Intérêt des marqueurs génétiques pour le diagnostic du cancer pancréatique D

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La lettre de l’hépato-gastroentérologue - no2 - vol. IV - avril 2001
DOSSIER THÉMATIQUE
POSITION DU PROBLÈME
Le cancer pancréatique représente la cinquième cause de décès
par cancer dans les pays occidentaux. Il s’agit dans plus de 90 %
des cas d’un adénocarcinome. Son mauvais pronostic (survie à
5 ans inférieure à 3,5 %) est dû en partie à l’absence de facteurs
de risque très spécifiques interdisant une prévention efficace, un
diagnostic tardif en raison de signes cliniques de début absents
ou non spécifiques, une invasion tumorale rapide par voie lym-
phatique et nerveuse, l’absence de marqueurs biologiques pré-
coces disponibles en pratique clinique quotidienne. Le seul trai-
tement curatif du cancer pancréatique est la chirurgie. Celle-ci
ne peut être instituée à visée curative que dans 10 à 15 % des cas.
Parmi ces patients, seulement 5 % sont en vie à 5 ans. À l’heure
actuelle, les voies de recherche pour améliorer le pronostic du
cancer pancréatique sont :
– le développement d’un traitement adjuvant efficace, applicable
après chirurgie curatrice ou palliative, dans le but de réduire le
risque de récidive et/ou de progression de la maladie ;
– l’isolement d’un marqueur fiable permettant un diagnostic plus
précoce ;
– une meilleure connaissance de la carcinogenèse qui devrait
aider à améliorer “diagnostic et traitement” d’une affection encore
déconcertante pour le clinicien et le chercheur.
LES MARQUEURS CLASSIQUES
La sensibilité du Ca 19-9 varie entre 73 et 90 % et sa spécificité
entre 53 et 100 %. Ces grandes variations de performance, notam-
ment de la spécificité, sont attribuées au fait que le Ca 19-9 sérique
peut s’élever au cours d’autres pathologies cancéreuses mais aussi
au cours de pathologies bénignes du pancréas et leurs complica-
tions (cholestase, diabète). De plus, pour les tumeurs pancréa-
tiques de taille inférieure ou égale à 2 cm (c’est-à-dire à un stade
curable), la sensibilité du Ca 19-9 sérique chute au-dessous de 50 %
ce qui exclut ce dosage comme marqueur précoce potentiel.
La cytologie n’est pas un marqueur en tant que tel mais peut aider
au diagnostic dans la mesure où du matériel cellulaire peut être
obtenu par prélèvement de suc pancréatique ou de bile, par bros-
sage d’une sténose biliaire ou pancréatique, par cytoponction gui-
dée sous écho-endoscopie. La sensibilité de la cytologie varie en
fait de 27 à 85 % avec une spécificité allant de 83 à 100 %. Les
performances de ce moyen diagnostique varient considérable-
ment en fonction de la richesse cellulaire du prélèvement et de
l’anatomopathologiste. Le développement de la cytoponction
sous écho-endoscopie avec obtention de “mini-carottes” biop-
siques est en train d’améliorer le diagnostic histologique des
masses pancréatiques. Toutefois, les lésions concernées ne répon-
dent pas toujours aux critères de “lésions précoces”, c’est-à-dire
résécables. L’amplification génique a autorisé une analyse molé-
culaire fiable à partir des divers milieux biologiques accessibles
en pratique clinique courante. La puissance de cette amplifica-
tion permet donc une analyse génomique à partir d’un échantillon
faible en cellularité. Des études ont porté sur des oncogènes et
gènes suppresseurs de tumeur fréquemment mutés au cours du
Intérêt des marqueurs génétiques
pour le diagnostic du cancer pancréatique
● L. Buscail*, J. Escourrou*
* Service de gastro-entérologie et nutrition et INSERM U 531,
CHU Rangueil, Toulouse.
POINTS FORTS
POINTS FORTS
■Aucun des marqueurs biologiques ou moléculaires iden-
tifiés n’est suffisamment spécifique pour permettre un dia-
gnostic précoce du cancer du pancréas.
■La sensibilité et la spécificité du Ca 19-9 ne sont pas suf-
fisamment déterminantes. Ainsi lorsque la tumeur fait moins
de 2 cm (c’est-à-dire à un stade curable), la sensibilité du
marqueur est inférieure à 50 %.
■La mutation du gène Ki-ras sur le codon 12, 13 ou 61
transforme ce gène en oncogène. Il apparaît précocement au
cours de la carcinogenèse. Il s’agit à l’heure actuelle de la
mutation la plus fréquente et la plus spécifique du cancer du
pancréas. On peut l’isoler à partir du suc pancréatique ou de
frottis canalaires au cours d’une CPRE ou à partir de micro-
biopsies au cours d’une écho-endoscopie.
■La recherche de gènes suppresseurs de tumeur mutés
comme la protéine p53 ou les gènes suppresseurs MTS1 ou
DPC4 mutés semble limitée pour le diagnostic spécifique de
cancer du pancréas.

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La lettre de l’hépato-gastroentérologue - no2 - vol. IV - avril 2001
cancer pancréatique. Le principal oncogène (Ki-ras) et les prin-
cipaux antioncogènes altérés au cours du cancer pancréatique
sont répertoriés dans le tableau I.
L’ONCOGÈNE KI-RAS
Le gène Ki-ras appartient à une famille de trois gènes homologues
(Harvey, Kirsten, et N) ras ; Il s’agit d’un proto-oncogène qui code
pour une protéine de 21 kDa, la protéine p21-ras. Cette protéine lie
les nucléotides à guanine (GDP et GTP) et représente le prototype
d’une grande famille regroupée sous le nom de “petites protéines
G”. Ces protéines sont actives lorsqu’elles lient le GTP. Elles pos-
sèdent une activité GTPasique intrinsèque qui provoque en retour
un état inactif liant le GDP. La protéine p21-ras se positionne comme
un “interrupteur moléculaire” essentiel à la transduction du signal
mitogène induit par de nombreux facteurs de croissance.
Une seule mutation de Ki-ras, sur le codon 12, 13 ou 61, trans-
forme ce gène en oncogène. Cette mutation supprime l’activité
GTPase de la protéine qui reste liée au GTP et figée dans son état
activé. Les études sur pièces opératoires ont montré que cet onco-
gène était muté dans 85 à 100 % des cancers pancréatiques. Il
s’agit d’une mutation ponctuelle (hétérozygote) portant presque
exclusivement sur le codon 12 avec remplacement de la séquence
GGT (codant pour la glycine) par une autre séquence (le plus fré-
quemment GAT-acide aspartique) (tableau I). Cette mutation se
recherche après amplification génique par PCR (réaction de poly-
mérisation en chaîne) du fragment d’ADN susceptible de com-
porter la mutation. La recherche de mutation peut se faire selon
plusieurs méthodes répertoriées dans le tableau II. La méthode
de référence, et devant être utilisée pour confirmation, est le
séquençage direct.
L’analyse de la mutation du gène Ki-ras a été étudiée dans dif-
férents sites au cours d’études cliniques comparant le plus sou-
vent deux groupes de patients atteints respectivement de cancer
et de pancréatite chronique. Les principaux résultats de ces études
sont colligés dans le tableau III, la spécificité ayant été calculée
à partir des résultats obtenus chez les patients porteurs de pan-
créatite chronique (1-12). La sensibilité diagnostique de la
recherche de mutation de l’oncogène dans les selles, la bile ou le
liquide duodénal (8, 11, 12) est globalement inférieure à celle
observée dans les voies pancréatiques (1-7). D’autres études sont
nécessaires en ce qui concerne notamment la cytoponction, volon-
tiers guidée sous écho-endoscopie. L’analyse du Ki-ras pourrait
dans ce cadre améliorer la sensibilité de la cytoponction (10).
Les problèmes mis à jour par certains travaux sont le fait que chez
des patients porteurs de pancréatite chronique une mutation du
Ki-ras pouvait être détectée. La présence de mutations de l’onco-
gène dans des lésions dites “prénéoplasiques” (hyperplasie papil-
laire, adénomateuse ou muqueuse) et que l’on peut rencontrer au
cours de la pancréatite chronique pourrait expliquer ces résultats.
Toutefois, la fréquence moyenne de ces mutations au cours de la
pancréatite chronique ne semble pas dépasser 15 % (13-16). Elle
est tout de même à prendre en compte si l’on doit s’appuyer sur
l’oncogène Ki-ras en cas de diagnostic différentiel entre pan-
créatite chronique pseudo-tumorale et cancer.
Gène Locus Perte Altérations
d’hétérozygotie géniques
Ki-ras 12p12 - Mutation codon 12
(80 à 100 %)
p53 17p13 100 % Mutations (70 %)
p16/MTSI 9p21 85 % Mutations,
délétions,
hyperméthylation (78 %)
DPC4 18q21.1 91 % Mutations (50 %)
Tableau I. Oncogène et gènes suppresseurs de tumeur altérés au cours
du cancer pancréatique.
Méthode Patients Sensibilité (%)/
(Cancer/PC**) Spécificité (%)
Tubage duodénal 60 (19/29) 63 /98
Cytoponction 93 (41/52) 59 /100
Bile 20 (20/-) 55/-
Voies 486 (199/287) 73 /90
pancréatiques*
* Cumul de 6 séries y compris celle de notre centre ; analyse après prélèvement de
suc pancréatique pur et/ou brossage sous CPRE.
** PC = pancréatite chronique.
Tableau III. Recherche de la mutation de l’oncogène Ki-ras dans
différents sites anatomiques.
Nom de la méthode Principe général
Séquençage direct Séquençage automatique de
nucléotides après amplification
de la zone contenant le codon 12
RFLP Amplification par PCR de la région
contenant le codon 12 dont
la mutation crée un nouveau site
de restriction. Après digestion
enzymatique, le profil de migration
du brin muté sur gel sera différent
du brin sans mutation.
SSCP Une variation de séquence
nucléotidique du brin d’ADN muté
est responsable d’une migration
différente sur gel par rapport
au brin sauvage.
Hybridation Hybridation du produit
d’amplification avec des sondes
spécifiques ou non de la mutation
recherchée.
(RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphism - SSCP : Single-Strand
Conformation Polymorphism.)
Tableau II. Principales méthodes de recherche de la mutation de
l’oncogène Ki-ras.

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DOSSIER THÉMATIQUE
La mutation de l’oncogène Ki-ras semble apparaître très préco-
cement au cours de la cancérogénèse pancréatique. La présence
de mutations du Ki-ras sur des lésions dysplasiques précancé-
reuses, et ce au cours de modèles expérimentaux ou sur pièces
opératoires, laisse présager d’un phénomène précoce au cours
de la cancérogénèse pancréatique. De même des tumeurs à poten-
tiel dégénératif, comme les tumeurs intraductales mucineuses
papillaires présentent une mutation de l’oncogène Ki-ras dans
92 % des cas (17). Enfin des observations privilégiées, certes en
petit nombre, font état de la présence de la mutation dans le suc
pancréatique jusqu’au quarantième mois avant le développement
d’un cancer invasif (7, 18). La recherche de cette mutation peut
donc constituer un marqueur précoce de l’affection. Une étude
multicentrique française est actuellement en cours pour évaluer
si la recherche de cette mutation dans le suc pur peut amener à
un diagnostic plus précoce du cancer pancréatique chez des
patients avec une symptomatologie certes peu parlante mais pou-
vant autoriser ce diagnostic précoce. Un suivi à long terme doit
permettre de répondre aux attentes que suscite cette technique.
LES GÈNES SUPPRESSEURS DE TUMEUR
Leur altération aboutit à une perte de fonction souvent inhibi-
trice et principalement perte d’un effet inhibiteur sur la prolifé-
ration cellulaire. Leur inactivation est le fait d’altérations homo-
zygotes avec mutation ou délétion associée à une perte
d’hétérozygotie de l’allèle controlatéral (tableau I).
p53
La protéine p53 est une phosphoprotéine nucléaire possédant des
propriétés inhibitrices sur le cycle cellulaire (induction de la CDKI
p21) mais aussi des effets pro-apoptotiques et de réparation de
l’ADN. Elle est capable de se fixer spécifiquement sur l’ADN
pour activer des facteurs de transcription. La survenue de muta-
tions intragéniques (plusieurs centaines décrites à ce jour) empê-
chent cette fixation à l’ADN et donc une perte de fonction de la
p53. Ces mutations sont présentes dans près de 76 % des cancers
pancréatiques avec, en parallèle, une perte d’hétérozygotie propre
aux gènes suppresseurs de tumeur, au niveau du bras court du
chromosome 17 (près de 100 % des cancers pancréatiques)
(tableau I). Un taux élevé d’anticorps anti-p53 dans le sérum de
patients atteints de cancer pancréatique (alors que ces anticorps
sont peu ou pas présents dans la population générale) a été observé
dans près de 30 % des cas (19). Cette mesure ne peut constituer
à l’heure actuelle un marqueur utilisable en pratique clinique.
MTS1 et DPC4
Le gène MTS1 (codant pour la protéine p16, CDKI impliquée
dans la régulation négative du cycle cellulaire) est inactivé dans
près de 80 % des cancers pancréatiques (tableau I) (20, 21). Il
est difficile de savoir si l’altération de MTS1 apparaît précoce-
ment au cours de la cancérogénèse pancréatique et des études
complémentaires sont nécessaires sur ce plan. La recherche de
la mutation de MTS1 à partir du suc prélevé par CPRE est pos-
sible de même que celles de l’anti-oncogène DPC4. Ce gène a
été récemment identifié comme gène suppresseur de tumeur pour
le cancer pancréatique. Il code pour la protéine Smad4 impli-
quée dans le signal de transduction du TGFβet son effet inhibi-
teur sur la prolifération cellulaire. DPC4 est inactivé dans 50 %
des cancers pancréatiques (22). De plus, une mutation de DPC4
est systématiquement associée à une mutation de MTS1. Le
caractère précoce de la mutation de DPC4 n’est pas encore
reconnu. Nos premiers résultats établis à partir de suc pancréa-
tique pur font état d’un taux de mutations homozygotes de l’ordre
de 50 % des deux gènes suppresseurs MTS1 et DPC4 au cours
des pancréatites chroniques, ce qui semble limiter cette recherche
pour un diagnostic spécifique du cancer du pancréas (23, 24).
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
La mutation de l’oncogène Ki-ras est donc à l’heure actuelle
l’altération génique la plus fréquente et la plus spécifique du can-
cer pancréatique. Sa recherche nécessite une méthodologie stricte
devant obéir aux règles de l’amplification génique et devrait enfin
comporter une confirmation par séquençage direct. La recherche
simultanée d’autres altérations géniques ne semble pas apporter
à l’heure actuelle un intérêt clinique par rapport à l’analyse du
Ki-ras seule. Cette dernière s’appliquerait principalement à des
situations cliniques pouvant correspondre à une phase dite “de
début” du cancer pancréatique : il peut donc s’agir de patients
se présentant avec une pancréatite aiguë “a priori” idiopathique
ou des symptômes peu spécifiques mais accompagnés d’ano-
malies parenchymateuses ou canalaires échographiques (notam-
ment écho-endoscopiques) et/ou radiologiques pancréatiques.
Le résultat des études cliniques en cours nous permettra vrai-
semblablement d’établir si l’analyse du Ki-ras va aider à la déci-
sion clinique : quand opérer et qui ? quand surveiller et qui ?
La connaissance toute récente du génome humain assortie de la
puissance actuelle des analyses génomiques permettra vraisem-
blablement de progresser en parallèle dans la connaissance de la
cancérogénèse pancréatique, voire dans la détermination de nou-
veaux marqueurs. ■
Mots clés. Diagnostic précoce – Oncogènes – Gènes
suppresseurs de tumeur.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Miki H, Matsumoto S, Harada H et al. Detection of c-Ki-ras point mutation
from pancreatic juice. A useful diagnostic approach for pancreatic carci-
noma. Int J Pancreatol 1993 ; 14 : 145-8.
2. Van Laethem JL, Vertongen P, Deviere J et al. Detection of c-Ki-ras gene
codon 12 mutations from pancreatic duct brushings in the diagnosis of pan-
creatic tumours. Gut 1995 ; 36 : 781-7.
3. Watanabe H, Yamaguchi Y, Ha A et al. Quantitative determination of K-ras
mutations in pancreatic juice for diagnosis of pancreatic cancer using hybri-
dization protection assay. Pancreas 1998 ; 17 : 341-7.
4. Kondo H, Sugano K, Fukayama N et al. Detection of K-ras gene mutations
at codon 12 in the pancreatic juice of patients with intraductal papillary muci-
nous tumors of the pancreas. Cancer 1997 ; 79 : 900-5.
5. Van Laethem JL, Bourgeois V, Parma J et al. Relative contribution of Ki-
ras gene analysis and brush cytology during ERCP for the diagnosis of biliary
and pancreatic diseases. Gastrointest Endosc 1998 ; 47 : 479-85.

6. Buscail L, Pagès P, Bouisson M et al. Les marqueurs précoces en cancéro-
logie pancréatique. Hepato-Gastro 1999 ; 6 : 85-91.
7. Berthelemy P, Bouisson M, Escourrou J et al. Identification of K-ras muta-
tion in pancreatic juice in the early diagnosis of pancreatic cancer. Ann Int
Med 1995 ; 123 : 188-91.
8. Iguchi H, Sugano K, Fukayama N et al. Analysis of Ki-ras codon 12 muta-
tions in the duodenal juice of patients with pancreatic cancer. Gastroentero-
logy 1996 ; 110 : 221-6.
9. Villanueva A, Reyes G, Cuatrecasas M et al. Diagnostic utility of K-ras
mutations in fine-needle aspirates of pancreatic masses. Gastroenterology
1996 ; 110 : 1587-94.
10. Urgell E, Puig P, Boadas J et al. Prospective evaluation of the contribu-
tion of K-ras mutational analysis and Ca 19-9 measurement to cytological dia-
gnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer. Eur J Cancer
2000 ; 36 : 2069-75.
11. Caldas C, Hahn SA, Hruban RH et al. Detection of K-ras mutations in the
stool of patients with pancreatic adenocarcinoma and pancreatic ductal hyper-
plasia. Cancer Res 1994 ; 54 : 3568-73.
12. Abbruzzese JL, Evans DB, Raijman I et al. Detection of mutated c-Ki-ras in
the bile of patients with pancreatic cancer. Anticancer Res 1997 ; 17 : 795-801.
13. Tada M, Ohashi M, Shiratori Y et al. Analysis of K-ras mutation in hyper-
plastic duct cells of the pancreas without pancreatic disease. Gastroenterology
1996 ; 110 : 227-31.
14. Rivera JA, Rall CJ, Graeme-Cook F et al. Analysis of K-ras oncogene muta-
tions in chronic pancreatitis with ductal hyperplasia. Surgery 1997 ; 121 : 42-9.
15. Luttges J, Diederichs A, Menke MA et al. Ductal lesions in patients with
chronic pancreatitis show K-ras mutations in a frequency similar to that of nor-
mal pancreas and lack nuclear immunorectivity for p53. Cancer 2000 ; 88 :
2495-504.
16. Orth M, Gansauge F, Gansauge S et al. K-ras mutations at codon 12 are
rare events in chronic pancreatitis. Digestion 1998 ; 59 :120-4.
17. Moskaluk CA, Hruban RH, Kern SE. p16 and K-ras gene mutations in the
intraductal precursors of human pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res
1997 ; 57 : 2140-3.
18. Wakabayashi T, Sawabu N, Watanabe H et al. Detection of K-ras point
mutation at codon 12 in pure pancreatic juice collected 3 years and 6 months
before the clinical diagnosis of pancreatic cancer. Am J Gastroenterol 1996 ;
91 : 1848-51.
19. Laurent-Puig P, Lubin R, Semhoun-Ducloux S et al. Antibodies against
p53 protein in serum of patients with benign or malignant pancreatic and
biliary diseases. Gut 1995 ; 36 : 455-8.
20. Caldas C, Hahn SA, da Costa LT et al. Frequent somatic mutations and
homozygous deletions of the p16 (MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma.
Nat Genet 1994 ; 8 : 27-32.
21. Huang L, Goodrow TL, Zhang SY et al. Deletion and mutation analyses of
the p16/MTS-1 tumor suppressor gene in human ductal pancreatic cancer
reveals a higher frequency of abnormalities in tumor-derived cell lines than in
primary ductal adenocarcinomas. Cancer Res 1996 ; 56 : 1137-41.
22. Hahn SA, Schutte M, Hoque AT et al. DPC4, a candidate tumor suppres-
sor gene at human chromosome 18q21.1. Science 1996 ; 27 : 350-3.
23. Bouisson M, Pagès P, Buscail L et al. Deletions of p16/MTS-1 gene is fre-
quent event in pancreatic juice from patients with pancreatic cancer and chro-
nic pancreatitis. Gastroenterology 1998 ; 114, A567.
24. Costentin L, Bouisson M, Buscail L et al. La recherche d’une délétion du
gène DPC4 apporte-t-elle un bénéfice par rapport au Ki-ras dans le diagnostic
de cancer du pancréas ? Gastroenterol Clin Biol 1999 ; 23 : 1079.
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