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Université de Liège
Faculté des Sciences
Département de Biologie, Ecologie et Evolution
Laboratoire d’Ecologie Animale et Ecotoxicologie
Effets du chlordécone chez Macrobrachium rosenbergii :
Bioaccumulation, élimination et perturbation des
processus biologiques liés au système endocrinien
Anne Lafontaine
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de
Docteur en Sciences
Année académique 2016-2017
Promoteurs :
Prof. Jean-Pierre Thomé
Prof. Joëlle Forget-Leray
Jury :
Prof. Jean-Christophe Plumier
(Président)
Dr. Célia Joaquim-Justo
Dr. Eric Gismondi
Dr. Krishna Das
Dr. Aurélie Bigot-Clivot
Ce projet de recherche, financé par le FRS-FNRS, l’ULg et l’ANR (ANR-10-CESA-014), a
été réalisé sous la supervision des Prof. Jean-Pierre Thomé et Joëlle Forget-Leray.
Photos de couverture : recto - M. rosenbergii: https://guadeloupe.net/ouassou; verso - C. sordidus : Arnstein
Staverløkk© / www.bioforsk.no. Autres : A. Lafontaine
Résumé
Les perturbateurs endocriniens sont des composés chimiques capables d'interférer, à
de très faibles concentrations, avec le système endocrinien des organismes exposés. Ils
peuvent agir à travers plusieurs mécanismes et à différentes étapes des voies de
signalisation des hormones. Le chlordécone est un composé organochloré considéré
comme un perturbateur endocrinien puissant à cause de sa capacité à se lier aux récepteurs
des œstrogènes chez les vertébrés. Chez les invertébrés, peu d’études rapportent les effets
du chlordécone sur le système endocrinien des organismes exposés. Le chlordécone est un
insecticide organochloré largement utilisé en Guadeloupe (Antilles française), à partir de
1972, pour lutter contre le charançon du bananier, Cosmopolites sordidus (Germar, 1824).
Quelques années après son introduction et son utilisation, une pollution généralisée des
sols, des rivières, des animaux sauvages et des organismes aquatiques, a été signalée.
L’utilisation du chlordécone a définitivement été interdite en 1993, en raison de sa toxicité
et de sa persistance dans l’environnement. Un certain nombre de mesures et de restrictions
ont été mises en place afin de limiter l’exposition de la population humaine. Une Limite
Maximale de Résidus (LMR) de 20 µg de chlordécone par kilo de poids frais dans les
denrées alimentaires d’origine animale ou végétale a été adoptée. L’adoption de cette
norme a entrainé la fermeture de nombreuses unités d'aquaculture en raison de la présence
de chlordécone, en quantité supérieure à la LMR, dans les produits halieutiques. Cette
contamination des produits issus de l’aquaculture, a eu des sérieuses répercussions sur
l’élevage de la crevette géante d'eau douce, Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879),
qui représente une ressource économiquement importante en Guadeloupe.
L’objectif de ce travail était de déterminer et d’approfondir la compréhension des
effets du chlordécone, et plus largement des composés perturbateurs endocriniens, chez le
crustacé décapode, Macrobrachium rosenbergii, lors d’expositions en laboratoire et in
situ. Les mécanismes d’accumulation et d’élimination du chlordécone, ainsi que sa
distribution dans les différents compartiments anatomiques de M. rosenbergii ont été
évalués grâce à des mesures de concentration dans les tissus des organismes exposés. Les
effets du chlordécone sur l’hormone de mue et sur une des enzymes impliquées dans la
dégradation de la cuticule ont ensuite été étudiés à travers le dosage de la 20hydroxyecdysone (20-HE) et la mesure de l’activité la chitobiase. Les effets du
chlordécone sur une molécule impliquée dans le processus de reproduction ont également
été évalués au moyen de l’analyse des modifications d’expression du gène de la
vitellogénine ainsi que de celle de son récepteur. Enfin, l’effet du chlordécone sur le
protéome de M. rosenbergii a été étudié à travers l’analyse des modifications d’expression
des protéines des organismes exposés au chlordécone.
Les résultats ont montré que le chlordécone présent dans le milieu aquatique
s’accumule rapidement dans les organismes qui y vivent. Le chlordécone se répartit
ensuite dans les différents organes et compartiments anatomiques des individus exposés.
En outre, une diminution des concentrations en chlordécone a été mise en évidence dans
les tissus de M. rosenbergii lors de l'expérience de dépuration. Les résultats suggèrent
également que le chlordécone pourrait interférer avec la croissance et le développement
des crustacés, à travers la perturbation de deux molécules clés (la 20-HE et la chitobiase)
impliquées dans le processus de mue. Ainsi, il pourrait avoir une activité anti-ecdystéroïde.
Le chlordécone pourrait également interagir avec la reproduction de M. rosenbergii, à
travers la perturbation de l’expression du gène de la vitellogénine et de celle de son
récepteur qui sont des molécules clés impliquées dans ce processus. Enfin, l’analyse
protéomique a permis de mettre en évidence la modification de l’expression de plusieurs
protéines impliquées dans des processus physiologiques essentiels, tels que le la
détoxication, ainsi que la reproduction et la croissance, induite par une exposition au
chlordécone.
Ce travail a permis de confirmer l’importante capacité du chlordécone à s’accumuler
dans les tissus de M. rosenbergii, mais également la capacité d’élimination du chlordécone
par les organismes contaminés. Des futures études pourraient être réalisées en se focalisant
sur cette capacité de dépuration des crustacés et essayer de déterminer par quels
mécanismes les organismes sont capables d’éliminer le chlordécone présent dans leurs
tissus. En outre, les résultats obtenus en laboratoire et in situ étaient similaires et
permettent de montrer que l’expérience menée en laboratoire a reflété les conditions
naturelles observées in situ. Ce travail a également permis de mettre en évidence les
caractéristiques de dérégulation endocrinienne du chlordécone chez les crustacés, à travers
ses effets sur des molécules clés impliquées dans les processus de mue et de reproduction.
Cependant, quelles que soient les approches utilisées, aucun mécanisme d’action n’a pu
être réellement élucidé. D’autres investigations sont donc nécessaires afin de mettre en
évidence les voies métaboliques perturbées par l’exposition de M. rosenbergii au
chlordécone, en se concentrant sur des molécules clés telles que les hormones peptidiques
(MIH, GIH,…) ou sur des récepteurs clés tels que les récepteurs des ecdystéroïdes (EcRs).
Abstract
Endocrine disrupting compounds are chemicals that interfere with the endocrine
system of exposed organisms, at very low levels. They may act through various
mechanisms and at different stages of signaling pathways of hormones. Chlordecone is an
organochlorine compound considered as a strong endocrine disruptor due to its ability to
bind to estrogen receptors in vertebrates. Some recent studies also report the impact of
chlordecone on the endocrine system in invertebrates. Chlordecone is an organochlorine
insecticide widely used in Guadeloupe (French West Indies), from 1972 to 1993, to control
the banana weevil Cosmopolites sordidus (Germar, 1824).. In the late 70’s, widespread
pollution of soils, rivers, wildlife and aquatic organisms was observed. The use of
chlordecone has been prohibited in 1993 because of its toxicity and persistence in the
environment. A number of restrictions were established to limit the exposure of the human
population. The Maximum Residue Limit (MRL) of 20 micrograms of chlordecone per
kilogram of fresh weight in food of animal and plant origin was adopted. The adoption of
this norm has resulted in the closing of many aquaculture units due to the presence of
chlordecone in excess of the MRL in fish products. This contamination of aquaculture
products, has a serious impact on farming of the giant freshwater prawn, Macrobrachium
rosenbergii (De Man, 1879), which represents an economically important resource in
Guadeloupe.
The aim of this work was to improve the understanding of the effects of chlordecone,
and more widely of endocrine disrupting compounds in the decapod crustacean
Macrobrachium rosenbergii, through laboratory and in situ exposures. Mechanisms of
accumulation and elimination of chlordecone as well as its distribution in different
anatomical compartments of M. rosenbergii were assessed through measures of the
concentration in tissues of exposed organisms. The effects of chlordecone on 20hydroxyecdysone hormone (20-HE), the molting hormone, and on chitobiase, one of the
enzymes involved in the degradation of the cuticle were then. The effects of chlordecone
on vitellogenin, a molecule involved in the reproductive process, were also evaluated
through the analysis of its impact on gene expression of vitellogenin as well as that of its
receptor. Finally, the effect of chlordecone on the proteome of M. rosenbergii was studied
through the analysis of modifications of protein expression in organisms exposed to
chlordecone.
Results showed that chlordecone in the aquatic environment was rapidly accumulated
in organisms. Chlordecone is then distributed in various organs and anatomical
compartments of exposed individuals. In addition, a decrease in chlordecone
concentrations in M. rosenbergii tissues was highlighted in depuration experiment. Results
also suggest that chlordecone could interfere with the growth and development of
crustaceans, through disruption of two key molecules (20-HE and chitobiase) involved in
the molting process. Chlordecone could have an anti-ecdysteroidal activity. Moreover,
chlordecone could also interact with the reproduction of M. rosenbergii, through
disruption of the expression of the vitellogenin gene and that of its receptor, which are key
molecules involved in this process. Finally, proteomic analysis allowed to highlight the
impact of chlordecone on the expression of protein involved in important physiological
processes, such as detoxification, but also reproduction and growth.
This work allowed to show the important accumulation of chlordecone in tissues of
M. rosenbergii, but also the depuration capacity of organisms contaminated with
chlordecone. Further studies could focus on the crustacean depuration capacity in order to
determine the mechanisms by which organisms are able to eliminate chlordecone. In
addition, laboratory and in situ results were similar which shows that the laboratory
experiment carried out in this study reflected the natural conditions found in situ. This
work also allowed to highlight the potential interference of chlordecone with the endocrine
system of crustaceans through its effects on key molecules involved in the molting and
reproduction process. However, the approaches used in our work did not allow us to
describe the mechanism of action of chlordecone. Further investigations are needed to
highlight the metabolic pathways disrupted by exposure to chlordecone of M. rosenbergii,
focusing on key molecules such as peptide hormones (MIH, GIH ...) or key receptors such
as EcRs.
Table des matières
Chapitre 1 - Introduction générale
1
1. La Guadeloupe ......................................................................................................... 3
1.1 Le climat ............................................................................................................ 4
1.2 L’agriculture… ................................................................................................... 5
1.3 … et la culture de la banane ............................................................................... 5
1.3.1 Cosmopolites sordidus ......................................................................... 6
2. Utilisation des pesticides en Guadeloupe ............................................................... 7
3. Chlordécone .............................................................................................................. 8
3.1 Action du chlordécone en tant qu’insecticide .................................................... 8
3.2 Production et commercialisation ........................................................................ 9
3.3 Propriétés physico-chimiques ......................................................................... 11
3.4 Transport et distribution .................................................................................. 12
3.5 Persistance ....................................................................................................... 13
4. Contamination de la Guadeloupe .......................................................................... 14
4.1 Les zones contaminées en Guadeloupe ............................................................ 14
4.1.1 Lithosphère ........................................................................................ 14
4.1.2 L’hydrosphère ................................................................................... 17
4.1.3 L’atmosphère ..................................................................................... 19
4.1.4 La biocénose ....................................................................................... 19
4.1.5 Contamination et exposition humaine ................................................ 22
4.2 Réglementation et normes de qualité environnementale ................................. 23
4.3 Devenir du chlordécone .................................................................................. 27
5. Toxicité et perturbation endocrinienne ................................................................. 29
5.1 Bioaccumulation ............................................................................................. 29
5.2 Toxicité ............................................................................................................ 29
5.2.1 Chez les vertébrés............................................................................... 29
5.2.2 Chez les invertébrés .......................................................................... 31
5.3 Perturbation endocrinienne ............................................................................. 32
5.3.1 Chez les vertébrés .............................................................................. 33
5.3.2 Chez les invertébrés .......................................................................... 35
6. Le projet MACHLOMA ........................................................................................ 38
6.1 Contexte de crise des produits halieutiques ..................................................... 38
6.2 Objectifs du projet MACHLOMA .................................................................. 39
7. Macrobrachium rosenbergii ................................................................................... 41
7.1 Distribution ..................................................................................................... 41
7.2 L’élevage en Guadeloupe ................................................................................. 42
7.3 Caractéristiques morphologiques ..................................................................... 43
7.4 Diversité morphologique de l’espèce ............................................................... 44
7.5 Cycle de vie ...................................................................................................... 46
7.5.1 Reproduction ...................................................................................... 46
7.5.2 Mue ................................................................................................... 48
8. Système endocrinien des crustacés ........................................................................ 50
8.1 Contrôle hormonal de la mue .......................................................................... 54
8.2 Contrôle hormonal de la reproduction ............................................................. 57
8.2.1 Femelles ............................................................................................ 57
8.2.2 Mâles ................................................................................................. 60
Objectifs ................................................................................................................... 63
Chapitre 2 - Le projet MACHLOMA
65
1. Le parc aquacole .................................................................................................... 66
2. Protocole expérimental – Exposition en laboratoire ........................................... 70
2.1 Mise en place et acclimatation ......................................................................... 70
2.2 Exposition au chlordécone .............................................................................. 70
2.3 Prélèvements des organismes .......................................................................... 72
2.4 Pré-test : Détermination des conditions expérimentales en laboratoire ........... 74
2.4.1 Comportement du chlordécone dans l’eau sans M. rosenbergii ......... 74
2.4.2 Bioconcentration du chlordécone dans les tissus de M. rosenbergii .. 75
2.4.3 Comportement du chlordécone dans l’eau contenant des post-larves 76
3. Protocole expérimental - Exposition « in-situ » ................................................... 77
3.1 Choix des sites ................................................................................................. 77
3.2 Exposition au chlordécone .............................................................................. 78
3.3 Prélèvements des organismes .......................................................................... 78
3.4 Cinétique d’élimination du chlordécone par les organismes ........................... 79
Chapitre 3 - Publication 1
81
Bioaccumulation, distribution and depuration of chlordecone in the giant freshwater
prawn Macrobrachium rosenbergii: field and laboratory studies.
1. Introduction ............................................................................................................ 83
2. Materials and methods .......................................................................................... 86
2.1 Tested organisms .............................................................................................. 86
2.2 Short-term chlordecone exposure: laboratory experimental design ................. 86
2.3 Long-term chlordecone exposure: in situ experimental design ........................ 87
2.3.1 Depuration ......................................................................................... 88
2.4 Chlordecone concentrations in M. rosenbergii ................................................. 88
2.4.1 Chlordecone extraction from M. rosenbergii ..................................... 88
2.4.2 Sample purification ............................................................................ 89
2.4.3 Chromatography analysis ................................................................... 90
2.5 Statistical analysis ............................................................................................ 91
3. Results ...................................................................................................................... 92
3.1 Laboratory chlordecone exposure .................................................................. 92
3.1.1 Chlordecone in anatomical compartments ........................................ 94
3.2 In situ chlordecone exposure ........................................................................... 96
3.2.1 Anatomical compartments ................................................................. 97
3.2.2 Level of contamination according to the gender ............................... 97
3.3 Chlordecone depuration ................................................................................... 99
4. Discussion ............................................................................................................... 99
4.1 Accumulation of chlordecone in whole M. rosenbergii .................................. 99
4.1.1 Chlordecone in males and females M. rosenbergii ......................... 102
4.2 Chlordecone in the anatomical compartments of M. rosenbergii .................. 103
4.3 Depuration of chlordecone ............................................................................ 104
5. Conclusion ............................................................................................................ 105
Chapitre 4 - Publication 2
113
Effects of chlordecone on 20-hydroxyecdysone concentration and chitobiase activity in
a decapod crustacean, Macrobrachium rosenbergii.
1. Introduction .......................................................................................................... 115
2. Materials and methods ....................................................................................... 118
2.1 Tested organisms ............................................................................................ 118
2.2 Experimental design ....................................................................................... 118
2.3 Chlordecone concentration in exposure water and Macrobrachium
rosenbergii ..................................................................................................... 120
2.3.1 Chlordecone extraction from water .................................................. 120
2.3.2 Chlordecone extraction from muscle tissue ..................................... 121
2.3.3 Sample purifications ........................................................................ 121
2.3.4 Chromatography analysis ................................................................. 122
2.4 20-Hydroxyecdysone concentration ............................................................... 123
2.5 Chitobiase activity .......................................................................................... 125
2.6 Statistical analysis .......................................................................................... 125
3. Results .................................................................................................................... 126
3.1 Chlordecone concentrations in muscle tissue of M. rosenbergii .................... 126
3.2 20-Hydroxyecdysone concentration .............................................................. 128
3.3 Chitobiase activity ......................................................................................... 130
4. Discussion ............................................................................................................. 131
4.1 Chlordecone concentration ............................................................................. 131
4.2 Chlordecone effects on the 20-HE concentration ........................................... 133
4.3 Chlordecone effects on chitobiase activity ..................................................... 136
5. Conclusion ............................................................................................................ 137
Chapitre 5 - Publication 3
145
Vitellogenin and vitellogenin receptor gene expression and 20-hydroxyecdysone
concentration in Macrobrachium rosenbergii exposed to chlordecone.
1. Introduction .......................................................................................................... 147
2. Materials and methods ....................................................................................... 149
2.1 In situ chlordecone exposure and sampling .................................................... 149
2.2 Chlordecone concentration in Macrobrachium rosenbergii ........................... 151
2.3 20-Hydroxyecdysone concentration ............................................................... 152
2.4 Quantification of vitellogenin and vitellogenin receptor gene relative
expression levels ............................................................................................ 152
2.4.1 Total RNA extraction and cDNA synthesis ..................................... 152
2.4.2 Quantitative real-time PCR (RT-qPCR) ........................................... 153
2.5 Statistical analysis .......................................................................................... 154
3. Results and discussion .......................................................................................... 155
3.1 Chlordecone concentration in Macrobrachium rosenbergii........................... 155
3.2 20-hydroxyecdysone concentration ................................................................ 157
3.3 Expression of the vitellogenin gene ............................................................... 158
3.4 Expression of vitellogenin receptor gene ....................................................... 161
4. Conclusion ............................................................................................................. 164
Chapitre 6 - Publication 4
173
Proteomic analysis of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, exposed
to chlordecone.
1. Introduction .......................................................................................................... 175
2. Materials and methods ....................................................................................... 177
2.1 Tested organisms ............................................................................................ 177
2.2 Experimental design ....................................................................................... 178
2.3 Proteomic analysis .......................................................................................... 178
2.3.1 Extraction of protein fractions .......................................................... 178
2.3.2 Samples analyses on a nanoUPLC-SynaptTM HDMSTM G2
system ............................................................................................... 179
2.3.3 Identification of proteins and PLGS analysis ................................... 180
2.3.4 Analysis of PLGS results .................................................................. 180
3. Results .................................................................................................................... 181
3.1 Protein identification ...................................................................................... 181
3.2 Comparative analysis of proteins identified and involved in hormonal
process ............................................................................................................ 186
4. Discussion............................................................................................................... 187
4.1 Global overview ............................................................................................. 187
4.2 Altered proteins involved in reproduction and development processes ......... 190
4.2.1 Vitellogenin ...................................................................................... 190
4.2.2 Male reproductive tract specific kazal type protease inhibitor ......... 192
4.2.3 Farnesoic acid o-methyltransferase ................................................. 193
5. Conclusion ............................................................................................................ 194
Chapitre 7 - Synthèse et Discussion
203
Approche analytique ............................................................................................... 205
Approche immuno-enzymatique ............................................................................. 208
Approche transcriptomique .................................................................................... 214
Approche protéomique ........................................................................................... 220
Chapitre 8 - Conclusion et Perspectives
225
Références bibliographiques
231
Liste des figures et tableaux
Chapitre 1 - Introduction générale
Figure 1.1 - Localisation géographique de la Guadeloupe dans la mer des Caraïbes ....... 3
Figure 1.2 - Réseau hydrographique de la Guadeloupe .................................................... 4
Figure 1.3 - Culture de canne à sucre ............................................................................... 5
Figure 1.4 - Plant de bananier ........................................................................................... 5
Figure 1.5 - Charançon du bananier : Cosmopolites sordidus .......................................... 6
Figure 1.6 - Vue schématique d’un bananier .................................................................... 6
Figure 1.7 - Usage successif des différents types d’insecticides dans les cultures de
bananes (Caraïbe et Amérique centrale) (HCH = hexachlorocyclohexane,
DBCP = dibromochloropropane, HCH gamma = lindane) ........................... 7
Figure 1.8 - (A) Structure en cage du chlordécone (WHO, 1984). (B) Structure atomique
de la molécule, en rouge : l’oxygène, en gris : le carbone, en vert : le chlore
...................................................................................................................... 8
Figure 1.9 - Cartographie des activités agronomiques (haut) et de la contamination des
sols qui en a découlée (bas) ....................................................................... 15
Figure 1.10 - Pédologie simplifiée de la Basse-Terre (Guadeloupe) .............................. 16
Figure 1.11 - Cartographie de la contamination par les pesticides des eaux superficielles
de Guadeloupe ......................................................................................... 18
Figure 1.12 - Classement des produits cultivés en fonction de leur sensibilité au transfert
de chlordécone et teneurs limites du sol associées ................................... 20
Figure 1.13 - Concentration en chlordécone mesurée dans des algues, des mollusques, des
crustacés et des poissons provenant de la rivière Grande-Anse en fonction
du niveau tropique.................................................................................... 21
Figure 1.14 - Captages d’eau de consommation concernés par la contamination par le
chlordécone .............................................................................................. 22
Figure 1.15 - Modélisation de la rémanence du chlordécone (CLD) dans les différents
types de sols contaminés en Guadeloupe ................................................. 27
Figure 1.16 - Simulation de l’évolution des concentrations en chlordécone (CLD) de la
couche de surface des sols des bananeraies du sud de la Basse-Terre ..... 28
Figure 1.17 - Localisation des limites des zones marines étudiées autour de Guadeloupe.
Les zones terrestres en gris indiquent les sols contaminés par le
chlordécone .............................................................................................. 38
Figure 1.18 - Macrobrachium rosenbergii ..................................................................... 41
Figure 1.19 - Aire de distribution naturelle de Macrobrachium rosenbergii ................. 42
Figure 1.20 - Principaux pays producteurs de Macrobrachium rosenbergii .................. 42
Figure 1.21 - Morphologie externe de Macrobrachium rosenbergii .............................. 43
Figure 1.22 - Mâle (en haut) et femelle (en bas) M. rosenbergii .................................... 44
Figure 1.23 - Mâle « pinces oranges »............................................................................ 45
Figure 1.24 - Mâle "pinces bleues » ............................................................................... 46
Figure 1.25 - Cycle de vie de Macrobrachium rosenbergii aquatiques ......................... 47
Figure 1.26 - Vue latérale généralisée d'un malacostracé montrant les centres endocrines
primaires des crustacés ............................................................................. 50
Figure 1.27 - Structure chimique de l'ecdysone (A) et de sa forme active la 20hydroxyecdysone (B) ............................................................................... 52
Figure 1.28 - Contrôle hormonal de la mue par la MIH chez les crustacés .................... 54
Figure 1.29 - Concentration en ecdysone mesurées chez des daphnies (Daphnia magna)
juvéniles entre la première et la deuxième mue ....................................... 55
Figure 1.30 - Représentation schématique des principaux organes endocriniens et leurs
hormones sécrétées impliqués dans la mue des crustacés ........................ 56
Figure 1.31 - Représentation schématique des principaux organes endocriniens des
crustacés femelles, leurs hormones sécrétées ainsi que leurs actions ....... 59
Figure 1.32 - Représentation schématique des principaux organes endocriniens des
crustacés mâles et leurs hormones sécrétées ainsi que leurs actions ........ 60
Tableau 1.1 - Propriétés physico-chimique du chlordécone ........................................... 12
Tableau 1.2 - Normes de Qualité Environnementale (NQE) dans les cours d’eau et dans
l’eau de mer, ainsi que les normes autorisées dans les produits destinés à la
consommation humaine............................................................................ 26
Tableau 1.3 - Effets du chlordécone sur différentes espèces d’invertébrés .................... 31
Tableau 1.4 - Concentration létale pour 50 % de la population chez les crustacés ......... 32
Tableau 1.5 - Hormones impliquées dans la régulation de la différentiation sexuelle, du
développement, de la croissance, de la mue et de la reproduction chez les
crustacés ................................................................................................... 53
Chapitre 2 - Le projet MACHLOMA
Figure 2.1 - Localisation du parc aquacole de Pointe-Noire ........................................... 67
Figure 2.2 - Figure 2.2 - Bassins d’eau saumâtre de l’écloserie du parc aquacole de
Pointe-Noire ................................................................................................ 68
Figure 2.3 - Etangs d’élevage du parc aquacole de Pointe-Noire .................................. 68
Figure 2.4 - Post-larves de M. rosenbergii utilisées pour les expériences d’exposition au
chlordécone ................................................................................................. 70
Figure 2.5 - Représentation schématique de la répartition des aquariums et des conditions
expérimentales en laboratoire. C0 correspond à la condition « témoin », C1
à 0.02 µg L-1, C2 à 0.2 µg L-1, C3 à 2 µg L-1, C4 à 20 µg L-1, et TA à la
condition « témoin acétone » ..................................................................... 71
Figure 2.6 - Photographie de la mise en place de l'expérimentation en laboratoire ........ 71
Figure 2.7 - Localisation des deux rivières qui alimentent les bassins de Pointe-Noire et
de Saint-Claud .......................................................................................... 77
Tableau 2.1 - Résultats des mesures des concentrations en chlordécone dans plusieurs
« pools » de post-larves provenant de l’écloserie de Pointe-Noire. ............ 69
Tableau 2.2 - Nombre de M. rosenbergii prélevés dans chacune des 6 conditions, à chaque
temps de prélèvement et pour chaque approche expérimentale ............... 73
Tableau 2.3 - Concentrations en chlordécone (µg L-1) mesurées lors du pré-test dans l’eau
des différents aquariums ne contenant pas de M. rosenbergii et prélevée à
différents temps. ....................................................................................... 74
Tableau 2.4 - Concentrations en chlordécone mesurées lors du pré-test dans des pools de
M. rosenbergii (en ng g-1 de poids frais) exposés à 0.02, 0.2, 2 et 20 µg L-1
de chlordécone et prélevés à différents temps d’exposition ..................... 75
Tableau 2.5 - Concentrations en chlordécone (en µg L-1) mesurées dans l’eau prélevée
dans les aquariums contenant les post-larves de M. rosenbergii exposés aux
4 concentrations en chlordécone et prélevée à différents temps d’exposition
................................................................................................................. 76
Tableau 2.6 - Paramètres mesurés dans l’eau des deux bassins utilisée pour l’expérience
d’exposition in-situ. ................................................................................. 78
Tableau 2.7 - Nombre de M. rosenbergii prélevés dans chacun des deux bassins (P.-N. =
Pointe-Noire, S.-C. = Saint-Claude), à chaque temps de prélèvement et
pour chaque approche expérimentale ....................................................... 79
Chapitre 3 – Approche analytique
Figure 3.1 - Chlordecone concentrations (ng g-1 wet weight, mean + S.D.) measured in
whole Macrobrachium rosenbergii exposed to four chlordecone
concentrations (i.e. 0.02, 0.2, 2 and 20 µg L-1) in laboratory experiment and
sampled after eight exposure durations. ...................................................... 92
Figure 3.2 - Distribution of chlordecone in the four anatomical compartments (internal
organs within the cephalothorax, mainly the hepatopancreas, cephalothorax
cuticle, abdominal muscle and abdominal cuticle) related to CLD body
burden of M. rosenbergii. The CLD quantity measured in each anatomical
compartment were represented by a percentage of the total quantity (i.e. CLD
body burden) measured in all the anatomical compartments of M.
rosenbergii. (A) Prawns exposed to 0.2 µg L-1 of chlordecone during the
laboratory experiment and sampled after eight exposure durations. The
distribution profiles were similar for prawns exposed to 0.02, 2 and 20 µg L 1
of CLD. (B) Prawns exposed to chlordecone during the field experiment in
the contaminated site (Saint-Claude pond) and sampled after four exposure
durations. (C) Male and female prawns exposed to chlordecone during the
field experiment in the contaminated site (Saint-Claude pond) and sampled
after 5, 7 and 8 months of exposure.Paramètres mesurés dans l’eau des deux
bassins utilisée pour l’expérience d’exposition in-situ. .............................. 94
Figure 3.3 - Chlordecone concentrations (ng g-1 wet weight, mean + S.D.) measured in
whole Macrobrachium rosenbergii sampled in the control site in PointeNoire and in the contaminated site in Saint-Claude after seven exposure
durations. Different letters above the bars indicate significantly different
values for the concentrations measured in Saint-Claude (Tukey’s HSD test,
p-values < 0.05). ......................................................................................... 96
Figure 3.4 - Chlordecone concentrations (ng g-1 wet weight, mean + S.D.) measured in
whole males, nonovigerous females, and ovigerous females sampled in the
contaminated site in Saint-Claude after 5, 7 and 8 months of exposure. In
addition, chlordecone concentration was measured in mass eggs of ovigerous
females. Different letters above the bars indicate significantly different
values for each sampling time (Tukey’s HSD test, p-values < 0.05). ......... 98
Figure 3.5 - Accumulation and depuration of chlordecone (ng g -1 wet weight ± S.D.) in
whole Macrobrachium rosenbergii, placed in water free from contamination
after 8 months (240 days) of exposure in the Saint-Claude pond. .............. 99
Table 3.1 – Parameters of the logarithmic regressions which express relation between
CLD concentrations and exposure durations .............................................. 93
Table 3.2 - Bioconaccumulation factor (L Kg-1) calculated at the end of experiment for
the four concentrations of exposure (i.e. 0.02, 0.2, 2 and 20 µg L -1) during
the laboratory experiment (A) and for the contaminated pond during the in
situ experiment (B). CLD concentrations were not measured in the water of
control tanks, nor in the water of Pointe-Noire pond. Nombre de M.
rosenbergii prélevés dans chacun des deux bassins (P.-N. = Pointe-Noire, S.C. = Saint-Claude), à chaque temps de prélèvement et pour chaque approche
expérimentale .............................................................................................. 93
Table 3.3 - CLD concentrations (ng g-1 wet weight) measured in the four anatomical
compartments (internal organs within the cephalothorax, mainly the
hepatopancreas, cephalothorax cuticle, abdominal muscle abdominal cuticle,
and the sum of concentrations from both types of cuticle) of M. rosenbergii
exposed to 0.2 µg L-1 of chlordecone during the laboratory experiment (A)
and during the field experiment in the contaminated site (Saint-Claude pond)
(B) ............................................................................................................... 95
Table 3.4 - Chlordecone concentrations (ng g-1 wet weight) measured in whole M.
rosenbergii exposed in the field and in the laboratory (0.2 µg L-1) and
sampled after 8, 15 and 30 days of exposure. ............................................. 97
Chapitre 4 – Approche immuno-enzymatique
Figure 4.1 - Positive correlation between CLD bconcentration measured in the muscle
tissue of M. rosenbergii and CLD concentrations in water of exposure (p <
0.001, r = 0.49, n = 100), taking into account all duration of exposure. ... 126
Figure 4.2 - 20-HE concentrations (pg g-1; mean ± S.D.) in the muscle tissue of M.
rosenbergii exposed at four concentrations of CLD and sampled at four times
of exposure. Different letters above the bars indicate significantly different
values for each sampling time (Tukey’s HSD test, p-values < 0.05). ....... 128
Figure 4.3 - Logarithmic correlation between log-transformed CLD concentration and the
20-HE concentration represented by circles, as well as the correlation
between the log-transformed CLD concentrations and chitobiase activity
represented by triangles in the muscle tissue of M. rosenbergii sampled after
1 day (A), 4 days (B), 15 days (C) and 30 days (D) of exposure .............. 129
Figure 4.4 - Chitobiase activity (µmol MUF hydrolysed.h-1; mean ± S.D.) in the muscle
tissue of M. rosenbergii exposed at four concentrations of CLD and sampled
at four times of exposure. Different letters above the bars indicate
significantly different values for each sampling time (Tukey’s HSD test, pvalues < 0.05). .......................................................................................... 130
Table 4.1 - Chlordecone concentration (mean ± S.D.) measured in water of exposure.
LOQ means limit of quantification (0.01 ng L-1).Chlordecone concentrations
(ng g-1 wet weight) measured in whole M. rosenbergii exposed in the field
and in the laboratory (0.2 µg L-1) and sampled after 8, 15 and 30 days of
exposure. ................................................................................................... 123
Table 4.2 - CLD concentration (mean ± S.D.) measured in the muscle tissue of M.
rosenbergii exposed at four concentrations of CLD and sampled at four times
of exposure. LOD means limit of detection (0.02 ng g-1 wet weight) and LOQ
means limit of quantification (0.06 ng g-1 wet weight). Different letters
indicate significantly different values for each CLD concentration of
exposure. Tukey’s HSD test was performed with the log-transformed CLD
concentration (p-values < 0.05). ............................................................... 127
Chapitre 5 – Approche transcriptomique
Figure 5.1 - 20-HE concentrations (pg g-1; mean ± S.D.) in hepatopancreas of males and
females M. rosenbergii, sampled after 90 and 240 days of exposure in control
and chlordecone-contaminated sites. Different letters above the bars indicate
significant differences for each duration of exposure (Tukey’s HSD test, pvalues < 0.05). .......................................................................................... 157
Figure 5.2 - Relative Transcript Levels (RTL) of the Vg gene in hepatopancreas of males
(A) and females (B) M. rosenbergii, sampled after 90 and 240 days of
exposure in control and chlordecone-contaminated sites. Expression levels
are relative to rRNA 18S and are the average of 10 replicates (means ± SE).
Different letters above the bars indicate significant differences for each
duration of exposure (Tukey’s HSD test, p-values < 0.05)....................... 159
Figure 5.3 - Relative Transcript Levels (RTL) of the VgR gene in gonads of males (A)
and females (B) M. rosenbergii sampled after 90 and 240 days in control and
chlordecone-contaminated sites. Expression levels are relative to rRNA 18S
and are the average of 10 replicates (means ± SE). Different letters above the
bars indicate significant differences for each duration of exposure (Tukey’s
HSD test, p-values < 0.05). ....................................................................... 162
Table 5.1 - Water parameters of Pointe-Noire (control site) and Saint-Claude
(contaminated site) measured during the 240 days of exposure ............... 150
Table 5.2 - Sequences and reaction efficiencies of each primer pair for each of the studied
genes ......................................................................................................... 153
Table 5.3 - Univariate and multivariate analyses of variance (ANOVA/MANOVA)
investigating variations in vitellogenin (Vg) and vitellogenin receptor (VgR)
gene expressions and 20-HE concentrations according to chlordecone
exposure (CLD), gender and duration of exposure. .................................. 155
Table 5.4 - CLD concentrations (mean ± S.D.), on a wet weight basis, measured in M.
rosenbergii sampled in the control (Pointe-Noire) and the contaminated site
(Saint-Claude), as well as in post-larvae, before the transfer in each farming
pond (T0). Asterisks indicate significantly different values of CLD
concentrations between control and contaminated samples. LOD means limit
of detection. .............................................................................................. 156
Chapitre 6 – Approche protéomique
Figure 6.1 - Venn diagram of total proteins with at least 1.5-fold expression change and
significantly identified in hepatopancreas of M. rosenbergii exposed for 30
days to the three chlordecone concentrations ............................................ 181
Figure 6.2 - Graphical view representing the percentage of proteins within each functional
category as a function of the total protein number with at least 1.5-fold
expression change and significantly identified in hepatopancreas of M.
rosenbergii exposed to chlordecone. ......................................................... 182
Figure 6.3 - The 4 proteins involved in hormonal process and whose abundance was
modified in M. rosenbergii exposed to CLD as compared to control. The 3
conditions of exposure were represented by the concentrations (i.e. 0.2 means
0.2 µg L-1, 2 means 2 µg L-1, 20 means 20 µg L-1). Vg = Vitellogenin;
MRPINK = Male reproductive tract specific kazal type proteinase inhibitor;
MSG = Sperm gelatinase; FAMeT = Farnesoic acid o-methyltransferase. The
asterisk represents a statistically significant difference compared to controls.
.................................................................................................................. 186
Table 6.1 - Proteins with at least 1.5-fold changes, in at least one exposure condition, in
hepatopancreas of M. rosenbergii exposed for 30 days at 0.2, 2 and 20 µg L1
of CLD, and significantly identified (p ≤ 0.05 for downregulated proteins,
p ≥ 0.95 for upregulated proteins) with the Uniprot Crustacea database.
PLGS Score = Score of protein identification calculated by PLGS (high score
means high confidence of identification). ................................................. 183
Chapitre 7 – synthèse et discussion
Figure 7.1 - Hypothèses concernant l’action du chlordécone sur le contrôle hormonal de
la mue chez les crustacés. Les chiffres correspondent aux numéros des
hypothèses. CLD = chlordécone, MIH = Molt Inhibiting Hormone, MOIH =
Mandibular Organ Inhibiting Hormone, GIH = Gonad Inhibiting Hormone,
VIH = Vitellogenesis Inhibiting Hormone, GSH = Gonad Stimulating
Hormone, VSH = Vitellogenesis Stimulating Hormone ........................... 210
Figure 7.2 - Activité de la chitobiase mesurée chez les mâles et les femelles M. rosenbergii
échantillonnés après 90 et 240 jours dans les bassins témoin et contaminé.
Les différentes lettres indiquent les différences significatives dans chaque
conditions (Test HSD de Tuckey p<0.05) ................................................ 212
Figure 7.3 - Contrôle hormonal de la mue par la MIH chez les crustacés exposés au
chlordécone (d’après Zou, 2005 dans Leroy, 2010) ................................. 213
Figure 7.4 - Relation entre génomique, transcriptomique, protéomique et métabolomique
.................................................................................................................. 214
Figure 7.5 - Hypothèses concernant l’action du chlordécone sur le contrôle hormonal de
la reproduction chez les crustacés femelles. CLD = chlordécone, MIH = Molt
Inhibiting Hormone, MOIH = Mandibular Organ Inhibiting Hormone, GIH
= Gonad Inhibiting Hormone, VIH = Vitellogenesis Inhibiting Hormone,
GSH = Gonad Stimulating Hormone, VSH = Vitellogenesis Stimulating
Hormone. .................................................................................................. 217
Figure 7.6 - Hypothèses concernant l’action du chlordécone sur le contrôle hormonal de
la reproduction chez les crustacés mâles. CLD = chlordécone, MIH = Molt
Inhibiting Hormone, MOIH = Mandibular Organ Inhibiting Hormone, GIH
= Gonad Inhibiting Hormone, GSH = Gonad Stimulating Hormone, AGH =
Androgenic Gland Hormone ..................................................................... 218