Le rôle du mésoderme somitique dans la

J. Embryol. exp. Morph. Vol. 23, 1, pp. 109-151, 1970
Printed in Great Britain
109
Le rôle du mésoderme
somitique dans la morphogenèse précoce des
membres de l'embryon de Poulet
Par M A D E L E I N E P I N O T 1
Institut d''Embryologie Expérimentale du C.N.R.S., Nogent-sur-Marne,
France (Directeur : Professeur Et. Wolff)
La morphogenèse des membres a fait l'objet de nombreux travaux chez
l'embryon de Poulet. Les recherches récentes concernent surtout les processus
intervenant après l'apparition de l'ébauche du membre, et conduisant à sa
morphologie définitive. Le premier stade de développement du membre consiste
en une condensation localisée du mésoderme de la somatopleure. Par la suite
seulement, l'ectoderme sus-jacent acquiert un aspect morphologique particulier:
une crête épaissie à l'extrémité distale. Les causes de la condensation initiale du
mésoderme ne sont pas connues. Le rôle déterminant du constituant mésodermique comme initiateur du développement du membre a été clairement mis en
évidence par Kieny (1959, 1960). Le constituant mésodermique isolé, greffé sous
l'ectoderme du flanc, peut induire la formation d'une crête apicale dans l'ectoderme sus-jacent, et provoquer ainsi le développement d'un membre surnuméraire. A quel moment et sous quelles influences le mésoderme acquiert-il cette
propriété ?
Nous nous sommes demandé d'abord à quel stade le territoire du membre
isolé pouvait effectuer son Organogenese de manière 'autonome. Ce problème a
été évoqué par plusieurs auteurs. Hamburger (1938) a greffé dans le flanc d'embryons de 3 jours, des bourgeons d'aile et de patte, isolés au stade de 25 à 34 paires
de somites (50-64 h d'incubation). Le tiers environ des greffons s'est développé;
les membres obtenus étaient normaux. Des résultats comparables ont été obtenus
récemment par Murillo-Ferrol (1965). L'auteur a greffé dans le flanc, entre aile
et patte, au stade 11 à 18 de Hamburger & Hamilton (1951), des ébauches de
membres de même âge. Le greffon ne donne naissance à un membre normal
que s'il est prélevé sur un embryon du stade 17 (H. & H.) au moins (29 à 32
paires de somites).
Mais on a observé le développement d'un membre à partir de matériel
beaucoup plus jeune. (Rudnick, 1942, 1945) a greffé dans le cœlome d'embryons
1
Adresse de routeur: Institut d'Embryologie Expérimentale du C.N.R.S., 49 bis Avenue
de la Belle-Gabrielle, 94-Nogent-sur-Marne, France.
110
M. PINOT
de 3 jours des portions définies de blastoderme, prélevées entre le stade de la
ligne primitive et 15 paires de somites. Des membres reconnaissables, ailes ou
pattes, se sont développés à partir de fragments de blastoderme de 0 à 5 paires
de somites. Une étude histologique des greffons a révélé que, en plus du squelette
et des muscles, de nombreuses structures se sont formées: tube nerveux,
ganglions, mesonephros, gonade, intestin. C'est donc une partie importante du
blastoderme qui a été greffée. En 1959, Chaube a obtenu la différenciation de
l'aile à partir de territoires prélevés sur des embryons de quatre paires de
somites au moins, et greffés en avant ou en arrière de l'ébauche de l'aile, sur des
embryons de 3 jours. Aucune étude histologique n'a été faite. Au stade de quatre
paires de somites, le territoire de l'aile ne peut être isolé de façon précise.
Les auteurs cités ont abouti à des conclusions assez différentes. Ces divergences sont dues sans doute en partie aux techniques diverses utilisées. Mais
elles peuvent s'expliquer également par les difficultés qu'on rencontre pour
isoler précocement le territoire de membre. Les tissus voisins semblent avoir
une influence importante sur le développement du membre. Nous avons repris
le problème. Nous avons cherché à savoir : (i) à quel stade le territoire de membre
isolé peut se différencier de manière autonome; (ii) si un tissu voisin, le mesenchyme axial, associé à l'ébauche présomptive du membre joue un rôle dans cette
différenciation.
MATERIEL ET METHODES
Nous nous sommes adressé à l'embryon de Poulet {Gallus gallus) de la race
Leghorn blanche. Dans une série expérimentale, nous avons utilisé également
l'embryon de Caille {Coturnix coturnix Japonica). Les expériences sont faites sur
des embryons de 7 à 44 paires de somites (stades 9 à 21 de Hamburger & Hamilton: 30 h à 3^ jours d'incubation.)
Coupes transversales de blastodermes, au niveau de l'aile,
après prélèvement de l'une des ébauches.
Fig. 1. Embryon de 29 paires de somites. Coupe transversale au niveau de la région
postérieure de l'ébauche de l'aile.
Fig. 2. Embryon de 24 paires de somites. Coupe transversale au niveau de la région
médiane de l'aile. La somatopleure seule est prélevée.
Fig. 3. Embryon de 16 paires de somites. Coupe transversale en arrière du 16e
somite. La pièce intermédiaire est visible. Les trois feuillets embryonnaires sont
excisés; un fragment de la somatopleure est resté en place (flèche).
Fig. 4. Embryon de neuf paires de somites. Coupe transversale au niveau présomptif
de l'aile. Le feuillet mésodermique est homogène: rien ne permet de distinguer les
régions somitique, intermédiaire, et latérale. Le prélèvement a été fait à petite distance
du tube nerveux.
t.n. = tube nerveux, ch. = chorde, m.s. = mesenchyme somitique, c. W. = canal
de Wolff, som. = somatopleure, m.i. — feuillet mésodermique indifférencié,/?./. =
pièce intermédiaire. Coloration: glychémalun-éosine.
La morphogenèse précoce des membres
111
&^*4^
+s±i
100//
I
I
112
M. P I N O T
A. Localisation et prélèvement des ébauches des membres
L'ébauche de l'aile apparaît vers la 50-55ème h de l'incubation, au niveau
des somites 15 à 20, sous forme d'une condensation du mésoderme de la somatopleure. Le bourgeon d'aile est parfaitement individualisé au stade de 35 paires de
somites: il se trouve alors au niveau des somites 16 à 20 (Saunders, 1948a).
L'ébauche de la patte est peu visible avant le stade de 30 paires de somites.
Lorsque l'embryon a 35 paires de somites, le bourgeon, au niveau des somites
26 à 32 est aussi développé que celui de l'aile. Le territoire présomptif des membres a pu être localisé dans une région définie du blastoderme dès le premier
stade de la segmentation somitique.
Le territoire ou Vébauche de Vaile a été prélevé aux stades de 7 à 44 paires de
somites. Une étude histologique de 35 embryons de 7 à 30 paires de somites,
fixés après le prélèvement nous a permis d'évaluer les potentialités du territoire
excisé aux différents stades.
Antéropostérieurement: les limites antérieure et postérieure du territoire
présomptif de l'aile ne peuvent être précisées chez des embryons de moins de
15 paires de somites; avant ce stade, elles sont appréciées par référence au dernier
somite formé et au nœud de Hensen, d'après les cartes d'ébauches dues à Wolff
(1936), Rudnick (1945) et Chaube (1959).
En profondeur: chez les embryons de plus de 23 paires de somites, seule la
somatopleure est prélevée, au niveau de l'aile (fig. 1, 2). Avant ce stade, les
trois feuillets embryonnaires sont excisés (fig. 3,4) ; cette région correspond, pour
le feuillet endodermique, au territoire présomptif de l'intestin grêle (Le Douarin,
1965).
Latéralement: chez les embryons de plus de 15 paires de somites, la limite
entre le mesenchyme somitique, intermédiaire et latéral est nette; au stade de
15 à 20 paires de somites, on excise dans quelques cas, une partie de la pièce
intermédiaire; le plus souvent, au contraire, une frange interne du mésoderme
latéral est laissée en place (fig. 3).
Sur les embryons de moins de 15 paires de somites, le feuillet mésodermique,
au niveau présomptif de l'aile, n'est pas différencié en régions somitique, intermédiaire et latérale (fig. 4). On prélève alors un fragment de ce feuillet mésodermique indifférencié, avec l'ectoderme et l'endoderme, au ras du tube nerveux
ou à petite distance de celui-ci, au niveau présomptif de l'aile.
Le territoire de la patte est excisé aux stades de 10 à 44 paires de somites.
Situé au niveau des somites 26 à 32, ses limites antéro-postérieures ne peuvent
être précisées avant le stade de 25 paires de somites. La limite entre le mésoderme latéral et le mésoderme intermédiaire et somitique est nette dans cette
région à partir du stade del 8 à 20 paires de somites. Chez les embryons de 10 à 17
paires de somites, on prélève l'aire présomptif de la patte au ras du tube nerveux.
Notons que d'autres ébauches squelettiques sont présentes dans le mésoderme de la somatopleure. Différents auteurs (Fell, 1939; Saunders, 1948 A;
La morphogenèse précoce des membres
113
Seno, 1961) s'accordent à localiser l'ébauche sternale, chez les Oiseaux, au
niveau des somites 17^—18 à 21^—22. Le territoire sternal sera donc toujours en
partie prélevé avec le territoire de l'aile. Les côtes se forment au niveau des
somites 19 à 26. Mais nous avons pu montrer (Pinot, 1969 a) que le matériel
costal, d'origine somitique, ne pénètre dans la plaque latérale qu'après la 50e h
de l'incubation. Le matériel des côtes ne sera donc pas dans le mésoderme
latéral chez les embryons de moins de 22 paires de somites.
B. Association expérimentale de deux ébauches embryonnaires
(1) Association de deux territoires présomptifs de membre
Deux ébauches de l'aile sont associées sur un milieu de culture, de manière
que les deux faces ectodermiques se trouvent à l'extérieur. Elles sont maintenues
accolées pendant 2 à 5 min. Greffé, l'ensemble évolue sans se dissocier. Le milieu
de culture utilisé est le milieu gélose de Wolff & Haffen (1952).
(2) Association de mesenchyme axial et plaque latérale
Pour que les conditions expérimentales soient réalisées, l'association doit
être faite de façon que les rapports entre les deux tissus soient comparables à
ce qu'ils sont dans l'embryon. La surface d'association est donc extrêmement
réduite: elle correspond à l'épaisseur de la somatopleure. Un accolement de
quelques minutes sur un milieu de culture ne suffit pas. Si l'on prolonge la
culture pendant les 8 à 10 h nécessaires pour que l'association soit réalisée, le
développement en greffe est compromis.
Deux techniques ont été utilisées :
Technique 1 : association sur un fragment de peau. Un fragment de peau
d'embryon de Poulet est placé sur un milieu de culture, derme en haut; les deux
ébauches sont placées côte à côte sur le derme, auquel elles adhèrent. Les
surfaces à associer sont ainsi maintenues en contact. Après 15 à 20 min sur le
milieu de culture, l'ensemble est greffé.
Technique 2: association en culture de blastoderme. Le blastoderme est cultivé
selon la méthode de Wolff & Simon (1955). Une bande de mesenchyme axial
(intermédiaire et somitique) est prélevée sur un autre embryon et greffée entre
le mesenchyme axial et la plaque latérale ou à la place du mesenchyme axial du
blastoderme, à un niveau choisi. Après 8 à 10 h de culture, le greffon et la
région de la plaque latérale qui lui est associée sont prélevés ensemble et
greffés.
C. Greffes cœlomiques
Cette technique a été utilisée pour étudier le développement d'ébauches qui
venaient d'être prélevées, ou d'ébauches associées selon les méthodes précédemment décrites. Une incision est pratiquée à l'aide d'une aiguille de verre dans
la somatopleure en arrière des artères omphalomésentériques, sur un embryonhôte de 3 jours d'incubation. Le greffon est introduit dans le cœlome où il est
114
M. P I N O T
rapidement irrigué. Le plus souvent, le greffon se développe sans liaisons
tissulaires avec les parois de la cavité cœlomique. Il n'est attaché à l'hôte que
par un pédoncule conjonctif dans lequel passent les vaisseaux qui l'irriguent.
D. Marques colorées
Les expériences de marquage ont été faites in vivo. Nous avons utilisé de fines
particules de charbon animal mouillées par de l'albumine, ou de l'encre de Chine
réduite à l'état de pâte par evaporation. La membrane vitelline et l'amnios sont
incisés au niveau où la marque doit être faite. Une aiguille de verre est introduite
à la limite extérieure du mesenchyme somitique, à un niveau précis. Elle est
ensuite retirée, trempée dans l'une des préparations décrites, et introduite à
nouveau au même endroit. Les particules colorées sont ainsi déposées le long
de la blessure. Plusieurs marques peuvent être faites sur le même embryon. La
cicatrisation est rapide. Le développement n'est jamais perturbé par cette intervention.
E. Dépouillement des résultats
(1) Techniques histologiques. Le fixateur utilisé est le liquide de Bouin. Les
coupes histologiques, de 5 à 7 /i d'épaisseur, sont colorées à l'hématoxyline ou
glychémalun-éosine, au bleu alcian ou au bleu de toluidine.
(2) Coloration du squelette. L'étude du squelette a été faite après coloration
en masse par le bleu de toluidine, et éclaircissement dans un mélange à parties
égales de benzoate de benzyle et de benzène. Une telle technique a été préconisée par Lundvall (1927), pour la mise en évidence du squelette cartilagineux.
Dans un certain nombre de cas, nous avons utilisé les deux techniques successivement: après étude du squelette, le matériel est inclus, coupé et soumis à
une étude histologique.
I. ROLE D U MESENCHYME AXIAL DANS LE DEVELOPPEMENT
DE L'AILE
A. Technique
L'ébauche de l'aile isolée (A), ou l'ébauche prélevée avec le mesenchyme
axial adjacent (A + MA) (fig. 5), est greffée dans le cœlome d'un embryon-hôte
de 3 jours d'incubation. On autopsie les embryons-hôtes 8 jours après la greffe, et
on élimine tous les greffons mal irrigués, ou attachés aux parois du corps. Les
greffons étudiés sont retrouvés reliés aux viscères par de fines connexions
conjonctives dans lesquelles passent les vaisseaux sanguins. Ils n'ont donc pas
été soumis, au cours de leur développement, à l'influence directe des tissus de
l'hôte, en particulier de son mesenchyme axial. De plus, ils sont parfaitement
délimités et l'étude en est plus facile. On classe d'abord les greffons d'après leur
aspect morphologique. Ces premiers résultats sommaires sont complétés par
des examens du squelette et une étude histologique.
La morphogenèse précoce des membres
115
A + MA
Fig. 5. D'un côté le territoire de l'aile est seul prélevé (A) au niveau des somites 15 à
20; de l'autre côté, le territoire de l'aile est prélevé avec le mesenchyme axial (somitique et intermédiaire) adjacent ( A + M A ) . Chacun des deux fragments est ensuite
greffé dans la cavité coelomique d'un embryon-hôte de 3 jours d'incubation.
Tableau 1. Rôle du mesenchyme axial dans le développement de F aile:
étude morphologique externe
A: territoire de l'aile isolé
A + M A : territoire de
l'ai le + mesenchyme axial
A
t
Stade de
l'embryon donneur
N ombre total de
cas étudiés
30-44 paires de somites
26
25-29 paires de somites
25
15-24 paires de somites
Ailes
Nombre te tal de
cas étud iés
Ailes
—
—
27
62
23
(88,4 %)
15
(60 %)
0
10-14 paires de somites
—
—
24
22
(81,4%)
42
(82,3 %)
15
(62,5 %)
7-9 paires de somites
—
—
16
8
51
0
EM B 23
116
M. PINOT
B. Résultats morphologiques : le développement de Vaile
Ces résultats sont groupés dans le tableau 1.
(1) Greffe de bourgeons d'aile prélevés au stade de 30 à 44 paires de somites
{stades 17 à 21 de Hamburger & Hamilton). Cette série expérimentale a été
réalisée pour apprécier les possibilités et le rendement de la technique. Trentesix greffes de ce type ont été faites; 32 embryons sont vivants au moment de
l'autopsie; on a pu retenir 26 greffons. Dans trois cas, le greffon est arrondi,
recouvert de germes plumaires. Les 23 autres greffons (88,4 %) sont des ailes
(fig. 6). Leur taille et leur aspect sont normaux et correspondent à leur âge réel
(10-11 jours). Dans un cas seulement, l'autopode, gêné dans son développement,
s'est anormalement coudé. Cette technique permet donc au territoire greffé de
réaliser dans de bonnes conditions ses potentialités.
(2) Greffé du territoire de Vaile, prélevé avec ou sans le mesenchyme axial
adjacent, sur des embryons de 15 à 29paires de somites {stades 12à 17 de H. & H.).
A partir du stade de 15 paires de somites, le territoire présomptif de l'aile peut
être prélevé sans mesenchyme axial. On excise les territoires A et A + MA
controlatéraux (fig. 5) ; chacun est pris alternativement à droite et à gauche. Le
mesenchyme axial comprend le mesenchyme de la pièce intermédiaire, ébauche
du rein embryonnaire, et le mesenchyme somitique.
Dans cette série expérimentale, 147 paires ont été greffées : 44 paires ont été
retrouvées; 26 ont été perdues; dans 34 cas, on a retrouvé le greffon A + MA
seul; dans 43 cas, le greffon A.
Vingt-cinq greffons de type A et 27 greffons de type A + MA se sont développés à partir de matériel prélevé sur des embryons de 25 à 29 paires de somites ;
15 ailes se sont formées (60 %) à partir de l'ébauche isolée, 22 (81,4 %) à partir
de l'ébauche prélevée avec le mesenchyme axial. Soixante-deux greffons de type A
et 51 greffons de type A + MA se sont développés à partir de matériel prélevé
Rôle du mesenchyme axial dans le développement de l'aile.
Fig. 6. Aile obtenue à partir d'une ébauche prélevée au stade de 31 paires de somites,
après 8 jours en greffe coelomique.
Fig. 7. Développement de deux territoires controlatéraux prélevés sur un embryon
de 18 paires de somites: (A) le territoire de l'aile a été prélevé avec le mesenchyme
axial adjacent (type A+MA); (B) le territoire de l'aile a été prélevé seul (type A).
Fig. 8. Aile obtenue à partir d'un fragment du feuillet mésodermique indifférencié
prélevé avec ectoderme et endoderme au niveau présomptif de l'aile sur un embryon
de 13 paires de somites. Radius et doigt 1 manquent.
Fig. 9. Aile formée à partir d'un fragment de feuillet mésodermique indifférencié
prélevé au niveau présomptif de l'aile sur un embryon de 10 paires de somites. L'humérus est déficient et soudé au cubitus, le radius est réduit, l'autopode est complet.
L'aile est petite et son aspect est celui d'une aile de 6-7 jours (âge réel = 10 jours).
ce. = ceinture, H. = humérus, C. = cubitus, R. = radius, s. = soudure, r. 1, 2,3 =
rayons 1, 2, 3. Coloration: technique de Lundvall.
La morphogenèse précoce des membres
117
1 mm
I
I
f m. m
WA
1 mm
I
I
8-2
118
M. P I N O T
au stade de 15 à 24 paires de somites. Aucune aile ne s'est formée à partir du
territoire présomptif isolé (A), 42 (82,3 %) à partir du territoire excisé avec le
mesenchyme axial (A + MA) (fig. 7 A, B). Lorsque l'aile ne se développe pas,
le greffon est arrondi (fig. 7B). Il est d'autant plus gros qu'il provient de matériel
plus âgé. Lorsque l'aile se développe à partir de matériel de 25 à 29 paires de
somites, sa taille est comparable dans les séries A et A + MA. Elle correspond
à son âge réel (10 jours). Si les greffons proviennent de matériel pris sur des
embryons de moins de 24 paires de somites (les trois feuillets embryonnaires
sont alors excisés), un fragment aveugle d'intestin se développe. Cette structure
est souvent extérieure à la masse principale du greffon, attachée à celle-ci de
façon assez lâche. Parfois même, on retrouve le fragment d'intestin loin du reste
du greffon.
(3) Greffe du territoire présomptif de Vaile prélevé avec le mesenchyme axial
sur des embryons de 7 à 14 paires de somites {stades 9 à 11 de H. & ƒƒ.). Sur les
embryons de moins de 15 paires de somites, le territoire présomptif de l'aile
n'est pas bien délimité et ne peut pas être isolé. L'aire présomptive est prélevée
au ras du tube nerveux. Cinquante-deux expériences de ce type ont été faites : on
a retrouvé 40 greffons. Vingt-quatre greffons proviennent de matériel prélevé au
stade de 10 à 14 paires de somites : 15 ailes (62,5 %) se sont développées (fig. 8, 9).
Les membres obtenus présentent un retard de développement : provenant de matériel prélevé à 48 h, après 8 jours en greffe cœlomique, ils ont le plus souvent les
dimensions et la forme (courbures) de membres de 6-8 jours (fig. 9). Seize
greffons proviennent de matériel de 7 à 9 paires de somites. Dans aucun cas il ne
s'est formé d'aile.
Cette étude morphologique externe des greffons a été prolongée par des
examens du squelette après coloration et éclaircissement par la méthode de
Lundvall, et des examens histologiques. Les deux techniques sont parfois
appliquées successivement au même greffon. Dans certains cas aussi, la base de
l'aile, coupée au niveau de l'humérus est soumise à une étude histologique, le
reste est examiné au point de vue squelettique.
C. Examens du squelette
(1) Greffons qui n'ont pas formé d'aile. L'étude porte sur: trois greffons
provenant de matériel (A) de 30 à 44 paires de somites; 12 greffons formés de
matériel (A ou A + MA) de 25 à 29 paires de somites; 32 greffons formés de
matériel (A ou A + MA) de 14 à 24 paires de somites. Sept greffons, parmi les
plusjeunes, ne contiennent aucune formation squelettique.
Les greffons provenant de matériel de plus de 25 paires de somites présentent
des formations squelettiques allongées et distinctes, sans organisation. Parfois,
des baguettes renflées aux extrémités ont l'aspect caractéristique d'os longs.
Lorsque les greffons proviennent de matériel plus jeune, le cartilage apparaît
sous forme de une ou plusieurs baguettes allongées, sans forme précise.
(2) Ailes. L'étude du squelette porte sur 108 ailes, obtenues dans les différentes
La morphogenèse précoce des membres
119
séries. Le tableau 2 groupe les résultats obtenus. On constate que: (a) Les ailes
qui se forment à partir d'ébauches isolées au stade de 30 à 44 paires de somites,
présentent un squelette complet dans 20 cas sur 23, des déficiences légères dans
3 cas (rayons 1 et 3). (b) La présence du mesenchyme axial améliore la qualité
de la différenciation du territoire de l'aile capable d'évoluer seul: 6 ailes sur 12
ont un squelette complet dans la série A, 14 sur 18 dans la série A + MA,
lorsque le matériel est excisé sur des embryons de 25 à 29 paires de somites,
(c) Vingt-huit ailes sur 40 ont un squelette complet si le matériel (A + MA) est
Tableau 2. Ailes: étude du squelette
Age du
matériel
greffé
30-44 paires
somites
25-29 paires
somites
15-24 paires
somites
10-14 paires
somites
Total
Type
d'expérience
Nombre
de cas
étudiés Ceinture H
de
A
23
de
A
A+MA
A
A+MA
A+MA
12
18
de
de
—
4
R
23 23
7
12 8
18
18 16
Pas de différenciation
40
35
40 28
11
15
15 7
108
—
108
C M c l Mc.2 M c 3 D l D2 D 3
23
20 23 22
12 6 12 11
18 14 18 18
de l'aile (tableau
40 28 40 36
15 10 15 11
82 108
78 108 98
20 23
22
6 12 10
14 18 16
1)
28 40 35
10 15 11
78 108 94
excisé sur des embryons de 15 à 24 paires de somites, 7 sur 15 si le matériel est
pris sur des embryons de 10 à 14 paires de somites. Les déficiences du squelette
deviennent plus fréquentes lorsque le matériel greffé est plus jeune, (d) La
réduction des pièces squelettiques s'effectue dans un ordre déterminé: le doigt
1 et le métacarpien 1 disparaissent le plus souvent, ensuite le radius, enfin, plus
rarement, le doigt 3 et le métacarpien 3. Il y a tendance à la réalisation d'un axe
simple humérus-cubitus-rayon 2. Il faut noter toutefois que, dans les ailes
qui se développent à partir de matériel de 10 à 14 paires de somites, le
radius disparaît d'abord, et l'autopode est dominant. L'humérus et le cubitus
sont fréquemment soudés (fig. 9).
La ceinture ne se développe jamais complètement. Elle se différencie plus
souvent si le matériel axial est présent. Le scapulum est alors reconnaissable,
ainsi que le coracoïde; ces os sont incomplètement développés; ceci est probablement dû aux conditions de la greffe : en effet, la base du greffon, près du point
d'implantation, est fréquemment lésée; si le territoire de l'aile est expiante seul,
l'humérus peut être tronqué.
Les vertèbres ne se différencient jamais à partir du territoire axial.
120
M. P I N O T
D. Examens
histologiques
Les résultats de ces examens ont été groupés dans le tableau 3. Nous remarquons: (a) L'absence constante des structures nerveuses, (b) L'absence constante
du mesonephros dans les greffons issus de matériel de membre isolé (fig. 10).
Tableau 3. Ailes: Examens
histologiques
Age du
matériel greffé
Type
d'expérience
Aspect
morphologique
Nombre
de cas
Cart i lage
Mesonephros
25-29 paires
de somites
15-24 paires
de somites
A
A
Aile
Absence d'aile
Absence d'aile
5
10
44
5
10
26
0
0
1
15-29 paires
de somites
A + MA
Aile
16
16
Absence d'aile
12
9
Aile
5
5
Absence d'aile
9
4
Absence d'aile
10
4
10-14 paires
de somites
7-9 paires
de somites
A+MA
A+MA
Intestin
0
0
26
11
(15 à 24 paires
de somites)
11
9
(15 à 24 paires
de somites)
1
4
(14 paires de somites)
2
8
(14 paires de somites)
5
0
14
(c) La présence constante du mesonephros dans les greffons provenant de
matériel de membre prélevé avec le territoire axial adjacent sur des embryons
de plus de 14 paires de somites (fig. 11). (d) La présence constante de l'intestin
lorsque le greffon provient de matériel de moins de 24 paires de somites (les
trois feuillets embryonnaires sont alors prélevés), (e) L'absence de corrélation
entre la présence de ces structures et le développement de l'aile, (f) La présence
Fig. 10. Aspect histologique de la base d'une aile formée à partir d'un territoire
d'aile isolé (A), prélevé sur un embryon de 27 paires de somites. Pas de mesonephros.
Fig. 11. Aspect histologique de la base d'une aile formée à partir d'un territoire
d'aile prélevé avec le mesenchyme axial adjacent (A + MA) sur un embryon de 23
paires de somites. Présence du mesonephros.
Fig. 12. Aspect histologique d'un greffon qui s'est formé à partir d'un fragment du
feuillet mésodermique indifférencié prélevé au niveau présomptif de l'aile sur un
embryon de sept paires de somites. Mesenchyme indifférencié et cartilage.
Fig. 13. Aspect histologique d'un greffon qui s'est développé à partir de matériel de
même âge. Mesenchyme lâche, indifférencié.
c. = cartilage, mu. = muscles, mes. = mesonephros, m. = mesenchyme. Coloration: glychémalun-éosine.
La morphogenèse précoce des membres
121
-m
13
122
M. P I N O T
de cartilage dans quelques greffons provenant de matériel de 7 à 9 paires de
somites (fig. 12). Ceci confirme les résultats que nous avons obtenus en culture
in vitro (Pinot, 19696). Le plus souvent, néanmoins, ces greffons ne présentent
aucune différenciation (fig. 13).
E. Conclusions
(1) Le territoire présomptif de l'aile est capable de se différencier de manière
autonome à partir du stade de 25 paires de somites. Notons que ce stade est
celui où apparaît l'épaississement de la somatopleure, première manifestation
visible de l'ébauche.
(2) Le mesenchyme axial (a) améliore la différenciation du territoire du
l'aile capable d'évoluer seul et augmente la fréquence du développement (25 à 29
paires de somites); (b) permet la différenciation en aile du territoire présomptif
prélevé entre !e stade de 10 paires de somites et le stade de 24 paires de somites.
II. ROLE D U MESENCHYME AXIAL DANS LE DEVELOPPEMENT
DE LA PATTE
A. Technique
Pour savoir si le mesenchyme axial joue dans le développement de la patte
un rôle analogue à celui que nous avons constaté dans celui de l'aile, nous avons
effectué des séries expérimentales comparables: l'ébauche de patte isolée (P),
ou l'ébauche prélevée avec le mesenchyme axial adjacent (P + MA), est greffée
dans le cœlome d'un embryon de 3 jours, où elle se développe pendant 8 jours.
Rôle du mesenchyme axial dans le développement de la patte.
Fig. 14. Patte obtenue à partir d'une ébauche isolée (P) prélevée sur un embryon de
32 paires de somites. La taille du membre est normale. Le squelette est complet (le
péroné et deux doigts ne sont pas visibles sur la photo). Le fémur est tronqué.
Doigt surnuméraire au niveau du fémur.
Fig. 15. Développement de deux territoires controlatéraux prélevés sur un embryon
de 22 paires de somites: (A) le territoire de la patte a été prélevé avec le mesenchyme
axial (type P+ MA); (B) le territoire de la patte a été prélevé seul (type A). Le greffon
est constitué par une petite baguette cartilagineuse et une grosse vésicule.
Fig. 16. Patte obtenue à partir d'un territoire prélevé avec le mesenchyme axial
(P+MA) sur un embryon de 18 paires de somites. Fémur et tibia bien développés,
deux doigts atypiques.
Fig. 17. Petite patte formée à partir d'un fragment du feuillet mésodermique indifférencié prélevé avec ectoderme et endoderme au niveau présomptif de la patte sur
un embryon de 13 paires de somites. Pièces squelettiques difficiles à interpréter.
F. = fémur, T. = tibia, P. = péroné, Mt. = métatarsiens, D. 1,2,3,4 - doigts
1,2,3,4; D.s. = doigt surnuméraire, c. = cartilage, v. = vésicule. Coloration:
technique de Lundvall.
123
La morphogenèse précoce des membres
14
D. 2
D. 3
D. 4
1 mm
I
15A
I
15B
f
v
1 mm
I
I
1 mm
16
I
I
17
124
M. P I N O T
B. Résultats morphologiques : Le développement de la patte
Ces résultats sont consignés dans le tableau 4.
(1) Greffe de bourgeons de patte prélevé au stade de 32 à 44 paires de sornites
{stades 17 à 21 de H. & H.). Trente-cinq greffes de ce type ont été faites;
29 embryons-hôtes sont vivants au moment de l'autopsie; 24 greffons sont
retenus, 21 sont des pattes (fig. 14). La technique des greffes cœlomiques permet
donc un développement satisfaisant de la patte, lorsque le territoire greffé est
capable de différenciation autonome.
Tableau 4. Rôle du mesenchyme axial dans le développement de la patte:
étude morphologique externe
P: territoire de
la patte isolé
Stade de l'embryon donneur
Nombre total
de cas
32-44 paires de somites
25-30 paires de somites
24
33
20-24 paires de somites
21
11-19 paires de somites
Pattes
21
19
(57,5 %)
1
(1 doigt
22 somites)
P + M A : ter ritoire de
la patte + méseïichyme axial
Nombre total
de cas
—
22
19
18
Pattes
—
20
(90,9 %)
10
(52,6 %)
5
(27,5 %)
(2) Greffe du territoire de la patte, prélevé avec ou sans le mesenchyme axial
adjacent, sur des embryons de 20 à 30 paires de somites (stades 13-14 à 17 de
H. & H). Quatre-vingt-quatre paires ont été greffées: 73 greffons ont été
perdus ou éliminés; 19 paires ont été retrouvées; dans 25 cas, on a retrouvé
seulement le greffon de type P; dans 22 cas, le greffon de type P + MA.
Si le matériel a été prélevé sur des embryons de 25 à 30 paires de somites,
19 greffons sur 33 (57,5 %) de type P, et 20 sur 22 (90,9 %) de type P + MA, se
sont développés en pattes. Si le matériel a été excisé sur des embryons de 20 à
24 paires de somites, 10 greffons sur 19 (52,6 %) de type P + MA se sont différenciés en pattes (fig. 15 A). En revanche, sur 21 greffons de type P, 20 sont petits et
informes (fig. 15B); un seul (matériel prélevé au stade de 22 paires de somites)
a formé un doigt.
(3) Greffe du territoire présomptif de patte prélevé avec le mesenchyme axial
sur des embryons de 11 à 19 paires de somites {stades 10 à 13 de H. & H.).
Quarante greffes de ce type ont été faites; on a étudié 18 greffons seulement.
(Beaucoup sont éliminés à cause d'une mauvaise irrigation.) Dans 5 cas, on
reconnaît des structures de patte. Toutefois, ces membres sont petits et très
déficients (fig. 16, 17). Le matériel le plus jeune qui s'est montré capable de
La morphogenèse précoce des membres
125
former de telles structures avait été excisé sur un embryon de 13 paires de
somites (fig. 17).
C. Examens du squelette
Pour apprécier la qualité de la différenciation des pattes formées, et l'influence
du mesenchyme axial sur cette différenciation, nous avons étudié le squelette
des membres provenant de matériel prélevé sur des embryons de plus de 20
paires de somites (tableau 5). Les membres qui se sont développés à partir de
matériel plus jeune présentent en effet des pièces squelettiques difficiles à
interpréter (fig. 16, 17).
Tableau 5. Pattes: étude du squelette
Age du
matériel
greffé
32-44 paires
de somites
25-30 paires
de somites
20-24 paires
de somites
Total
Type
Nombre de
d'expérience cas étudiés Ceinture
P
P
P+MA
P
P+MA
P
Rayon
1
Rayon
2
Rayon
3
Rayon
4
16
14
17
21
21
19
7
16 17
3
4
7
20
16
18 19 2
2
16
Pas de différenciation de la patte (tableau 4)
10
6
7
8
1 2
4
70
40
61 65 22
22
44
17
20
12
20
10
68
8
61
21
11
F
T
20 21
Nous avons pu faire les constatations suivantes: (a) Les pattes qui se développent à partir d'une ébauche déjà visible (stade de 32 à 44 paires de somites) ont
un squelette normal dans 14 cas sur 21. La patte comporte des éléments
squelettiques très labiles (rayon 1, péroné) qui disparaissent très vite, (b) La
présence du mesenchyme axial améliore la différenciation squelettique d'un
territoire de patte capable d'évoluer seul (25 à 30 paires de somites). Cette
amélioration est particulièrement nette au niveau de l'autopode. Dans l'expérience de type P, l'autopode manque complètement dans 2 cas sur 19: la différenciation du stylopode est normale, le membre se termine au niveau du milieu
du tibia, (c) Les déficiences squelettiques portent d'abord sur le rayon 1 et le
péroné. Les éléments qui se développent le plus souvent sont le rayon 3, le
tibia, le fémur et le rayon 4. (d) Prélevé au stade de moins de 20 paires de somites
(fig. 16, 17), le territoire de la patte se différencie avec des déficiences de plus en
plus importantes: la différenciation aux stades les plus précoces est nettement
moins bonne que celle de l'aile.
Pour ce qui concerne la ceinture, on peut répéter ici les remarques faites au
sujet de la ceinture scapulaire. Les vertèbres ne se différencient jamais. Lorsque
le membre ne se développe pas, l'aspect squelettique du greffon est en tous
points identique (fig. 7B, 15B), qu'il soit constitué par le territoire de l'aile ou
de la patte.
126
M. P I N O T
D. Examens histologiques
Us portent sur 32 greffons qui ne se sont pas développés en pattes; il s'agit de
17 greffons de type P, provenant de matériel prélevé au stade de 22 à 28 paires
de somites, et 15 greffons de type P + MA, issus de matériel prélevé sur des
embryons de 11 à 28 paires de somites (tableau 6).
Nous noterons seulement quelques caractéristiques: (a) L'absence constante
du mesonephros dans les greffons de type P. (b) Sa présence dans les greffons de
type P + MA prélevés sur des embryons de plus de 24 paires de somites, (c) La
présence fréquente de l'intestin dans les deux types de greffons; les trois feuillets
embryonnaires sont en effet prélevés sur les embryons de moins de 30 paires de
Tableau 6. Pattes: examens histologiques
Age du
matériel
greffé
22-28 paires
de somites
11-28 paires
de somites
Type
d'expérience
P
P+MA
Aspect
morphologique
Nombre
de cas
étudiés
Cartilage
Mesonephros
Absence de
patte
Absence de
patte
17
12
0
11
0
15
13
6
(24 à 28 paires
de somites)
11
4
Intestin
Gonade
somites, (d) La présence dans quatre greffons de type P + MA d'une petite
gonade. La région gonadique se trouve au niveau des somites 19 à 29 (Wolff,
1949). Sa partie postérieure est donc comprise dans le greffon. Son territoire,
situé légèrement sous le somite, n'est pas prélevé lorsque le mesenchyme axial
est évité, (e) L'absence de structures nerveuses et chordales.
E. Conclusions
(1) Le territoire présomptif de la patte est capable de se différencier de manière
autonome à partir du stade de 25 paires de somites. 11 acquiert donc cette
propriété en même temps que le territoire de l'aile. (2) Le mesenchyme axial joue
le même rôle au niveau de l'aile et de la patte: (a) il favorise quantitativement
et qualitativement la différenciation du territoire présomptif capable d'évolution autonome; (b) il permet la différenciation en patte du territoire présomptif
prélevé à un stade précoce (13 à 24 paires de somites).
III. INFLUENCE DE LA MASSE DU GREFFON SUR SON
DEVELOPPEMENT
Les territoires A + MA ou P + MA sont, au moment de la greffe, sensiblement plus gros que les greffons A ou P controlatéraux. Dès lors, on pouvait se
demander si l'absence de développement des greffons A ou P prélevés sur des
La morphogenèse précoce des membres
127
embryons de moins de 25 paires de somites, n'était pas due seulement à l'insuffisance de la masse du greffon. Pour répondre à cette question, nous avons
réalisé deux groupes d'expériences: (a) associations de deux territoires présomptifs de membre; (b) associations d'un territoire présomptif de membre avec un
fragment de tissu plus âgé (foie, peau, mesonephros). Ces expériences ont été
faites avec le membre antérieur.
A. Association de deux territoires présomptifs d'aile
(1) Technique
Trois séries expérimentales ont été réalisées :
(a) Association de deux territoires A + MA controlatéraux. Cette série permettra
de savoir si le développement de deux membres est possible dans le cœlome.
(b) Association d'un territoire A et d'un territoire A + MA controlatéraux.
(c) Association de deux territoires A controlatéraux. On prélève le matériel sur
des embryons de 15 à 24 paires de somites. Les deux ébauches controlatérales sont
associées pendant 2 à 5 min sur un milieu de culture, puis greffées dans le cœlome
d'un embryon-hôte de 3 jours d'incubation. L'embryon-hôte est sacrifié le plus
souvent après 8 jours.
(2) Résultats
Les résultats sont groupés dans le tableau 7. Les chiffres correspondent au
nombre de greffons retenus. Le nombre total de greffes effectuées est de 31 dans
la série (a), 26 dans la série (b), et 30 dans la série (c).
Tableau 7. Développement de deux territoires présomptifs d'ailes associés,
prélevés au stade de 15 à 24 paires de somites
A+MA+A+MA
A+MA+A
A+A
24
2
5
16
0
4
21
3
75
0
Nombre total de cas
Pas d'éléments squelettiques
Eléments squelettiques informes
1 membre
1 membre + formations surnuméraires
2 membres
1
7
9
1
11
0
0
0
Série (a): 24 greffons ont été étudiés. Dans deux cas, il n'y a pas de cartilage;
dans 5 cas, des formations cartilagineuses informes et assez importantes se
sont développées; un greffon a formé une aile seule; sept greffons ont formé une
aile avec des formations squelettiques surnuméraires à la base; dans neuf cas
enfin, deux membres bien constitués se sont développés (fig. 18). 11 faut noter
que, dans cette série, l'autopsie est souvent prématurée. En effet, lorsque
deux membres se développent, le greffon, très volumineux, provoque des
hémorragies chez l'hôte, qui meurt avant le lie jour.
128
M. P I N O T
Série (b): sur 16 greffons, quatre présentent des éléments squelettiques sans
organisation, un a formé une aile seule, 11 ont donné naissance à une aile avec des
formations squelettiques surnuméraires à la base (fig. 19).
Série (c): 18 greffons sur 21 présentent des formations cartilagineuses peu
importantes et sans organisation (fig. 20); trois n'ont pas formé de cartilage. Il
convient de remarquer néanmoins que, si le greffon est formé de matériel
prélevé au stade de 22 à 24 paires de somites, la quantité de cartilage qui se
développe est plus que double de la quantité formée à partir d'un seul territoire
de même âge; mais aucune organisation n'apparaît.
(3) Conclusion
Une augmentation de la quantité de matériel présomptif de membre greffé
ne provoque pas une amélioration sensible de la différenciation du greffon.
B. Association d'un territoire présomptif d'aile avec un fragment de tissu
(foie, mesonephros, peau) prélevé sur un embryon plus âgé
(1) Technique. Les tissus associés sont la peau de 7 jours, le foie et le mesonephros de 8 et 9 jours. Le foie ou le mesonephros est découpé en une fine lamelle
carrée, qui est déposée sur un milieu de culture. La peau, coupée de la même
façon, est placée sur le milieu, derme en haut. Le territoire présomptif de l'aile
prélevé au stade de 15 à 24 paires de somites, est placé sur le tissu préparé,
Fig. 18. Développement de deux territoires d'aile controlatéraux, prélevés avec le
mesenchyme axial adjacent (A+MA) sur un embryon de 20 paires de somites, et
greffés associés. Deux membres se sont développés (6 jours de greffe).
Fig. 19. Deux territoires d'aile controlatéraux, prélevés l'un seul (A), l'autre avec le
mesenchyme axial adjacent (A + MA) sur un embryon de 21 paires de somites, et
greffés associés. Une seule aile s'est formée. A sa base, on note des formations cartilagineuses surnuméraires qui se sont développées à partir du territoire A (8 jours de
greffe).
Fig. 20. Deux territoires d'aile controlatéraux (A + A) prélevés sur un embryon de
21 paires de somites, et greffés associés. Greffon petit, arrondi avec une baguette de
cartilage (8 jours de greffe).
Fig. 21. Territoire présomptif d'aile (A), prélevé sur un embryon de 20 paires de
somites et greffé associé à un fragment de peau de 7 jours. Un nodule de cartilage.
Germes plumaires formés sur le fragment de peau.
Fig. 22. Territoire présomptif d'aile (A) prélevé sur un embryon de 23 paires de
somites, et greffé associé à un fragment de peau de 7 jours. Le greffon ne présente
pas l'aspect extérieur d'une aile; mais l'étude du squelette indique une certaine
organisation des éléments squelettiques. Ce cas représente un intermédiaire entre
l'absence de développement du greffon et la formation d'une aile typique.
ce. = ceinture, H. = humérus, R. = radius, C. = cubitus, r. 1,2,3 = rayons
1,2,3, D. 2 = doigt 2, Me. = métacarpiens, s. = soudure, c. = cartilage, f.c.s. = formations cartilagineuses surnuméraires,/?. = germes plumaires. Coloration : technique
de Lundvall.
La morphogenèse précoce des membres
129
1 mm
I
I
18
1 mm
I
I
20
1 mm
I
I
21
D. 2
1 mm
I
I
19
22
130
M. P I N O T
ectoderme en haut. Après 15 à 20 min sur le milieu de culture, l'ensemble est
greffé dans le cœlome d'un embryon-hôte de 3 jours, que l'on sacrifie à 11 jours.
(2) Résultats (tableau 8). Si le territoire présomptif de l'aile (A) a été prélevé
sur des embryons de 15 à 21 paires de somites, sa différenciation est comparable
à celle qu'on obtient lorsqu'il est greffé seul (fig. 21). En revanche, la différenciation du territoire prélevé au stade de 22 à 24 paires de somites est nettement
améliorée: sur 34 greffons, huit ailes se sont différenciées; parmi les autres
greffons, 12 présentent une certaine organisation des éléments squelettiques
(fig. 22); ces cas représentent une étape intermédiaire entre les éléments squelettiques inorganisés et l'aile à trois segments. Les huit ailes obtenues, dont la
taille est légèrement réduite par rapport à l'âge réel, ont été traitées par la
méthode de Lundvall: trois ont un squelette complet; les cinq autres présentent
des déficiences (rayon 1, radius, doigt 3). Trente-sept greffons, dont cinq ailes,
ont été soumis à une étude histologique. Du mesonephros ne se forme jamais
à partir du territoire A; le développement de l'aile ne peut donc être imputé à
un prélèvement imprécis.
Tableau 8. Développement d'un territoire présomptif d'aile (A) associé à
un tissu plus âgé (peau, foie, mesonephros)
A + peau
A + fo ie ou mesonephros
A
Stade de
l'embryon donneur
22-24 paires de
somites
15-21 paires de
somites
Nombre
de cas
Cartilage
Aile
16
14
31
26
4
(25 %)
0
Nombre
de cas
Cartilage
Aile
18
18
25
21
4
(22,2 %)
0
(3) Conclusions. Immédiatement avant le stade de la différenciation autonome, le territoire présomptif de l'aile est capable de se différencier en aile,
s'il est associé à un tissu plus âgé (peau, foie, mesonephros).
Le rôle du tissu associé n'est pas comparable à celui du mesenchyme axial :
dans aucun cas, il n'a permis une meilleure différenciation d'un territoire présomptif d'aile prélevé avant le stade de 22 paires de somites.
IV. MECANISME DE L ' A P P A R I T I O N DES MEMBRES
A. Position du problème
Comment expliquer l'apparition des membres à deux niveaux déterminés?
Deux mécanismes simples peuvent être invoqués: (1) le mesenchyme axial
exerce une stimulation 'membre' à deux niveaux précis seulement; (2) le
mesenchyme axial possède à n'importe quel niveau cette propriété stimulatrice,
mais le mésoderme latéral répond à deux niveaux déterminés. Le problème
peut être posé de la même manière pour rendre compte de la qualité aile ou
La morphogenèse précoce des membres
131
patte de la différenciation. On peut imaginer une stimulation axiale qualitative
et une réponse latérale indifférente, ou une stimulation indifférente et une
réponse qualitative du territoire latéral. Pour éprouver ces hypothèses, nous
avons étudié le développement de différentes régions de la plaque latérale,
associées au mesenchyme axial prélevé à différents niveaux.
B. Techniques
Nous avons utilisé deux techniques expérimentales:
Technique T. Le processus expérimental est schématisé dans la fig. 23. On
dépose un fragment de peau sur un milieu de culture, derme en haut. Un territoire présomptif de membre est excisé et placé sur le derme, ectoderme en haut.
On prélève alors une bande de mesenchyme axial à un niveau choisi sur le même
Culture = 15 à 20 min
Fig. 23. Schéma illustrant l'expérience d'association d'un fragment de plaque latérale
avec une bande de mesenchyme axial, sur un fragment de peau de 7 jours (technique 1).
La plaque latérale et le mesenchyme axial sont excisés au niveau choisi sur le même
embryon ou sur deux embryons différents. Après 15 à 20 min de culture, l'ensemble
est greffé dans la cavité cœlomique d'un embryon-hôte de 3 jours.
embryon ou sur un autre embryon, et on la dépose sur le derme, juxtaposée au
territoire de membre. La partie distale du mesenchyme axial est en contact avec
la partie proximale de l'ébauche de membre. On prélève parfois le tube nerveux
avec le mesenchyme axial. L'association ainsi réalisée est incubée 15 à 20 min à
38 °C sur le milieu de culture. Le mesenchyme axial et le territoire du membre
adhèrent au derme et sont ainsi maintenus en contact. L'ensemble est ensuite
greffé dans la cavité cœlomique d'un embryon de 3 jours.
9
E MB 23
132
M. P I N O T
On a greffé 412 associations de ce type; 177 greffons seulement ont été
étudiés. Un nombre important de greffons se dissocie en greffe cœlomique, et
les éléments évoluent séparément. Même dans le cas où le greffon évolue sans
dissociation, des examens histologiques nous ont permis de constater que parfois
l'association n'était pas vraiment réalisée; le mesenchyme axial et le territoire
de membre adhéraient au derme sans connexions entre eux. Les greffons retenus
et étudiés présentent une association réelle des deux mesenchymes. Mais rien
ne permet d'affirmer qu'elle a été immédiate; elle a pu être tardive et due à la
croissance des deux tissus associés.
Témoins: le territoire présomptif de membre controlatéral est placé sur un
fragment de peau déposé sur un milieu de culture, et l'ensemble est greffé après
15 à 20 min d'incubation.
Technique 2: elle est schématisée dans la fig. 24. Un blastoderme de 35 à 50 h
d'incubation est mis en culture suivant la technique de Wolff & Simon (1955).
Une à deux heures après, lorsque le blastoderme adhère déjà au milieu de
culture, on excise une bande de mesenchyme axial avec ou sans le tube nerveux,
Culture du blastoderme
8 a 10 heures
Greffon
Greffe coelomique
8 jours
Fig. 24. Schéma illustrant l'expérience d'association mesenchyme axial-plaque
latérale en culture de blastoderme (technique 2).
La morphogenèse précoce des membres
133
sur un embryon donneur, à un niveau choisi. On dépose ce greffon à la place
du mesenchyme axial préalablement excisé, ou entre le mesenchyme axial et la
plaque latérale du blastoderme, à un niveau déterminé. Après 8 à 10 h de culture
on prélève le greffon et la région de la plaque latérale qui lui est associée. Le
tout est greffé dans le cœlome d'un embryon de 3 jours.
Des examens histologiques nous ont permis de constater que le mesenchyme
axial greffé et la plaque latérale du blastoderme sont très étroitement associés
(fig. 25). Lorsque le mesenchyme axial du blastoderme reste en place entre le
greffon et le tube nerveux, il se différencie pendant la culture. On peut ainsi
apprécier la place exacte du greffon, dans le sens crânio-caudal et proximodistal. On a réalisé 167 expériences de ce type; 135 greffons ont été retenus.
Dans aucun cas, il ne s'est produit de dissociation.
Témoins: la plaque latérale et le mesenchyme axial du blastoderme sont
prélevés au niveau du greffon, du côté opposé. Ce matériel est greffé dans le
cœlome d'un embryon de 3 jours.
Dans tous les cas, l'embryon-hôte est sacrifié 8 jours après la greffe.
Nous étudierons d'abord l'évolution de la plaque latérale présomptive de
membre (aile ou patte), associée au mesenchyme axial prélevé à différents
niveaux ('membre' ou 'non membre'). Nous nous intéresserons ensuite à
l'évolution de la région de la plaque latérale située entre l'aile et la patte, associée
au mesenchyme axial prélevé au niveau du membre.
C. Développement de la plaque latérale présomptive de membre associée au
mesenchyme axial prélevé à différents niveaux
(1) Les témoins
Technique 1: ils ont été étudiés dans le chapitre précédent (tableau 8). Rappelons que le territoire présomptif de l'aile associé à un fragment de peau de
7 jours, est capable de se différencier en aile s'il est prélevé sur un embryon de
22 paires de somites au moins.
Technique 2: 65 greffons témoins ont été étudiés: 43 ailes ont été obtenues
(66,1 %). Après 8 à 10 h en culture de blastoderme, le territoire de membre,
prélevé avec le mesenchyme axial adjacent, reste capable de se différencier dans
un pourcentage de cas important.
(2) Les associations expérimentales: résultats généraux (tableau 9)
Les associations ont toujours été réalisées avec des territoires présomptifs
de membres d'embryons de moins de 22 paires de somites. La technique
1 exige que l'on puisse exciser le territoire présomptif de membre: l'excision est
pratiquée sur des embryons de 15 paires de somites au moins pour l'aile, de
18 paires de somites au moins pour la patte. La technique 2 permet de contrôler
la localisation du greffon, 8 à 10 h après l'association. L'expérience peut alors
être faite à partir du stade de 12 et 13 paires de somites, au niveau présomptif de
9-2
134
M. P I N O T
l'aile. L'association n'a jamais été réalisée avec cette technique au niveau de la
patte. Le mesenchyme axial prélevé au niveau 'membre' correspond aux
somites 15 à 20 (aile), ou 26 à 32 (patte). Le mesenchyme axial prélevé à un
niveau 'non membre' correspond aux somites 6 à 12 (cou), ou 22 à 25 (niveau
intermédiaire entre l'aile et la patte). Les associations sont homo- ou hétérochroniques.
Tableau 9. Association de plaque latérale présomptive de membre et de
mesenchyme axial prélevé à différents niveaux
Technique 1
Age de la plaque
latérale associée
Nombre
de cas
Membre
Technique 2
Nombre
de cas
Membre
Total
Nombre
de cas
Association membre — mesenchyme axial 'membre'
19-21 paires de
64
21
11
10
75
somites
(32,8%)
(90,9%)
Moins de 19 paires
46
11
30
14
76
de somites
(23,9%)
(46,6%)
Association membre — mesenchyme axial 'non membre'
19-21 paires de
19
3
16
10
35
somites
(17,5%)
(62,5%)
Moins de 19 paires
48
0
33
0
81
de somites
Membre
31
(41,3%)
25
(32,8%)
13
(37,1%)
0
On a obtenu les résultats suivants: (1) La plaque latérale présomptive de
membre d'embryons de 19 à 21 paires de somites se différencie en membre dans
31 cas sur 75 (41,3 %) si elle est associée au mesenchyme axial prélevé au niveau
du membre, dans 13 cas sur 35 (37,1 %), si elle est associée au mesenchyme
axial prélevé à un autre niveau. (2) La plaque latérale présomptive de membre
d'embryons de moins de 19 paires de somites, se différencie en membre dans
25 cas sur 76 (32,8 %) si le mesenchyme axial associé a été prélevé au niveau
'membre'. En revanche, si le mesenchyme axial a été excisé au niveau du cou
ou dans la région intermédiaire entre aile et patte, la plaque latérale de même
âge ne se différencie jamais en membre (81 cas).
Donc: le mesenchyme axial 'non membre' est capable d'exercer une action
stimulatrice morphogène sur le territoire présomptif de membre. Mais cette
stimulation est insuffisante pour provoquer la différenciation d'un territoire de
membre d'embryon de moins de 19 paires de somites.
Ces résultats nous amènent à émettre l'hypothèse que l'action morphogène
du mesenchyme axial s'exerce bien avant l'apparition morphologique de
l'ébauche: au stade de 22 paires de somites, le mésoderme aurait reçu une
stimulation suffisante pour qu'un tissu plus âgé associé (foie, peau, mesonephros)
La morphogenèse précoce des membres
135
permette le développement du membre; au stade de 19 paires de somites, la
stimulation déjà reçue suffirait pour que la faible stimulation excercée par le
mesenchyme axial 'non membre' provoque la différenciation. Nous allons
maintenant examiner les résultats de façon plus détaillée.
(3) Les associations expérimentales : associations territoire présomptif de membremésenchyme axial 'non membre"1
(a) Associations hétérochroniques: Dans quelques cas (technique 1), le
mesenchyme axial et le territoire présomptif de membre sont excisés sur le
même embryon. Le plus souvent, les associations sont hétérochroniques
(fig. 26). Le mesenchyme axial est prélevé au niveau de l'aile sur des embryons
de 20 à 35 paires de somites, au niveau de la patte au stade de 26 à 38 paires de
somites. Le mesenchyme axial peut être alors isolé de manière précise. Prélevé
au stade de 35 ou 38 paires de somites, le mesenchyme axial s'est montré
capable d'exercer une influence stimulatrice sur le mésoderme latéral présomptif de membre d'embryons de moins de 19 paires de somites. Or, comme l'aile
et la patte peuvent se différencier de manière autonome dès le stade de 25 paires
de somites, cela prouve que la stimulation axiale s'exerce sur le territoire présomptif du membre plus longtemps qu'il n'est nécessaire pour qu'un développement normal soit assuré.
(b) Associations hétérospécifiques: Dans quelques cas (technique 1), le mesenchyme axial est prélevé sur l'embryon de Caille. Comme les tissus sont pigmentés
chez la Caille, c'est un moyen simple pour constater immédiatement la présence
du mesenchyme axial dans les greffons. Les résultats sont comparables à ceux
qu'on a obtenus avec le mesenchyme axial de l'embryon de Poulet.
(c) Associations croisées aile-patte: On a surtout étudié l'évolution du territoire
présomptif de l'aile associé au mesenchyme axial ' patte ' ; en effet, au même stade,
le territoire de l'aile peut être isolé plus facilement que celui de la patte. Les
associations sont homo- ou hétérochroniques. Les résultats sont groupés dans le
tableau 10. On a obtenu 21 membres, parmi lesquels on reconnaît parfaitement
sept pattes (fig. 27) et 14 ailes (flg. 28). C'est la plaque latérale qui détermine la
qualité aile ou patte de la différenciation.
Donc: la qualité 'aile' ou 'patte' du membre est déterminée dans la plaque
latérale bien avant que la différenciation puisse se faire de manière autonome.
Le mesenchyme axial 'aile' ou 'patte' provoque la différenciation de l'aile ou
celle de la patte, selon l'origine de la plaque latérale qui lui est associée.
Dans tous les cas, les greffons qui ont été étudiés sont ceux qu'on a retrouvés
dans la cavité générale de l'hôte, sans relations tissulaires directes avec les
parois du corps. Il faut cependant noter que, dans 23 cas, des greffons constitués
de matériel A ou P, excisé sur des embryons de moins de 22 paires de somites,
se sont développés en relation étroite avec le base interne de l'aile de l'hôte. On
a alors involontairement mis en rapport le territoire de membre greffé et le
136
M. P I N O T
100//
V.
J**
25
26
1 mm
28
29
La morphogenèse précoce des membres
137
mesenchyme axial de l'hôte, au niveau de l'aile. Dans 15 cas, un membre s'est
développé à partir du greffon (fig. 29). C'est une aile (11 cas), ou une patte
(4 cas), suivant que le matériel greffé était de type A ou P. Dans un cas, le greffon
était formé de deux territoires d'aile (A + A) prélevés sur un embryon de 16
paires de somites; ils se sont développés, et on a obtenu trois ailes, deux du
Tableau 10. Associations croisées aile-patte
Age de la plaque latérale
Nombre total de cas
19-21 paires de somites
32
Moins de 19 paires de somites
29
Développement
du membre
12
(37,5 %)
9
(31 %)
côté interne, une du côté externe (l'aile normale de l'hôte), ayant une base commune. Cette différenciation en membre du jeune territoire présomptif greffé ne
s'est jamais produite dans les cas, plus rares (15) où il s'est développé en relation
étroite avec la base du mesenchyme axial intermédiaire entre l'aile et la patte.
Fig. 25. Coupe transversale au niveau du greffon, dans un blastoderme cultivé 10 h.
Le greffon, beaucoup plus âgé, s'est bien intégré dans le blastoderme. Du côté gauche,
à partir du mesenchyme somitique du blastoderme, on trouve le demi-tube nerveux,
le mesenchyme somitique et le mesonephros du greffon, et enfin la somatopleure
du blastoderme, parfaitement soudée au greffon.
Fig. 26. Plaque latérale prélevée au niveau de l'aile sur un embryon de 18 paires de
somites, et associée au mesenchyme axial prélevé au niveau de l'aile sur un embryon
de 25 paires de somites. Développement d'une aile complète.
Fig. 27. Plaque latérale prélevée au niveau présomptif de la patte sur un embryon de
19 paires de somites, et associée au mesenchyme axial prélevé avec une moitié du
tube nerveux au niveau de l'aile sur le même embryon (technique 1). Développement
de structures de patte parfaitement reconnaissables. Vertèbres.
Fig. 28. Territoire présomptif d'aile d'un blastoderme de 15 paires de somites, associé
au mesenchyme axial 'patte' prélevé sur un embryon de 30 paires de somites. Développement d'une aile.
Fig. 29. Un territoire présomptif d'aile, prélevé sur un embryon de 17 paires de
somites et greffé seul dans le cœlome d'un embryon de 2 | jours, s'est développé en
relation, du côté interne, avec le mesenchyme axial de l'hôte au niveau de l'aile. Sur
la photo: à droite l'aile de l'hôte; à gauche, l'aile formée à partir du greffon. Il y a
eu association accidentelle du territoire présomptif greffé, incapable d'évolution
autonome, et du mesenchyme axial 'aile' de l'hôte, qui a provoqué la différenciation
du greffon.
som. = somatopleure, gr. = greffon, H. = humérus, C. = cubitus, R. = radius,
r. 1, 2, 3 = rayons 1, 2, 3, V. = vertèbres, T. = tibia, P. = péroné, Mt. = métatarsiens, D. = doigts, ce. = ceinture, s. = soudure,//. = aile de l'hôte. Colorations:
fig. 25: glychémalun-éosine; fig. 26 à 29: technique de Lundvall.
138
M. P I N O T
(4) Les associations expérimentales:
associations
membre-mésenchyme axial ' non membre '
territoire
présomptif
de
Elles sont le plus souvent hétérochroniques. On prélève le mesenchyme axial
avec le tube nerveux, au niveau du cou (somites 6 à 12) sur des embryons de
15 à 25 paires de somites, au niveau intermédiaire entre l'aile et la patte (somites
22 a 25) sur des embryons de 22 à 35 paires de somites. Lorsque la technique
2 est utilisée, le greffon de mesenchyme axial est toujours placé de façon à
être associé à une région de la plaque latérale plus grande que la région présomptive de l'aile (parfois deux bandes des somites 22 à 25 sont mises bout à bout).
Nous pensons que la plaque latérale, au niveau étudié, est ainsi parfaitement
préservée de toute influence axiale de la part du blastoderme-hôte pendant les
8 à 10 h de culture. Si la plaque latérale est associée avant le stade de 19 paires
de somites, sa différenciation est comparable à celle qu'on obtient lorsqu'elle
est greffée seule (fig. 30, 31). D u cartilage peut se différencier, mais aucune
structure de membre ne se forme. Si la plaque latérale est associée au stade de
19 à 21 paires de somites, les membres qui se différencient (tableau 9), présentent
un squelette normal ou des déficiences légères (fig. 32, 33). Ils sont comparables
à ceux qu'on obtient lorsque la plaque latérale présomptive de membre de même
âge est associée au mesenchyme axial prélevé au niveau du membre. Il faut
remarquer que, si les somites 22 à 25 sont présents dans le greffon, le plus
souvent des côtes se forment (fig. 30). Des vertèbres, incomplètes se différencient
toujours car le tube nerveux, présent, joue son rôle inducteur.
Développement de la plaque latérale présomptive de membre associée au mesenchyme axial 'non membre'.
Fig. 30. Territoire présomptif d'aile d'un blastoderme de 16 paires de somites,
associé au mesenchyme axial prélevé au niveau des somites 22 à 25 avec le tube nerveux sur un embryon de 28 paires de somites. Vertèbres et côtes. Pas de membre.
Fig. 31. Deux bandes controlatérales de mesenchyme axial, prélevées avec le demitube nerveux au niveau des somites 8 à 12 (cou), sur un embryon de 20 paires de
somites, sont greffées au niveau présomptif de l'aile sur des blastodermes de 16 (A) et
18 (B) paires de somites. Pas de développement du membre. Le mesenchyme axial a
formé des vertèbres incomplètes, la plaque latérale des éléments cartilagineux insignifiants en A, plus importants en B.
Fig. 32. Aile formée à partir d'un territoire présomptif d'aile de 20 paires de somites
associé en culture de blastoderme au mesenchyme axial prélevé avec le tube nerveux
au niveau des somites 7 à 11 sur un embryon de 23 paires de somites.
Fig. 33. Aile qui s'est développée à partir d'un territoire présomptif d'aile excisé au
stade de 21 paires de somites, et associé sur un fragment de peau au mesenchyme
axial prélevé avec le tube nerveux au niveau des somites 22 à 25, sur un embryon de
28 paires de somites.
V. = vertèbres, p.l. = plaque latérale associée, c. = formations cartilagineuses,
H. = humérus, s. = soudure, C. = cubitus, r. 1, 2, 3 = rayons 1, 2, 3; cô. — côtes.
Coloration: technique de Lundvall.
La morphogenèse précoce des membres
139
/>./.
1 mm
I
1
30
31
r.2
1 mm
I
1 mm
I
I
32
I
33
140
M. P I N O T
D. Développement de la région de la plaque latérale située entre aile et patte
associée au mesenchyme axial prélevé au niveau 'membre''
(1) Technique. Nous nous sommes demandé si le mesenchyme axial prélevé au
niveau 'membre' était capable de provoquer la formation de structures de
membre dans la région de la plaque latérale située entre l'aile et la patte.
La technique 2 a été seule utilisée. Le blastoderme est mis en culture au stade
de 18 à 24 paires de somites. La limite entre le mesenchyme axial et la plaque
Tableau 11. Association de la région de la plaque latérale située entre
aile et patte et de mesenchyme axial prélevé au niveau de Vaile.
Associations
Région de la plaque
latérale étudiée
Niveau des somites
21 à 26
Niveau des somites
21 à 27-28
Témoins
Nombre
de cas
Membre
Côtes
Nombre
de cas
Membre
28
0
5
20
0
20
17
8
(47 %)
3
19
8
(42,1 %)
18
Côtes
latérale est bien visible, même dans la région postérieure de l'embryon. Le greffon
est constitué d'une bande de mesenchyme axial prélevé avec le tube nerveux
au niveau de l'aile sur des embryons de 20 à 24 paires de somites. Cette bande
de mesenchyme axial est placée entre le mesenchyme axial et la plaque latérale
du blastoderme, en arrière du 20e somite. Après 8 à 10 h de culture, le blastoderme a 25 à 30 paires de somites. Le greffon se trouve le plus souvent au niveau
des somites 20-21 à 27-28. On découpe alors la région du greffon qui correspond
au niveau des somites 21 à 26 et la plaque latérale qui lui est associée. Dans
Développement de la région de la plaque latérale située entre l'aile
et la patte, associée au mesenchyme axial 'membre'.
Fig. 34. Mesenchyme axial prélevé avec le tube nerveux au niveau de l'aile au stade
de 22 paires de somites, et greffé sur un blastoderme de 24 paires de somites au
niveau des somites 21 à 26. Pas de développement du membre. Des côtes, réduites,
se sont formées latéralement.
Fig. 35. Mesenchyme axial prélevé avec le tube nerveux au niveau de l'aile sur un
embryon de 20 paires de somites, et greffé sur un blastoderme de 24 paires de somites.
Après 9 h de culture, le blastoderme a 30 paires de somites. Le greffon se trouve au
niveau des somites 21 à 28. Le greffon et toute la région de la plaque latérale qui lui
est associée sont excisés ensemble et greffés dans le cœlome d'un embryon de 3 jours.
Un doigt s'est développé, à partir de la région antérieure du territoire de la patte
(niveau des somites 26 à 28).
Fig. 36. Témoin. Blastoderme de 22 paires de somites, cultivé 10 h. Le blastoderme
a atteint le stade de 28 paires de somites. Le mesenchyme axial avec le tube nerveux
et la plaque latérale sont prélevés au niveau des somites 21 à 26. Vertèbres et côtes.
V. = vertèbres, cô. = côtes, D. = doigt. Coloration: Technique de Lundvall.
La morphogenèse précoce des membres
141
1 mm
34
1 mm
35
1 mm
36:
142
M. P I N O T
quelques cas, on prend l'ensemble au niveau des somites 21 à 27-28. Ce matériel
est greffé dans le cœlome d'un embryon de 3 jours.
Témoins: les somites 21 à 26 ou 21 à 27-28 controlatéraux sont excisés avec
le tube nerveux et la plaque latérale adjacente. L'ensemble est greffé.
(2) Résultats (tableau 11). Lorsque la plaque latérale associée correspond au
niveau des somites 21 à 26, dans aucun cas il n'y a formation de structures de
membre. Des côtes, réduites, se forment dans 5 cas sur 28 (fig. 34). Lorsque la
plaque latérale associée correspond au niveau des somites 21 à 27-28, des
structures de patte se forment dans 8 cas sur 17 (47 %). Dans six cas, il s'agit
d'un seul doigt (fig. 35); dans un cas, on obtient deux doigts, et dans un cas
enfin, une petite patte à sept doigts. Dans ce dernier cas, la plaque latérale
associée correspondait au niveau des somites 21 à 28, c'est-à-dire que le 1/3
antérieur de l'ébauche de la patte avait été excisé. Le tube nerveux étant toujours
présent, des vertèbres se différencient dans tous les cas.
Témoins: si le matériel greffé correspond au niveau des somites 21 à 26, des
vertèbres et des côtes se développent de manière constante (fig. 36). Si le
matériel greffé correspond au niveau des somites 21 à 27-28, des structures de
patte se développent dans huit cas sur 19 (42,1 %). 11 s'agit de un ou deux doigts.
Des côtes se forment également (18 cas).
(3) Conclusions: La région de la plaque latérale située au niveau des somites
21 à 26 n'est pas capable de répondre à l'action stimulatrice du mesenchyme
axial prélevé au niveau du membre.
Au stade de l'expérience, la limite antérieure du territoire de la patte se trouve
bien au niveau de 26e somite. La partie antérieure du territoire de la patte
possède des propriétés régulatrices importantes. Ce fait avait déjà été signalé
par Rudnick (1946) et Rawles (1947).
V. QUELLE EST LA PARTIE ACTIVE DU MESENCHYME AXIAL?
Le mesenchyme axial est constitué par le mesenchyme somitique et la pièce
intermédiaire, ébauche du rein embryonnaire. On peut se demander quel est le
rôle joué par chacun de ces deux tissus.
A. Rôle du mesonephros dans le développement du membre
Nous avons constaté que, au stade de 10 à 14 paires de somites, le membre se
développe si son aire présomptive est excisée au ras du tube nerveux. La pièce
intermédiaire est donc présente, mais à ce stade, le mesonephros ne se différencie jamais (tableau 3). La même remarque peut être faite au niveau du membre
postérieur: le mesonephros ne se différencie pas si le territoire P + MA est
excisé sur des embryons de moins de 24 paires de somites, l'extrémité caudale du
canal de Wolff étant antérieure au niveau prélevé (tableau 6). Cependant, la
patte se différencie encore à partir de matériel pris au stade de 13 paires de
somites.
La morphogenèse précoce des membres
143
De plus, nous avons fait une série expérimentale. Le pronephros, d'où est
issu le canal de WolfT, s'étend postérieurement jusqu'au 15e somite. Lorsqu'on
arrête le canal de WolfT selon la technique de Bishop-Calame (1966), l'obstacle
est donc nécessairement placé au niveau de l'ébauche de l'aile (somites 17 à 20).
Mais, du côté opéré, lorsque le mesonephros ne se différencie pas en arrière
de l'obstacle (huit cas), le bourgeon de patte se forme normalement. Le développement du membre est donc indépendant de la différenciation du mesonephros.
Dans tous les cas évoqués, si le mesonephros n'a pas été induit, la pièce intermédiaire indifférenciée est présente.
B. Rôle de la pièce intermediaire indifférenciée dans le développement
du membre
Nous avons réalisé l'expérience suivante: nous avons associé, suivant la
technique 2 décrite plus haut, la plaque latérale présomptive de membre au
stade de 15 à 19 paires de somites, et une bande de mesenchyme somitique
prélevé avec le tube nerveux, mais sans mesonephros, au niveau de l'aile, sur
un embryon de 30 à 32 paires de somites. A ce stade et à ce niveau le mesonephros différencié se trouve sous le mesenchyme somitique; il peut être excisé.
Le greffon ne comporte alors ni mesonephros, ni pièce intermédiaire. L'association est plus difficile; l'excision du mesonephros lèse le bord du greffon qui
adhère moins étroitement à la plaque latérale. Quatorze greffons de ce type ont
été étudiés; quatre ailes se sont développées. Dans un cas, l'examen histologique
a montré qu'un peu de mesonephros était resté en place; dans les trois autres
cas, le mesonephros était absent.
C. Conclusion
C'est le mesenchyme somitique qui est responsable de la stimulation morphogène qui s'excerce sur le mésoderme présomptif de membre.
VI. MODE D ' A C T I O N DU MESENCHYME SOMITIQUE
Deux hypothèses peuvent être proposées. Le mesenchyme somitique peut
apporter une contribution matérielle à l'édification du membre. Son influence
peut aussi s'exercer par voie chimique. La première hypothèse a été soumise à
une vérification expérimentale. Saunders (1948 b), après avoir marqué au
charbon les somites 15 à 20, chez des embryons de 60 à 90 h d'incubation, a
constaté que, aux stades considérés, les somites ne participent pas à l'édification
de l'aile. Nous avons repris les expériences de Saunders, à un stade plus précoce.
A. Technique
Nous avons marqué la bordure externe du mesenchyme somitique, ou le
mesenchyme somitique lui-même au niveau présomptif de l'aile, sur 74 embryons
de 10 à 22 paires de somites. Dans 32 cas, la marque introduite est du charbon
144
M. P I N O T
animal mouillé par de l'albumine; dans 42 cas, la marque est constituée par de
l'encre de Chine à l'état pâteux. Deux ou trois marques sont faites sur le même
embryon. Les 57 survivants sont sacrifiés à 5 jours. Trente cas seulement sont
retenus. Les autres sont éliminés, parce que les marques, introduites alors que
le mesenchyme somitique n'était pas encore segmenté, sont retrouvées à un
niveau qui ne correspond pas aux conditions expérimentales. Les embryons
retenus sont soumis à une étude histologique.
Témoins: sur 14 embryons de 16 à 28 paires de somites, les marques sont
introduites au niveau des somites 21 à 26. Seno (1961) a montré que le matériel
costal, en pénétrant dans la plaque latérale, entraînait une fine marque placée en
bordure des somites dans cette région. Cette série nous permettra donc d'apprécier la valeur de la technique de marquage que nous avons utilisée.
B. Résultats
Les marques d'encre de Chine sont constituées de très fines particules, les
marques de charbon de particules un peu plus grosses. Les marques des deux
types, placées au niveau intermédiaire entre l'aile et la patte, sont nettement
entraînées en direction de la plaque latérale par la migration massive du matériel
somitique qui formera les côtes et les muscles intercostaux. En aucun cas, les
marques placées au niveau de l'aile ne sont déplacées.
C. Conclusion
Le mesenchyme somitique ne participe pas de façon massive à l'édification du
membre. Un passage cellulaire plus fin ne pourrait probablement pas être mis
en évidence par cette technique.
CONCLUSIONS ET DISCUSSION
Le territoire de l'aile ou de la patte, isolé et greffé dans le cœlome d'un
embryon de 3 jours, est capable de différenciation autonome à partir du stade
de 25 paires de somites. En présence du mesenchyme axial (intermédiaire et
somitique) adjacent, l'aile se différencie aux stades de 10 à 24 paires de somites,
la patte aux stades de 13 à 24 paires de somites. De plus, aux stades de 25 à
29-30 paires de somites, la différenciation du membre, aile ou patte, est améliorée lorsque le mesenchyme axial est présent. Le mesenchyme axial exerce donc
une action déterminante sur la morphogenèse du membre. Du cartilage peut se
différencier en l'absence du mesenchyme axial, dans les greffons provenant de
matériel prélevé avant le stade de 25 paires de somites : l'histogenèse du cartilage
est indépendante de mesenchyme axial. Le rôle du mesenchyme axial dans la
morphogenèse du membre ne peut être attribué à une augmentation de la masse
du greffon. Le mesenchyme axial ne peut être remplacé par un fragment de
tissu plus âgé (foie, peau, mesonephros). Le mesenchyme axial prélevé au niveau
'aile' ou 'patte' exerce seul une action stimulatrice morphogène capable de
La morphogenèse précoce des membres
145
provoquer la différenciation d'un territoire présomptif de membre d'embryon
de moins de 19 paires de somites. Le mesenchyme axial prélevé au niveau du
cou (somites 6 à 12), ou intermédiaire entre l'aile et la patte (somites 22 à 25)
peut provoquer la différenciation d'un territoire de membre d'embryon ayant
déjà au moins 19 paires de somites. Dans le cas des associations croisées ailepatte, c'est la plaque latérale qui détermine la qualité aile ou patte de la différenciation. La stimulation morphogène du mesenchyme axial n'est pas qualitative.
La plaque latérale est capable de répondre à la stimulation morphogène du
mesenchyme axial aux deux niveaux 'membre' seulement. La région de la plaque
latérale située entre l'aile et la patte ne se différencie pas en membre, lorsqu'elle
est associée au mesenchyme axial 'membre'. Dans ces conditions, la formation
d'un membre apparaît comme résultant de la conjonction d'une stimulation
morphogène axiale forte, et d'une réponse qualitative de la plaque latérale. La
plaque latérale, avant le stade de 24 paires de somites, se montre formée d'une
région intermédiaire incapable de répondre à la stimulation morphogène
'membre', et de deux territoires 'membre', dont la qualité antérieure ou
postérieure est déjà déterminée, mais qui ont besoin de la stimulation morphogène axiale pour se différencier en membre. Nous avons montré que la stimulation morphogène axiale s'exerce sur le mésoderme latéral plus longtemps qu'il
n'est nécessaire pour que le développement normal du membre soit assuré.
Prélevé au stade de 35 et 38 paires de somites, le mesenchyme axial 'membre'
provoque la différenciation d'un territoire présomptif de membre incapable de
développement autonome. Le mesenchyme somitique est seul responsable de la
stimulation morphogène qui s'exerce sur le territoire présomptif du membre;
le mesonephros ou la pièce intermédiaire indifférenciée ne sont pas en cause.
Une participation matérielle massive du mesenchyme somitique à l'édification
du membre n'a pu être mise en évidence. Le mode d'action du mesenchyme
somitique sur le mésoderme présomptif de membre est actuellement à l'étude.
Nos conclusions sont en accord avec celles de Hamburger (1938), pour ce
qui concerne le stade où le membre devient capable de différenciation autonome.
Rudnick (1945) a obtenu le développement de membres à partir de matériel
beaucoup plus jeune, mais en greffant, non le territoire de membre isolé, mais
une portion importante du blastoderme. Les examens histologiques effectués
par Rudnick ont révélé des structures comparables à celles que nous avons
obtenues; une différence réside dans la présence fréquente des formations
nerveuses, totalement absentes dans nos greffons. Mais nous savons que
l'axe nerveux ne joue aucun rôle dans la différenciation du membre, au
moins à partir du stade de 11 paires de somites : ce fait, signalé par Rudnick,
a été démontré par Lutz & Mamet (1955); les membres qui se développent
sont innervés si le tube nerveux est présent, ils ne le sont pas si le mesenchyme
somitique seul est greffé avec le territoire présomptif de membre; l'innervation
n'a aucune influence sur la morphogenèse squelettique. Chaube (1959)
a observé la différenciation du territoire présomptif de l'aile prélevé au
146
M. P I N O T
stade de 4 paires de somites. A ce moment, le territoire présomptif de l'aile
ne peut être isolé, et l'expérience de Chaube est de même type que celle de
Rudnick. Il faut noter de plus que Chaube a greffé le territoire du membre
dans la région immédiatement antérieure ou postérieure à l'ébauche de l'aile
d'embryons de 3 jours. Elle a pu ainsi mettre le greffon sous l'influence stimulatrice du mesenchyme somitique de l'hôte. Mais cette influence n'expliquerait
pas seule le développement de matériel aussi jeune.
Des rapports entre le mesenchyme somitique et le territoire des membres ont
été signalés par plusieurs auteurs, et chez des espèces animales différentes. Chez
les Amphibiens, Amano (1960, 1962), expérimentant sur Triturus et Pleurodeles,
aboutissait à la conclusion que le mésoderme somitique était nécessaire au
développement du membre. Selon l'auteur, le tissu somitique jouerait un rôle
inducteur, mais apporterait également une contribution matérielle à l'édification
du membre. Finnegan (1962, 1963) a montré que, chez Amblystoma et Taricha,
l'histogenèse du membre transplanté est améliorée en présence du mesenchyme
somitique. Muchmore (1957) a attribué au pronephros et au mesenchyme
somitique un rôle conjugué dans la détermination des membres chez Amblystoma. Il faut noter aussi qu'une contribution myotomiale à la musculature des
membres a été signalée par Griffiths (1959), chez Bufo, Megophys et Rana, par
Milaire (1956, 1957) chez le Rat et chez certains Reptiles. Chez l'embryon
d'Orvet (Raynaud & Vasse, 1968), les somites adjacents entrent en relation avec
l'ébauche du membre antérieur. D'après l'auteur, une influence somitique
pourrait être à l'origine des modifications histologiques qu'il a alors observées
dans l'ébauche.
Chez les Oiseaux, une participation matérielle du mesenchyme somitique à
l'édification du membre n'a pu être démontrée. Un rôle du mesenchyme somitique dans les premiers stades du développement du membre chez l'embryon
de Poulet et de Canard a déjà été signalé par Murillo-Ferrol (1963, 1965).
L'auteur a placé un obstacle (tube cardiaque, vésicule oculaire, mica) entre le
mesenchyme somitique et le territoire du membre antérieur ou postérieur, aux
stades 13 à 18 de H. & H. Aux stades 13 à 16 de H. & H. (19 à 28 paires de
somites), lorsque l'obstacle a été placé au niveau exact du territoire du membre,
il s'est produit une duplication de l'ébauche. Si l'obstacle était plus long que
la base de l'ébauche, l'auteur a observé des cas d'agénésie du membre: il n'a
pas précisé combien de fois cet effet avait été obtenu et combien d'expériences
de ce type avait été réalisées. D'après l'auteur, lorsqu'un filtre Millipore a été
placé comme obstacle, le membre s'est toujours développé, parfois micromèle.
L'auteur en a conclu que le mesenchyme somitique exerçait son influence par
l'intermédiaire d'un 'facteur somitique' de nature chimique. Murillo-Ferrol a
précisé que, si l'obstacle a été mis en place aux stades 17 et 18 de H. & H., le
membre était parfois micromèle ou présentait des altérations distales. De plus,
les embryons opérés étaient souvent atteints de cœlosomie. Notons aussi que
l'auteur a obtenu des cas d'agénésie du membre en séparant le mesenchyme
La morphogenèse précoce des membres
147
somitique du territoire du membre au stade 16 de H. & H. (26 à 28 paires de
somites). Or, à ce stade, le membre est capable de se différencier de manière
autonome. La présence d'un obstacle, nous l'avons nous-même vérifié, agit par
son poids, par les perturbations circulatoires qu'il provoque, créant ainsi des
lésions qui s'ajoutent à celles qui sont effectivement dues à l'absence de continuité
entre le mesenchyme somitique et le territoire du membre. Le présent travail
nous permet de mettre en évidence par une méthode différente le rôle du
mesenchyme somitique, et d'aborder certains problèmes restés sans solution.
Murillo-Ferrol assimile le 'facteur somitique' au 'facteur de maintien' de la
crête, dont l'existence a été affirmée par Saunders (1949). Notons toutefois que
Zwilling (1964) a démontré que le mesenchyme somitique, prélevé à différents
niveaux sur un embryon de 3 jours, et placé dans un ectoderme de membre,
était incapable de maintenir la crête apicale, qui disparaissait après 30 à 40 h.
Or, à 3 jours, le mesenchyme somitique possède toujours ses propriétés stimulatrices. 11 faut donc admettre que le mésoderme latéral est un relai nécessaire
entre le mesenchyme somitique et l'ectoderme, pour que la crête apicale se
forme.
Kieny (1959, 1960) a montré que le mésoderme de membre, prélevé à partir
du stade de 20 paires de somites et greffé dans le flanc, entre l'aile et la patte,
sous l'ectoderme banal, induisait la formation d'un membre surnuméraire. Or,
à ce stade, nous avons vu que le mésoderme de membre, recouvert de son
ectoderme, ne se développait pas en membre de manière autonome. Mais, au
stade de 20 paires de somites, le mésoderme présomptif démembre peut répondre
à la faible stimulation exercée par le mesenchyme somitique de la région située
entre l'aile et la patte. On peut expliquer ainsi qu'il puisse provoquer la formation d'un membre surnuméraire. Le mésoderme latéral de la région située entre
l'aile et la patte n'est pas capable de répondre à une stimulation 'membre'; il
faut donc se demander si le membre surnuméraire qui apparaît n'est pas
essentiellement constitué par le mésoderme présomptif greffé.
RESUME
1. On a étudié le développement de l'ébauche ou du territoire présomptif de
membre, prélevé aux stades de 30 h à 1\ jours d'incubation sur l'embryon de
Poulet, et greffé dans le cœlome d'un embryon-hôte de 3 jours d'incubation. Le
territoire de l'aile ou de la patte, isolé, est capable de différenciation morphologique autonome, en greffe cœlomique, s'il a été prélevé au stade de 25 paires de
somites au moins.
2. Si l'on prélève le mesenchyme axial (somitique et intermédiaire) adjacent
avec le territoire présomptif dumembre, l'aile se différencie, en greffe cœlomique,
à partir de matériel prélevé au stade de 10 à 24 paires de somites, la patte à partir
de matériel prélevé au stade de 13 à 24 paires de somites. Le mesenchyme axial
exerce une action stimulatrice sur la morphogenèse du membre. En l'absence du
IO
E M B 23
148
M. P I N O T
mesenchyme axial, du cartilage peut se différencier à partir de matériel prélevé
au stade de 7 à 25 paires de somites: la chondrogenèse dans le mesenchyme
présomptif de membre est indépendante du mesenchyme axial.
3. Le rôle du mesenchyme axial ne peut être attribué à une augmentation de
la masse du greffon. Un tissu prélevé sur un embryon plus âgé (foie, peau,
mesonephros), associé au territoire de membre, n'exerce pas une action comparable à celle du mesenchyme axial sur le développement du membre.
4. On a étudié l'évolution en greffe cœlomique du territoire présomptif de
membre incapable de différenciation autonome, associé au mesenchyme axial
prélevé à différents niveaux. Le mesenchyme axial prélevé au niveau 'membre'
(aile ou patte) possède seul la propriété de stimuler le développement du membre
à partir d'un territoire présomptif prélevé avant le stade de 19 paires de somites.
Le mesenchyme axial prélevé au niveau du cou (somites 6 à 12), ou au niveau
intermédiaire entre l'aile et la patte (somites 22 à 25) exerce une faible action
stimulatrice, permettant le développement d'un territoire présomptif de membre
au stade de 19 à 24 paires de somites. Le mesenchyme axial 'membre' possède
la propriété de stimuler le développement du membre jusqu'au stade de 35 (aile)
et 38 (patte) paires de somites au moins. L'action stimulatrice du mesenchyme
axial s'exerce donc sur le mésoderme latéral plus longtemps qu'il n'est nécessaire pour qu'un développement normal du membre soit assuré. Le mesenchyme
axial 'aile' ou 'patte' provoque la différenciation de l'aile ou celle de la patte,
selon l'origine du fragment de plaque latérale qui lui est associé. Aux stades
étudiés, c'est la plaque latérale qui détermine la qualité 'aile' ou 'patte' de la
différenciation.
5. On a étudié l'évolution en greffe cœlomique, de la région de la plaque
latérale située entre l'aile et la patte (niveau des somites 21 à 26) associée au
mesenchyme axial 'membre'. Cette région de la plaque latérale n'est pas capable
de répondre à la stimulation morphogène exercée par le mesenchyme axial
'membre': dans aucun cas, on n'a observé le développement d'un membre.
6. Le mesenchyme somitique est seul responsable de l'action stimulatrice
morphogène qui s'exerce sur le mésoderme latéral présomptif de membre. Le
mesonephros ou la pièce intermédiaire indifférenciée ne sont pas nécessaires; en
leur absence, le mesenchyme somitique provoque le développement d'un membre
à partir d'un territoire présomptif associé, incapable d'évolution autonome.
7. On a abordé le problème du mode d'action du mesenchyme somitique.
Des marques colorées placées précocement en bordure du mesenchyme somitique, au niveau présomptif du membre, ne se déplacent pas: il faut donc
exclure l'hypothèse d'une participation matérielle massive du mesenchyme
somitique à l'édification du membre. Ce problème est actuellement à l'étude.
La morphogenèse précoce des membres
149
SUMMARY
The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis
of the limbs in the fowl embryo
1. Coelomic grafts were used to study the development of the limb primordia
or of the presumptive limb territory taken from chick embryos of 30 h to 3% days
incubation; the grafts were made into 3-day chick embryo hosts. The isolated
wing or leg territory is capable of autonomous morphological differentiation as
a coelomic graft only if taken at the stage of 25 pairs of somites or later.
2. If the adjacent axial mesenchyme (somitic and intermediate) is removed
with the presumptive limb territory, the wing differentiates as a coelomic graft
from material taken at 10-24 pairs of somites, the leg from material taken
at 13-24 pairs of somites. Thus, the axial mesenchyme plays a role of stimulation
in the first stages of limb morphogenesis. In the absence of the axial mesenchyme,
material taken at the stage of 7-25 pairs of somites can differentiate into cartilage.
The chondrogenesis in the presumptive mesenchyme of the limb is independent
of the axial mesenchyme.
3. The role of the axial mesenchyme cannot be attributed to an increase in
the mass of the graft. Tissue taken from an older embryo (liver, skin, mesonephros) associated with the limb territory does not exercise a comparable action
on limb development.
4. The evolution of coelomic grafts of the presumptive limb territory associated with axial mesenchyme taken at different levels was studied; this territory
is taken while it is still incapable of autonomous differentiation. Only the axial
mesenchyme taken at the level of the limb (wing or leg) possesses the property
of stimulating the development of a limb from presumptive territory taken before
the stage of 19 pairs of somites. Axial mesenchyme taken at the level of the neck
(somites 6-12) or at the level intermediate between the wing and the leg (somites
22-25) exerts only a feeble stimulatory action, allowing the development of a
presumptive limb territory at the stage of 19-24 pairs of somites. 'Limb' axial
mesenchyme is able to stimulate the development of the limb at least up to the
stage of 35 (wing) and 38 (leg) pairs of somites. Thus the stimulatory action of
the axial mesenchyme is exercised on the lateral mesoderm longer than is
necessary to ensure normal development of the limb. The axial mesenchyme
'wing' or 'leg' provokes the differentiation of the wing or of the leg depending
on the origin of the fragment of lateral plate with which it is associated. At the
stages studied, it is the lateral plate which determines whether the differentiation
is winglike or leglike.
5. The evolution of the region of the lateral plate situated between the wing
and the leg (at the level of the 21st—26th pair of somites) associated with the
'limb' axial mesenchyme was studied, using coelomic grafts. This region of the
lateral plate is incapable of responding to the morphogenic stimulus exerted
by the 'limb' axial mesenchyme: in no case was the development of a limb seen.
IO-2
150
M. P I N O T
6. The somitic mesenchyme alone is responsible for the stimulatory action
exercised on the presumptive limb mesoderm. The mesonephros or the undifferentiated intermediate mesoderm is not necessary; in their absence the
somitic mesenchyme provokes the development of the limb from an associated
presumptive territory incapable of autonomous evolution.
7. The problem of the mode of action of somitic mesenchyme was considered.
Markers placed during the early stages alongside the somitic mesenchyme at the
level of the limb do not move, therefore the hypothesis of an important material
participation of somitic mesenchyme in the building of the limb can be excluded.
Further work is being continued along these lines.
TRAVAUX CITES
H. (1960). Role of the somitic tissue in the limb development of the Urodelan
Amphibia. Archs Biol., Paris 71, 343-66.
AMANO, H. (1962). Analyse du développement des membres après exogastrulation partielle.
Archs Biol., Paris 73, 205-23.
BISHOP-CALAME, S. (1966). Etude expérimentale de Porganogenèse du système urogenital de
l'embryon de Poulet. Archs Anat. microsc. Morph, exp. 55, 215-309.
CHAUBE, S. (1959). On axiation and symmetry in transplanted wing of the chick. /. exp. Zool.
140, 29-77.
FELL, H. B. (1939). The origin and developmental mechanics of the avian sternum. Phil.
Trans. R. Soc. B 229, 407-64.
FINNEGAN, C. V. (1962). An analysis of the postgastrula differentiation of the hypomere. III.
The histogenic competence of Salamander hypomere in heterotopic transplantation. / .
Embryol. exp. Morph. 10, 293-314.
FINNEGAN, C. V. (1963). Observations of dependent histogenesis in Salamander limb development. /. Embryol. exp. Morph. 11, 325-38.
GRIFFITHS, I. (1959). The embryonic origin of the intrinsic limb musculature in Amphibia,
Salientia. Experientia 15, 150-52.
HAMBURGER, V. (1938). Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb
primordia of 2-day chick embryos. /. exp. Zool. 11, 379-400.
HAMBURGER, V. & HAMILTON, H. L. (1951). A series of normal stages in the development of
the chick embryo. /. Morph. 88, 49-92.
KiENY, M. (1959). Rôle du mésoderme dans le développement du bourgeon de membre chez
l'embryon de Poulet. C. r. hebd. Séanc. Acad. Sei., Paris 249, 1571-3.
KIENY, M. (1960). Rôle inducteur du mésoderme dans la différenciation précoce du bourgeon
de membre chez l'embryon de Poulet. /. Embryol. exp. Morph. 8, 457-67.
LE DOUARIN, N. (1965). Etude expérimentale de l'organogenèse du tube digestif et du foie
chez l'embryon de Poulet. Bull. biol. Fr. Belg. 98, 544-676.
LUNDVALL, H. (1927). Färbung des Skelettes in durchsichtigen Weichteilen. Anat. Anz. 62,
353-73.
LUTZ, H. & MAMET, G. (1955). Influence du système nerveux sur le développement de
l'ébauche de l'aile des Oiseaux en greffe chorio-allantoidienne. C. r. hebd. Séanc. Acad.
Sei., Paris 240, 1271-3.
MILAIRE, J. (1956). Contribution à l'étude morphologique et cytochimique des bourgeons de
membres chez le Rat. Archs Biol., Paris 67, 297-391.
MILAIRE, J. (1957). Contribution à la connaissance morphologique et cytochimique des
bourgeons de membres chez quelques Reptiles. Archs Biol., Paris 68, 429-512.
MUCHMORE, W. B. (1957). Differentiation of the trunk mesoderm in Amblystoma maculatum.
II. Relation of the size of presumptive somite expiants to subsequent differentiation. J.
exp. Zool. 134, 293-313.
AMANO,
La morphogenèse précoce des membres
151
MURILLO-FERROL, N. L., (1963). Analisis experimental de la participacion del mesoblasto
paraaxial sobre la morfogenesis de los miembros en el embrion de las Aves. An. Dessarrollo
11, 63-76.
MURILLO-FERROL, N. J. (1965). Etude causale de la différenciation la plus précoce de l'ébauche
morphologique des membres. Analyse expérimentale chez les embryons d'Oiseaux. Acta
anat. 62, 80-103.
PINOT, M. (1969Û). Etude expérimentale de la morphogenèse de la cage thoracique chez
l'embryon de Poulet; mécanismes et origine du matériel. / . Embryol. exp. Morph. 21, 149—
64.
PINOT, M. (19696). Culture in vitro de l'ébauche ou du territoire présomptif de l'aile de
l'embryon de Poulet. Archs Anat. microsc. Morph, exp. (sous presse).
RAWLES, M. E. (1947). Some observations of the developmental properties of thepresumptive
hind-limb area of the chick. Anat. Rec. 99, 648-9.
RAYNAUD, A. & VASSE, J. (1968). Les relations entre les somites et les ébauches des membres
antérieurs, chez l'embryon d'Orvet (Anguis fragilis L.) Archs Anat. microsc. Morph, exp.
57, 227-54.
RUDNICK, D. (1942). On the development of hind-limb elements in coelomic grafts of posterior areas of the chick blastoderm. Anat. Rec. 82, suppl. 51.
RUDNICK, D. (1945). Limb-forming potencies of the chick blastoderm including notes on
associated trunk structures. Trans. Conn. Acad. Arts Sei. 36, 353-77.
RUDNICK, D. (1946). Regulation and localization of the hind-limb bud of the chick embryo.
Anat. Rec. 94, 492-3.
SAUNDERS, J. W. (1948 a). The proximo-distal sequence of origin of the parts of the chick wing
and the role of the ectoderm. / . exp. Zool. 108, 363-403.
SAUNDERS, J. W. (19486). Do the somites contribute to the formation of the chick wing?
Anat. Rec. 100, 756.
SAUNDERS, J. W. (1949). An analysis of the role of the apical ridge of ectoderm in the development of the limb bud in the chick. Anat. Rec. 105, 87-88.
SENO, T. (1961). An experimental study on the formation of the body-wall in the chick. Acta
anat. 45, 60-82.
WOLFF, E T . (1936). Les bases de la tératogenèse expérimentale des Vertébrés amniotes
d'après les résultats de méthodes directes. Archs Anat. Histol. Embryol. 22, 1-382.
WOLFF, ET. (1949). Sur une technique de castration chez l'embryon d'Oiseau. C. r. Séanc. Soc.
Biol. 143, 526-9.
WOLFF, E T . & HAFFEN, K. (1952). Sur une méthode de culture d'organes embryonnaires
in vitro. Tex. Rep. Biol. Med. 10, 463-72.
WOLFF, E T . & SIMON, D. (1955). L'explantation et la parabiose in vitro de blastodermes
d'embryons de Poulet. L'organisation de la circulation extraembryonnaire. C. r. hebd.
Séanc. Acad. ScL, Paris 241, 1994-6.
ZWILLING, E. (1964). Development of fragmented and dissociated limb bud mesoderm.
Devi Biol. 9, 20-37.
(Manuscrit
reçu le 5 février
1969)