Diagnostic des carbapénémases : détection et caractérisation DOSSIER THÉMATIQUE

L. Poirel
128 | La Lettre de l’Infectiologue • Tome XXVIII - no 4 - juillet-août 2013
DOSSIER THÉMATIQUE
Carbapénémases
Diagnostic
des carbapénémases :
détection et caractérisation
Diagnostic of carbapenemases: detection and characterisation
L. Poirel*,**, L. Dortet*, P. Nordmann*,**
* Inserm U914 “Emerging Resistance
to Antibiotics” ; service de bactério-
logie-virologie, hôpital Bicêtre,
Le Kremlin-Bicêtre.
** Unité de microbiologie médicale et
moléculaire, département de méde-
cine, faculté de science, université de
Fribourg, Suisse.
Quels sont les besoins ?
L’émergence des entérobactéries productrices de
carbapénémases (EPC) à laquelle nous sommes
actuellement confrontés impose une prise en
charge énergique et volontariste (1). Pour cela,
il est essentiel de disposer d’outils efficaces de
diagnostic, élément clé pour le dépistage et/ou
le diagnostic rapide des EPC, mais aussi pour un
meilleur contrôle de leur dissémination. Certaines
régions du monde sont actuellement considérées
comme zones d’endémie (Inde, Grèce, Italie, etc.),
alors que d’autres ne sont confrontées pour l’instant
qu’à des cas sporadiques et éventuellement à des
bouffées épidémiques, lorsque le cas index n’a pas
été suffisamment bien contrôlé (2). Dans toutes
ces configurations épidémiologiques, le repérage
précoce et l’identification des EPC sont cruciaux. En
ce qui concerne les pays confrontés à une situation
endémique, il s’agit de tenter d’enrayer le caractère
exponentiel de la diffusion, et, dans les autres pays,
de prévenir autant que possible toute dissémination
qui pourrait conduire à atteindre là aussi un niveau
endémique. De surcroît, il s’agit au sein des institu-
tions hospitalières de prévenir tout développement
d’épidémies.
Les gènes codant pour les carbapénémases les
plus répandues sont le plus souvent localisés sur
des plasmides pouvant être transférés de souches à
souches, mais aussi en 2 espèces proches (2). C’est
pourquoi il est essentiel d’identifier les souches
hébergeant ce type de mécanismes transférables,
non seulement parce qu’elles s'avèrent plus difficiles
à éradiquer avec les traitements antibiotiques dispo-
nibles lorsqu’elles sont impliquées dans un processus
infectieux, mais aussi en raison du danger potentiel
qu’elles représentent en tant que sources, réser-
voirs, et véhicules de gènes de carbapénémases. Il est
ainsi possible d’observer chez certains patients des
souches appartenant à des espèces d’entérobactéries
différentes et produisant la même carbapénémase,
probablement en raison d’un transfert de plasmides
entre les 2 espèces dans le tube digestif de l’hôte.
Pourquoi détecter
les bactéries productrices
de carbapénémases ?
Dans la mesure où la perspective à court terme de
commercialisation de nouveaux antibiotiques est
particulièrement limitée, il est indispensable d’être
capable d’identifier le plus rapidement possible ces
souches productrices de carbapénémases pour :
➤ adapter au mieux la thérapeutique chez les
patients infectés ;
➤ limiter leur diffusion, tout particulièrement en
milieu hospitalier.
C’est pourquoi une directive de la Direction générale
de la santé en France, émise dès la fin de l’année
2010, recommande l’identification des patients
porteurs. La détection de patients infectés par de
telles souches repose sur un premier dépistage basé
sur l’analyse des profils de résistance aux bêtalacta-
mines, et plus particulièrement aux carbapénèmes
des souches infectantes (3). De nombreuses tech-
niques phénotypiques ont été proposées et utilisées
pour identifier les EPC. Le délai d’obtention des résul-
tats est important (48-72 h), avec une sensibilité et
une spécificité variables ; la lourdeur des tests utilisés

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Résumé
Différentes techniques de dépistage et de détection ont été développées afin de répondre au besoin d’iden-
tification des bactéries productrices de carbapénémases. Plusieurs milieux gélosés sélectifs permettent tout
d’abord d’isoler les germes suspects de produire ce type d’enzyme, dans le cas d’infections mais surtout
dans le cas de colonisations. Une fois la colonie bactérienne suspecte isolée, plusieurs stratégies peuvent
être envisagées, qui vont de l’analyse phénotypique à l’analyse biochimique, en passant par l’analyse
moléculaire. Ces techniques présentent des niveaux de spécificité, de sensibilité, de rapidité, et de coût
extrêmement variables. Leurs avantages et inconvénients, exposés dans cette revue, doivent guider les
microbiologistes dans leur utilisation.
Mots-clés
Carbapénémase
Épidémiologie
OXA-48
Dépistage
Échecs thérapeutiques
Summary
Different screening and detec-
tion techniques have been
developed in order to screen
for carbapenemase-producing
bacteria. Several selective
media are used to isolate
isolates possibly producing
those types of enzymes, and
are used either for screening
of colonisation or for samples
recovered from infections. Once
the suspiscious bacteria recov-
ered, several strategies can be
used, including phenotypical,
biochemical, and molecular
analyses. Those techniques
and their shortcomings are
presented here. They must be
widely explained and recom-
mended in order to provide effi-
cient tools for microbiologists.
Keywords
Carbapenemases
Epidemiology
OXA-48
Screening
Therapeutical failures
jusque-là implique un temps technique important.
Les techniques moléculaires d’identification des
gènes de carbapénémases présentent, quant à
elles, une excellente spécificité et une excellente
sensibilité mais ont un coût très élevé et nécessitent
un personnel additionnel formé aux techniques de
biologie moléculaire ; leurs résultats sont obtenus
là encore relativement tardivement (3).
Quand et comment repérer
le problème ?
La détection des porteurs sains est particulièrement
importante pour prévenir le développement d’épidé-
mies à EPC en milieu hospitalier (4). Elle s’adresse
essentiellement à 2 types de patients : les patients
transférés de tout hôpital étranger et les patients
des unités à risque (réanimation, chirurgie lourde,
immunodéprimés, greffés). Ce dépistage repose
actuellement sur un dépistage réalisé à partir des
selles des patients avec l’utilisation de géloses sélec-
tives permettant d’identifier des souches suspectes,
résistantes aux carbapénèmes (5). Après cette étape
de criblage (24 heures), la confirmation des suspicions
d’EPC peut se faire par l’utilisation des tests phéno-
typiques ou moléculaires développés ci-dessous (3).
Étant donné que le réservoir majeur des entérobac-
téries est constitué par le tube digestif, l’analyse des
selles ou d’écouvillons rectaux correspond aux besoins
diagnostiques. Plusieurs milieux de culture sélectifs
sont commercialisés, mais ils sont dans leur majo-
rité dédiés à l’identification des germes résistants
aux carbapénèmes (combinaison céphalosporinase
hyperproduite + imperméabilité ou carbapénémase)
plutôt qu’aux seuls germes producteurs de carbapéné-
mases (6). Ce sont effectivement souvent les mêmes
espèces bactériennes ; cependant, de nombreux isolats
producteurs de carbapénémases conservent une
sensibilité significative aux carbapénèmes, avec des
concentrations minimales inhibitrices (CMI) faible-
ment impactées et se situant donc juste au-dessus ou
en dessous des concentrations critiques en fonction
des carbapénèmes (l’ertapénem est classiquement la
première touchée). Dans ce contexte, l’utilisation d’un
milieu trop sélectif pourrait conduire à des résultats
faussement négatifs.
Le premier milieu commercialisé a été le CHRO-
Magar™ KPC (CHROMagar, Paris), qui justement ne
détecte que les hauts niveaux de résistance. Certains
producteurs de métallobêtalactamase (MBL), et de
nombreux producteurs d’OXA-48 ne correspondent
cependant pas à ce critère et sont donc mal ou pas
détectés. Le milieu Brilliance™ CRE (Thermo Fisher,
Royaume-Uni) contient également un carbapénème
et détecte la majorité des producteurs de carba-
pénémases (à l’exception de certains producteurs
d’OXA-48). Le milieu de culture sélectif SUPER-
CARBA (non commercialisé à ce jour) contenant
de la cloxacilline, du zinc et de l’ertapénem, a une
sensibilité et une spécificité excellentes, y compris
pour les producteurs d’OXA-48 présentant une faible
CMI aux carbapénèmes (6).
Techniques phénotypiques
habituellement utilisées
Il existe 3 classes distinctes de carbapénémases : A,
B, et D (cf. “Épidémiologie des carbapénémases”),
chacune avec des propriétés biochimiques singu-
lières, et il existe par conséquent plusieurs approches
phénotypiques permettant leur détection, certaines
de ces approches étant spécifiques d’une seule et
même classe. D’autre part, il existe bien entendu
des approches moléculaires qui, elles, ne vont pas
prendre en compte les caractères biochimiques des
enzymes mais bien la génétique du déterminant de
la résistance.
L’une des techniques phénotypiques classiquement
utilisées est le test de Hodge modifié, qui permet la
mise en évidence d’une synergie d’activité enzyma-
tique entre souche productrice de carbapénémases
(souche à tester) et souches sauvages de référence
sensibles (figure 1, p. 130). Cependant, ce test
manque de spécificité (nombreux faux positifs) mais
également de sensibilité (faux négatifs fréquents
avec certains types d’enzyme, et en particulier les
carbapénémases de type NDM).
Étant donné que l’activité des bêtalactamases de
classe A est partiellement inactivée par des inhi-
biteurs tels que l’acide clavulanique ou encore le
tazobactam, des tests de synergie in vitro et en
milieu solide sont possibles en rapprochant un disque

Figure 1. Principe du test de Hodge modifié. 1. Souche
d’Escherichia coli sensible à l’ertapénem. 2. Souche
d’E. coli OXA-48. 3. Souche d’E. coli productrice de BLSE
(bêtalactamase à spectre élargi). 4. Souche d’Entero-
bacter cloacae hyperproductrice de céphalosporinase.
1
2
3
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Diagnostic descarbapénémases : détection et caractérisation
DOSSIER THÉMATIQUE
Carbapénémases
contenant le substrat (un carbapénème) d’un autre
disque contenant l’inhibiteur (par exemple l’asso-
ciation amoxicilline-acide clavulanique). Cependant,
ces tests montrent une efficacité très modérée avec
les enzymes de type KPC (Klebsiella Pneumoniae
Carbapenemase), connues pour n’être que faiblement
inhibées par les inhibiteurs de bêtalactamases (3).
En ce qui concerne les souches productrices de MBL
comme les enzymes des familles VIM et IMP, on
peut mettre en évidence la production en utilisant
la propriété d’inhibition par l’EDTA (acide éthylène
diamine tétraacétique) [3]. En effet, celui-ci chélate
les ions zinc indispensables à l’activité hydrolytique
des enzymes de la famille des métalloenzymes dont
font partie les MBL. Les E-test MBL, qui associent
d’un côté de la bandelette l’imipénem seul et de
l’autre côté l’imipénem-EDTA, sont largement utilisés
aujourd’hui. Le différentiel pouvant être observé en
termes de CMI permet la mise en évidence éventuelle
de la production de MBL. Cependant, cette technique
pose des problèmes de sensibilité lorsque la CMI à
l’imipénem est trop basse, ainsi que des problèmes
de spécificité avec certaines souches, en particulier
Acinetobacter baumannii (7).
Il est également possible de détecter la production
de carbapénémases de tout type par l’utilisation
de la spectrophotométrie UV, une technique rela-
tivement répandue au sein des laboratoires de
microbiologie (8). Une préculture de la bactérie à
tester doit être réalisée, puis un extrait enzymatique
est récupéré après sonication du culot bactérien ;
enfin, l’extrait enzymatique est testé en présence
du substrat de carbapénème. En cas d’hydrolyse,
la diminution d’absorbance observée traduira une
hydrolyse du substrat et donc la présence d’une
carbapénémase. Cette technique est très sensible et
très spécifique, mais nécessite un personnel entraîné
et qualifié (8).
Techniques biochimiques
récentes recommandées
Deux techniques, répondant de manière parfaite
aux besoins actuels présentés, ont été mises au
point récemment (9, 10). La première correspond
à la recherche d’une modification du spectre d’un
carbapénème sous l’effet d’une carbapénémase. Il
s’agit d’une application de la technique de spec-
trométrie de masse (MALDI-TOF) [9]. Cette tech-
nique nécessite une mise au point fine, du personnel
particulièrement entraîné et un spectromètre de
masse, appareil très onéreux, dans le laboratoire. La
seconde technique de diagnostic rapide est le Carba
NP® test (10). Le principe de ce test repose sur la
mise en évidence d’une acidification du milieu en cas
d’hydrolyse de l’imipénem par une carbapénémase.
L’indicateur de pH change de couleur (du rouge au
jaune) lorsque le milieu devient acide, traduisant
la présence d’une carbapénémase (figure 2). Cette
technique est particulièrement rapide (de 30 à
120 mn), ne nécessite qu’un matériel peu coûteux
et ne requiert pas de personnel spécialisé. Elle est
sensible et spécifique (100 %). Tout comme la tech-
nique de spectrométrie de masse, l’un de ses avan-
tages est de mettre en évidence la production de
n’importe quel type de carbapénémase (classes A,
B, ou D), et de pouvoir même détecter la produc-
tion d’une potentielle carbapénémase jusque-là
inconnue (figure 2). Le Carba NP® test peut être
réalisé à partir de souches isolées mais également
directement à partir de prélèvements cliniques tels
que les hémocultures. Plus d’une cinquantaine de
laboratoires dans le monde utilisent désormais de
manière régulière le Carba NP® test. Il devrait être
commercialisé dans le courant de l’année 2014.
Techniques moléculaires
En parallèle des techniques actuellement utilisées
pour la détection phénotypique et biochimique de
la production de carbapénémases, il existe bien
entendu la possibilité d’utiliser les techniques de

Figure 2. Stratégie d’identification des entérobactéries productrices de carbapénémases.
Diminution de la sensibilité aux carbapénèmes
Carba NP® test
< 2 h
Absence
de carbapénémase
Production
d’une carbapénémase
Mesures d’hygiène
renforcées
Déclaration aux ARS
Biologie moléculaire (PCR simplex/multiplex, micropuce à ADN, etc.) :
recherche des gènes de carbapénémases fréquentes :
blaKPC, blaVIM, blaNDM, blaOXA-48-like
Biologie moléculaire : recherche des gènes
de carbapénémases rares :
blaIMI blaSME, blaSFC-1, blaGIM , blaAIM, blaKHM
3-5 h
99,9 %
99,9 %
0,01 %
0,01 %
24-48 h
24-48 h Clonage
(Nouvelle carbapénémase)
Séquençage
ARS : agences régionales de santé ;
PCR : réaction en chaîne par polymérase
(Polymerase Chain Reaction).
–
–
–
+
+
+
La Lettre de l’Infectiologue • Tome XXVIII - no 4 - juillet-août 2013 | 131
DOSSIER THÉMATIQUE
biologie moléculaire, qui ciblent les gènes codant
pour les carbapénémases. Ces techniques reposent
sur l’utilisation de la réaction en chaîne par polymé-
rase (PCR), complétée ou non par le séquençage de
l’ADN amplifié (utile uniquement à des fins épidé-
miologiques) [figure 2]. Il est possible de rechercher
chaque gène de carbapénémase de manière spéci-
fique (utile dans un contexte d’épidémie, ou bien
lorsqu’on sait qu’un seul type de carbapénémase est
présent dans la zone géographique), ou bien d’uti-
liser un système multiplex incluant plusieurs paires
d’amorces et permettant dans ce cas de rechercher
en une seule réaction plusieurs de ces gènes cibles.
À partir d’une colonie suspecte, on peut en 4 à
6 heures obtenir un résultat qui est très spécifique et
très sensible, mais ces techniques restent onéreuses.

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Diagnostic descarbapénémases : détection et caractérisation
DOSSIER THÉMATIQUE
Carbapénémases
De plus, elles ne permettent pas la mise en évidence
d’un nouveau mécanisme qui serait lié à l’acquisition
d’un gène inconnu. Les laboratoires de référence
ayant à réaliser de nombreux tests de dépistage ou
de confirmation sont les plus à même d’utiliser ces
techniques rapides et spécifiques. Depuis peu sont
également disponibles sur le marché des kits de
détection des gènes de carbapénémases basés sur
l’utilisation de puces à ADN (11). Ces derniers sont
encore plus onéreux, nécessitent un appareil dédié,
et demandent une certaine expertise. Là encore, ils
sont plutôt appropriés aux laboratoires de référence.
Conclusion
Au vu de l’émergence et de la dissémination actuelle
des souches d’EPC, le criblage, l’identification ainsi
que le diagnostic rapide de ces bactéries multiré-
sistantes et des mécanismes correspondants sont
cruciaux et constituent un enjeu de santé publique.
Seul un diagnostic rapide, spécifique, sensible et, si
possible, peu onéreux peut permettre de retarder
leur diffusion et d’éviter en particulier le développe-
ment d’épidémies hospitalières rapidement incontrô-
lables. Fort heureusement, des outils diagnostiques
existent, et leur développement est en pleine expan-
sion. À chaque laboratoire de décider, selon ses capa-
cités financières, ses infrastructures matérielles,
l’expertise de ses personnels, mais également selon
les données épidémiologiques et la fréquence de
suspicion de tels isolats, quelles sont les techniques
les plus appropriées. Reste que la disponibilité aisée
de ces différentes techniques doit rendre obligatoire
leur utilisation, sachant qu’il est encore temps d’agir
mais qu’il y a urgence à bloquer le processus de
dissémination extensif. ■
Liens d’intérêts. Les auteurs déclarent être les co-inventeurs du
Carba NP® test. Un brevet international correspondant au Carba
NP
®
test a été pris au nom de Inserm Transfert, organisme tutellaire
de l’unité Inserm 914.
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