Vibrio cholerae - Direction des laboratoires
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Ministère de la Santé et de la Prévention Réseau National de Laboratoires du Sénégal Vibrio cholerae Pr Moussa Fafa Cissé Hôpital d’Enfants Albert Royer Objectifs du cours • Connaître les caractères bactériologiques • Classer les souches circulant au Sénégal • Décrire la physiopathologie du choléra • Connaître indications recherche du vibrion • Connaître les modalités de la collecte, du transport et de la conservation des selles • Décrire étapes diagnostic bactériologique • Connaître le test de diagnostic rapide • Connaître les antibiotiques à tester sur une souche de V. cholerae • Connaître les modalités de la prévention du choléra au sein d’une communauté 1. Introduction Définition • Bacille Gram ((- ) – Incurvé en virgule – Mobile polaire – Fermentant le glucose – Oxydase (+) – Aérobie anaérobie facultatif – Milieux ordinaires • Synonyme : vibrion cholérique Intérêt de la question • Clinique – Choléra = fuite d’eau + sels – C’est une déshydratation sévère • Épidémiologique – Maladie hydrique – Maladie des « mains sales » – Problème de santé publique • Pas de vaccin pour arrêter une épidémie 2. Classification Données générales • • • • • • Famille : Vibrionaceae Genre : Vibrio Espèces : nombreuses Sérogroupes:: 155 Sérogroupes Sérotypes:: 3 Sérotypes Biotypes: 2 7 caractères de la famille • • • • • • • 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Bacilles à Gram ((-) Fermentent le glucose Oxydase (+) Aérobies anaérobies facultatifs Mobiles polaire Nitrate réductase (+) Cultivent sur milieux ordinaires Principales espèces • Vibrio cholerae • Vibrio parahaemolyticus • Vibrio alginolyticus Sérogroupes : • Support du sérogroupage = AgO – 155 sérogroupes définis – O1 à O155 • Souches responsables du choléra – O1 ⇒ cause principale – O139 ⇒ cause secondaire Sérotypes • Trois sérotypes : – Ogawa - Inaba - Hikojima • Support du sérotypage = protéines paroi Biotypes • Deux biotypes : – V. cholerae el tor – V. cholerae cholerae • Support du biotypage = nutrition Souches circulant au Sénégal • • • • Espèce : Vibrio cholerae Sérogroupe : O1 Sérotype : Ogawa Biotype : el tor Vibrio cholerae O1 Ogawa el tor 3. Caractères bactériologiques 3.1. Caractères Morphologiques * Microscope électronique : Forme bien visible * Examen à l’état frais • Bacille • Mobile polaire • « Vol de moucheron » * Coloration de Gram : • • • • Bacille à Gram ((- ) Forme : incurvé en « virgule » Asporulé Acapsulé 3.2. Caractères culturaux 3.2.1. Milieux de culture * Géloses d’isolement • Géloses sélectives - Gélose TCBS . Thiosulfate . Citrate . Bile . Saccharose - Gélose nutritive alcaline: GNA •Autres géloses: SS, Hektoen, Hektoen, EMB * Bouillons d’enrichissement • Eau peptonée alcaline • Eau peptonée salée alcaline: EPSA 3.2.2. Atmosphère d’incubation • Humide • Aérobie : bactérie AAF • Température optimale : +37° +37°C 3.2.3. Aspect des colonies * Sur GNA • Type S – Rondes, lisses, régulières – Taille moyenne • Aspect – Légèrement opaque – Bleutée * Caractères sur TCBS • Couleur jaune – Due à la fermentation – Du saccharose • Type S * Culture en bouillon • Bouillon non trouble • Léger voile en surface 3.3. Caractères biochimiques * Caractères de famille • Oxydase (+) • Glucose fermenté • Nitrate réductase (+) * Caractères de genre • • • • • • • Gélatinase (+) Mannitol (+) Lactose ((- ) Gaz ((- ) Uréase (-) SH2 (-) LDC (+) ; ODC (+); ADH ((-) * Caractères orientant vers Vibrio cholerae • • • • • • ONPG (+) Saccharose (+) Indole (+) Citrate Simmons (+) VP variable: (± (± ) Croissance sur milieu non salé KliglerKligler -Hajna Lactose ((- ) SH2 (-) Glucose (+) Gaz ((- ) Biotypes Caractères cholerae el tor VP (-) (+) Hémolyse (-) (+) Sensible Résistant Polymyxine 3.4. Caractères antigéniques * Antigènes de paroi • AgO = support du sérogroupage – Sérogroupes O1 à O155 – Choléra est provoqué par O1 et O139 • Protéines = support du sérotypage – Ogawa – Inaba – Hikojima * Pili • Tiges protéiques rigides • Fixent le vibrion sur l’entérocyte l’entérocyte • Support plasmidique 3.5. Enzymes du vibrion • Mucinase • Protéase • Hémolysine 3.6. Toxine cholérique • Constituée de 2 soussous-unités – Sous Sous-unité A ⇔ toxine – Sous ous-unité B: fixe toxine sur entérocyte • C’est une entérotoxine – Diarrhée – Vomissements Support toxine = plasmide 19/10/2012 31 4. Épidémiologie 4.1. Habitat du vibrion • Réservoir de germes = intestin – Homme malade – Homme porteur sain • Environnement souillé – Eaux: canaris, puits, rivière, fleuve … – Aliments: fruits, légumes … 4.2. Transmission du vibrion • Voie et mode – Voie fécale orale – Mode direct et indirect • Vecteurs – Mains ⇒ maladie des « mains sales » – Eau ⇒ maladie « hydrique » – Aliments, fruits et légumes 19/10/2012 34 4.3. Maladie endémoendémo-épidémique • Inde = berceau du choléra – Choléra y est endémique – Fleuve Gange = réservoir potentiel • Afrique: infectée en 1970 – Endémie dans les régions humides – Épidémie dans les régions sèches 7ème pandémie : V. cholerae O1 19/10/2012 36 5. Choléra 5.1. Physiopathologie 5.1.1. Phase d’infection • Ingestion – Vibrion ingéré avec aliments – Arrive dans l’intestin grêle • Production de mucinase – Qui détruit le mucus intestinal – Vibrion accède aux entérocytes – Et se fixe sur eux par ses pili Colonisation surface intestin : • Vibrion se multiplie – Abondamment à la surface intestinale – Sans envahir l’organisme humain • Produit la protéase – Dénude les gangliosides – Sur lesquels la toxine se fixera 5.1.2. Phase d’intoxication Pénétration de la toxine • Sous unité B – Se fixe sur l’l’entérocyte entérocyte – Au niveau des gangliosides (GM1) • Sous Sous-unité A pénètre dans l’l’entérocyte entérocyte – Active l’l’adénylate adénylate cyclase – Perturbe le cycle de l’AMPl’AMP-cyclique Conséquences des perturbations • Excrétion accrue d’ions chlore • Fuite d’eau • Fuite d’électrolytes D’où diarrhée + vomissements 19/10/2012 43 19/10/2012 44 5.2. Clinique Le choléra est une déshydratation aiguë Diarrhée Aiguë Survenue brutale Selles sont liquides « eau de riz » Aqueuses, claires Grumeleuses (amas de vibrion) Absence de fièvre Vomissements • Abondants – En « jet » – Sans effort • Douleurs et crampes abdominales Obnubilation voire coma 6. Diagnostic bactériologique 6.1. Produits pathologiques * D’origine humaine : - Selles - Vomissures * D’origine environnementale : - Eaux . Jarres, canaris, bassins . Rivières, lacs, fleuves . Mer (embouchures, estuaires) - Aliments * Collecte des selles Matériels de collecte • Pot à usage unique – Plastique, stérile – Avec cuillère fixée au couvercle • Autres – Écouvillons – Spatule ou abaisse langue Bannir boîte allumettes et flacon d’AB Moment de la collecte • Avant toute antibiothérapie • À tout moment, à toute heure • De jour comme de nuit Il faut des selles fraîchement émises Nombre d’échantillons • Un seul suffit par malade • Prélever les dix 1ers malades • Pour confirmer l’épidémie Recueil physiologique des selles • Malade défèque dans le pot de collecte • Environ 5 ml de selles fraîches • Bien reboucher le pot de collecte Recueil par écouvillonnage rectal • Introduire écouvillon – Dans le canal anal – Sur 33-5 cm – Tourner à 180° 180° • Utiliser au moins 2 écouvillons * Transport des selles Matériels de transport • Milieux de transport – Gélose de Cary Blair – Eau peptonée salée alcaline – Papier buvard propre • Glacière + bacs à glace Gélose de Cary Blair Transport sur distance courte • Transport rapide • Sans délai d’attente • Durée idéale = 30’ Transport sur distance longue • Utiliser un milieux de transport – Gélose de Cary Blair (72H) – Eau peptonée salée alcaline (18H) – Papier buvard (24(24-48H) • Glacière: 12H Transport sur papier buvard • Imbiber – Morceau papier absorbant stérile – Avec quelques gouttes de selles • Placer dans récipient en plastique, stérile – À fermeture étanche – Contenant gouttes eau Φ stérile • Transporter à température ambiante. * Conservation des selles / En salle d’hospitalisation • Conserver dans un endroit isolé • Pendant 30’ au maximum • Idéal: conserver en salle climatisée / Au Laboratoire • Sur la paillasse ⇒ 30’ • Au réfrigérateur (+4° (+4°C) ⇒ 12H • Au congélateur ((-40 40° °C) ⇒ mois But conservation au frais • Contrôler la flore commensale – Bloquer sa croissance – Ralentir sa croissance • Afin d’éviter l’acidification des selles – Vibrion croît à 7 ≥ pH ≤ 10 – Inhibition croissance à pH < 6 6.2. Technologie au Laboratoire * Examen des selles Examen macroscopique • Aspect – Selles très liquides (afécales (afécales)) – Eau de riz – Contenant des grumeaux • Absence de sang et de pus Examen microscopique • État frais – Nombreux bacilles mobiles polaire – Rechercher hématies, leucocytes – Parasites: Trichomonas, Giardia … • Coloration de Gram – Bacilles à Gram ((-) – Incurvés en virgule – Acapsulés Acapsulés,, asporulés * Coproculture Ensemencement selles / Isolement sur géloses • Isolement sur géloses sélectives – Gélose TCBS – Gélose nutritive alcaline (GNA) – Autres: SS, Hektoen • Utiliser la technique des quadrants Incuber 1818-24H à +37 +37° °C / Enrichissement en bouillon • Ensemencer – Un tube d’eau peptonée alcaline – Incuber à +37° +37°C; pendant 6 6-8H • Repiquer sur une gélose TCBS ou GNA Incuber à +37° +37°C; repiquage au bout de 8H 19/10/2012 63 * Identification du vibrion Colonies suspectes • Aspect sur TCBS – Couleur jaune – À cause fermentation du saccharose • Pratiquer – État frais – Coloration de Gram • Agglutination (sérogroupage (sérogroupage): ): sur GNA Caractères d’orientation • « CholéraCholéra-roth »: sur eau peptonée – Production d’indoled’indole-nitrite – Recherchée avec l’acide sulfurique. • Halotolérance – Croissance présence de NaCl 1-3% – Inhibition croissance à 7% de NaCl – Croissance en milieu non salé Réaliser des galeries • Mini galerie KliglerKligler -Hajna Hajna,, Bouillon uréeurée-indole • Galerie complète – Galerie classique (tubes) – Galerie API 20NE – Galerie API 20E Lecture des galeries • Rechercher – Caractères de la famille et du genre – Caractères de l’espèce V. cholerae • Confirmer par – Sérogroupage O1 et O139 – Sérotypage Inaba Inaba,, Ogawa, Ogawa, Hikojima – Biotypage el tor et cholerae Sérogroupage : Agglutination sur lame * Antibiogramme • Tester les molécules suivantes – Tétracyclines, Phénicols, Phénicols, Cotrimoxazole – Nitrofuranes Nitrofuranes,, antiseptiques intestinaux – Pénicillines A : ampicilline, amoxicilline • Résistances des souches en Afrique – Sénégal ⇒ Cotrimoxazole – Afrique de l’Est ⇒ Tétracyclines Composé vibriostatique O129 * Tests de diagnostic rapide Bandelettes • Mise au point en 2002 – Institut Pasteur Paris – Institut Pasteur Madagascar (OMS) • Conservation facile – Plusieurs mois à T° T° ambiante – Dans un sac résistant à l'humidité • Principe – Immunochromatographie – Détectent Vibrion cholerae O1 et O139 Utilisation sur les selles • Plonger la bandelette dans – Un échantillon de selles – Attendre 2 à 15 minutes • Résultats – Apparition de 2 traits rouges: test (+) – Apparition d’un seul trait: tests (( -) • Spécificité: 8484-100%; sensibilité: 94 94-100% Utilisation sur écouvillonnage rectal • Plonger l'écouvillon – Dans un milieu de culture – Incuber celuicelui-ci à 37° 37°C pendant 4H • Performance – Sensibilité: 9393-96% – Spécificité: 9292-98% 7. Eléments de thérapeutique Traitement curatif • Réhydratation = remplissage vasculaire – Perfusion intraveineuse – Voie orale dès que possible • Antibiothérapie ⇒ élimine le vibrion – Ampicilline, amoxicilline amoxicilline,, C3G – Cyclines, chloramphénicol AB tarit source toxine; prévient portage Lutte contre le péril fécal • • • • • • Disposer d’eau potable Lavage des mains Lavage des fruits et légumes Contrôle sanitaire des aliments Entretien des toilettes : crésyl … Informer – Eduquer – Communiquer Vaccins anticholériques • Vibrio cholerae el tor inactivé – Sérotypes Ogawa + Inaba – Fraction B de la toxine • Vibrio cholerae el tor vivant atténué Taux de protection: 6060-70% Indications de la vaccination • Cibles – Pèlerins, touristes – Populations des zones d’endémie • Épidémie – Vaccination non indiquée car protection – Ne débute qu’à partir du 15ème jour Merci 19/10/2012 78
