lésions : les dépôts amyloïdes extracellulaires composés du peptide β-amyloïde
1
Concours « Allocations de recherche » 2015-2016
agrégé, et de la dégénérescence neurofibrillaire (DNF) qui résulte de l’agrégation intraneuronale de la protéine tau sous une forme hyper- et anormalement phosphorylée.
Récemment, nous avons montré que la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK, AMPactivated protein kinase) était fortement accumulée dans les neurones en dégénérescence
dans les cerveaux de patients atteints de la MA et que l’AMPK était une nouvelle protéine
kinase de tau in vitro (Vingtdeux et al. 2011). Une dérégulation de l’AMPK a également été
observée dans les neurones qui ne présentaient pas encore de DNF, suggérant que la suractivation de l’AMPK est un événement en amont de la pathologie tau. Nous avons montré
que dans ces neurones l’AMPK dérégulée était (1) suractivée et (2) délocalisée du noyau
vers le cytoplasme. Ici nous proposons que dans ces conditions de dérégulation, l’AMPK
puisse contrôler la phosphorylation de tau, son agrégation et les déficits cognitifs qui lui sont
associés. L’AMPK est un senseur métabolique qui participe à la régulation de la balance
énergétique et ainsi est impliqué dans les maladies métaboliques et certains cancers.
L’activation de l’AMPK a pour conséquence de maintenir l’homéostasie énergétique
cellulaire en stimulant les voies cataboliques impliquées dans la synthèse d’ATP et en
inhibant les voies anaboliques ou consommatrices d’ATP (Carling et al., 2011). Le rôle
physiologique de l’AMPK dans le cerveau pour la mémoire et son implication dans les
maladies neurodégénératives représente un domaine de recherche émergeant.
2. Objectifs de la thèse
Le but de ce projet de thèse est de déterminer le rôle de la dérégulation de l’AMPK dans
la maladie d’Alzheimer en testant le modèle selon lequel AMPK est impliquée dans le
développement de la pathologie tau et des déficits cognitifs qui lui sont associés. L’AMPK et
ses voies de signalisation en amont et en aval pourraient ainsi représenter de nouvelles
cibles thérapeutiques pour la MA.
Afin de tester ce modèle, les objectifs suivants sont proposés :
(1) d’identifier la/les voie(s) conduisant à la dérégulation de l’AMPK, et (2) de
déterminer si la dérégulation de l’AMPK affecte la phosphorylation ou
l’agrégation de la protéine Tau et les déficits cognitifs qui lui sont associés
dans un modèle de souris de la MA.
3. Méthodologies développées
3.1. Identifier la/les voie(s) conduisant à la dérégulation de l’AMPK
Le but de cette partie sera d’identifier quel stress cellulaire peut entrainer une dérégulation
c’est-à-dire une activation et une délocalisation de l’AMPK qui conduira à la phosphorylation
de la protéine tau. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cultures primaires de
neurones de souris sauvages et de souris transgéniques pour la protéine tau humaine. Ces
modèles seront soumis à différents stress qui ont été décrits pour être présents et participer
au développement de la MA tels qu’une augmentation de la concentration de calcium
intracellulaire (glutamate, ionomycine), un stress métabolique (conditions de privation de
glucose) ou un stress oxydant (H2O2). Nous validerons l’activation de l’AMPK dans ces
conditions, nous déterminerons également le statut de phosphorylation de la protéine tau, la
2
Concours « Allocations de recherche » 2015-2016
localisation du complexe AMPK activé (par des approches d’immunocytochimie et de
fractionnement cellulaires) et la protéine kinase qui est responsable de l’activation de l’AMPK
(par approche pharmacologique et siRNA).
3.2. Déterminer si la dérégulation de l’AMPK affecte la pathologie tau et les déficits cognitifs
qui lui sont associés dans un modèle animal
L’objectif de cette partie est de mettre en place un modèle animal qui permettra l’étude in
vivo de l’effet de la sur-activation de l’AMPK sur la pathologie tau et les déficits cognitifs qui
lui sont liés. Pour cela nous injecterons des vecteurs adénoviraux non réplicatifs codant la
protéine AMPK sauvage ou modifiée (constitutive active) par voie stéréotaxique dans
l’hippocampe de souris transgéniques pour la MA, les souris THY-Tau22 (Schindowski et al.,
2006). L’impact de la surexpression de l’AMPK sur le développement de la pathologie tau
sera étudié grâce à des méthodes protéomiques, morphologiques et par dosages ELISA.
Afin de déterminer l’implication de l’AMPK pour la cognition, les animaux seront soumis à
différents tests comportementaux afin d’évaluer l’anxiété (labyrinthe surélevé) et la mémoire
spatiale (Morris Water Maze).
Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience de l’AMPK réduit la pathologie Tau.
Dans ce contexte de sur-activation de l’AMPK, nous nous attendons à observer un
développement pathologique plus rapide (mémoire et pathologie tau). A noter que les outils
nécessaires à la réalisation de ce projet sont en place au laboratoire (vecteurs d’expression,
anticorps, modèles cellulaires et animaux …).
En conclusion, la réalisation de ce projet devrait permettre d’une part de valider nos
résultats in vitro montrant que l’AMPK est une nouvelle protéine kinase de tau et
d’autre part devrait apporter la preuve de concept que l’AMPK est un acteur clé dans
le développement de la pathologie tau et des déficits cognitifs qui lui sont associés.
L’identification de la voie moléculaire menant à la sur-activation de l’AMPK et
entrainant ainsi l’hyper-phosphorylation de la protéine tau permettra d’un point de vue
fondamental une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués
dans la maladie d’Alzheimer.
4. Compétences du candidat
Le candidat devra avoir des compétences en biologie cellulaire (culture primaire, traitements
pharmacologiques) et biochimie (western-blot, fractionnement subcellulaire, immunoprécipitation). Les aspects in vivo, expérimentation animale et comportement feront l’objet de
formations.
Références
Vingtdeux et al. 2011; Acta Neuropathol. 12(3):337-49
Carling et al., 2011; Nature Chemical Biology 7:512-518
Schindowski et al., 2006; Am J Pathol. 169(2):599-616
3
Concours « Allocations de recherche » 2015-2016
Role of AMP-activated protein kinase (AMPK) deregulation in Alzheimer’s disease
Thesis supervisor : S. HUMEZ, UMR-S1172, Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert
Co-supervisor : V. VINGTDEUX, UMR-S1172, Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert
Abstract
Alzheimer’s disease (AD), the most common form of dementia, is characterized by the
presence in the brain of extracellular amyloid-β (Aβ) deposits and intracellular neurofibrillary
tangles (NFT) composed of aggregated hyperphosphorylated tau proteins. Tau
hyperphosphorylation has been related to memory deficits and is known to play a central role
in the neurofibrillary degeneration that is a leading cause of neuronal death in AD.
Recently, it was shown that the master energy sensor of the cell, AMPK (AMP-activated
protein kinase) was strongly activated in pre-tangle- and tangle-bearing neurons in AD and
that AMPK was a novel tau phosphorylating protein kinase in vitro. These observations
suggested that AMPK signaling pathway deregulation could play a key role in AD pathology
and led us to propose that by controlling tau phosphorylation, AMPK might also regulate tau
aggregation and thus impact on tau-mediated cognitive deficits.
The goal of this proposal is to test the working model that AMPK is involved in tau
pathology and hence may represent a novel therapeutic target for AD. To this end, the
following objectives are proposed: (1) to identify the/pathway(s) leading to AMPK
deregulation, and (2) to determine whether AMPK deregulation affects tau
phosphorylation/aggregation and tau-mediated cognitive deficits in an AD mouse model.
Pharmacological approaches and expression vectors will be used in conjunction with various
cell and animal models to study tau phosphorylation status and AMPK-related signaling
pathways. This project should enable us to determine the role of AMPK in AD and to identify
AMPK and its signaling pathways as new potential therapeutic targets for AD.
Project
1. Introduction
With increased lifespan and aging, neurodegenerative diseases and Alzheimer's disease
(AD) in particular have become a major public health problem. AD is the leading cause of
dementia, it affects the brain and causes cognitive deficits and memory loss. AD is
characterized by the presence in the brain of extracellular amyloid-β deposits and
intracellular neurofibrillary tangles (NFT) composed of aggregated hyperphosphorylated tau
proteins. Tau hyperphosphorylation is believed to be the leading cause of tau aggregation;
therefore strategies aiming at inhibiting tau phosphorylation are of therapeutic values for AD.
Recently, we have shown that activated AMP-activated protein kinase (AMPK) was highly
accumulated in degenerating neurons in the brain of patients with AD and that AMPK was a
new protein kinase tau in vitro (Vingtdeux et al. 2011). AMPK deregulation was also
4
Concours « Allocations de recherche » 2015-2016
observed in neurons not yet presenting hyperphosphorylated tau therefore suggesting that
AMPK deregulation was an upstream event to tau phosphorylation. We found that (1) AMPK
was over-activated and (2) AMPK delocalized from the nucleus to the cytoplasm. Here we
suggest that by controlling tau phosphorylation, AMPK might also regulate its aggregation
and its associated cognitive deficits. AMPK is a metabolic sensor and as a result is mostly
studied in the context of cellular energy balance regulation and metabolic diseases. AMPK
activation helps maintaining cellular energy homeostasis by stimulating catabolic pathways
involved in ATP synthesis and by inhibiting anabolic pathways that consume ATP (Carling et
al., 2011). The physiological role of AMPK in the brain for memory and its involvement in
neurodegenerative diseases represents an emerging field of investigation.
2. Objectives
The aim of this PhD project is to determine the role of AMPK deregulation in Alzheimer's
disease by testing the working model that AMPK is involved in the development of tau
pathology and associated cognitive deficits. In which case, AMPK and its signaling pathways
upstream and downstream could represent new therapeutic targets for AD.
To test this model, the following aims are proposed:
(1) to identify the pathway(s) leading to AMPK deregulation, and (2) to
determine
whether
AMPK
deregulation
affects
tau
phosphorylation/aggregation and tau-mediated cognitive deficits in a
mouse model of AD.
3. Methods
3.1. To identify the pathway(s) leading to AMPK deregulation
The goal of this aim will be to identify a pathway which will recapitulate the deregulations
observed in AD i.e.: (1) AMPK over-activation, (2) AMPK delocalization from the nucleus to
the cytoplasm. To this end, we propose to induce stresses that have been shown to occur in
AD such as increased intracellular calcium concentrations (glutamate, ionomycin), metabolic
stress (glucose deprivation) and oxidative stress (H2O2). Primary neuronal cultures obtained
from wild-type or tau transgenic mice will be used to assess the effects of these stresses on
tau phosphorylation and AMPK activation. In addition, for each conditions we will determine:
where the activated complex is localized (using immunocytochemistry and cellular
fractionation protocols), and which upstream kinase is responsible for AMPK activation
(using pharmacological and silencing approaches).
3.2. To determine whether AMPK deregulation affects tau pathology and its associated
cognitive deficits in an animal model of AD
The purpose of this aim is to establish an animal model that will allow the in vivo study of
AMPK over-activation effects on tau pathology and tau-mediated cognitive deficits. To this
end, we will inject non-replicative adenoviral vectors encoding wild-type or modified
(constitutive active) AMPK protein stereotaxically in the hippocampus of THY-Tau22 mice, a
mouse model for AD (Schindowski et al., 2006). The impact of AMPK overexpression on tau
5
Concours « Allocations de recherche » 2015-2016
pathology development will be studied using ELISA assays, biochemical studies, and
histology. To determine the involvement of AMPK on cognition, the animals will be subjected
to different behavioral tests to assess anxiety and spatial memory using for example the
elevated plus maze and the Morris water maze respectively.
Our preliminary results suggest that AMPK deficiency reduces tau pathology. In the present
context where AMPK will be over-activated, we expect to observe an earlier development of
tau pathology (memory and tau pathology). Of note, the tools necessary for the realization of
this project are in place in the laboratory (including: expression vectors, antibodies, cell and
animal models…).
Overall, the realization of this project should allow us to validate our in vitro results
showing that AMPK is a new tau protein kinase and should provide the proof of
concept that AMPK is a key player in the development of tau pathology and taumediated cognitive deficits. Through the identification of a molecular pathway that will
lead to AMPK over-activation, delocalization and subsequent tau phosphorylation, this
project should lead to a better understanding of the molecular mechanisms involved
in AD.
4. Applicant
The applicant should have cell biology and biochemistry skills (primary culture,
pharmacological treatment, sub-cellular fractionation, Western blotting, immunoprecipitation). The candidate will be trained for in vivo studies: animal experimentation and
behavioral assessments.
References
Vingtdeux et al. 2011; Acta Neuropathol. 12(3):337-49
Carling et al., 2011; Nature Chemical Biology 7:512-518
Schindowski et al., 2006; Am J Pathol. 169(2):599-616
6
Concours « Allocations de recherche » 2015-2016