D O S S I E R T H É M A T I Q U E Intérêt des marqueurs génétiques pour le diagnostic du cancer pancréatique ● L. Buscail*, J. Escourrou* P O I N T S F O R T S P O I N T S F O R T S ■ Aucun des marqueurs biologiques ou moléculaires identifiés n’est suffisamment spécifique pour permettre un diagnostic précoce du cancer du pancréas. ■ La sensibilité et la spécificité du Ca 19-9 ne sont pas suffisamment déterminantes. Ainsi lorsque la tumeur fait moins de 2 cm (c’est-à-dire à un stade curable), la sensibilité du marqueur est inférieure à 50 %. ■ La mutation du gène Ki-ras sur le codon 12, 13 ou 61 transforme ce gène en oncogène. Il apparaît précocement au cours de la carcinogenèse. Il s’agit à l’heure actuelle de la mutation la plus fréquente et la plus spécifique du cancer du pancréas. On peut l’isoler à partir du suc pancréatique ou de frottis canalaires au cours d’une CPRE ou à partir de microbiopsies au cours d’une écho-endoscopie. ■ La recherche de gènes suppresseurs de tumeur mutés comme la protéine p53 ou les gènes suppresseurs MTS1 ou DPC4 mutés semble limitée pour le diagnostic spécifique de cancer du pancréas. POSITION DU PROBLÈME Le cancer pancréatique représente la cinquième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. Il s’agit dans plus de 90 % des cas d’un adénocarcinome. Son mauvais pronostic (survie à 5 ans inférieure à 3,5 %) est dû en partie à l’absence de facteurs de risque très spécifiques interdisant une prévention efficace, un diagnostic tardif en raison de signes cliniques de début absents ou non spécifiques, une invasion tumorale rapide par voie lymphatique et nerveuse, l’absence de marqueurs biologiques précoces disponibles en pratique clinique quotidienne. Le seul traitement curatif du cancer pancréatique est la chirurgie. Celle-ci * Service de gastro-entérologie et nutrition et INSERM U 531, CHU Rangueil, Toulouse. 62 ne peut être instituée à visée curative que dans 10 à 15 % des cas. Parmi ces patients, seulement 5 % sont en vie à 5 ans. À l’heure actuelle, les voies de recherche pour améliorer le pronostic du cancer pancréatique sont : – le développement d’un traitement adjuvant efficace, applicable après chirurgie curatrice ou palliative, dans le but de réduire le risque de récidive et/ou de progression de la maladie ; – l’isolement d’un marqueur fiable permettant un diagnostic plus précoce ; – une meilleure connaissance de la carcinogenèse qui devrait aider à améliorer “diagnostic et traitement” d’une affection encore déconcertante pour le clinicien et le chercheur. LES MARQUEURS CLASSIQUES La sensibilité du Ca 19-9 varie entre 73 et 90 % et sa spécificité entre 53 et 100 %. Ces grandes variations de performance, notamment de la spécificité, sont attribuées au fait que le Ca 19-9 sérique peut s’élever au cours d’autres pathologies cancéreuses mais aussi au cours de pathologies bénignes du pancréas et leurs complications (cholestase, diabète). De plus, pour les tumeurs pancréatiques de taille inférieure ou égale à 2 cm (c’est-à-dire à un stade curable), la sensibilité du Ca 19-9 sérique chute au-dessous de 50 % ce qui exclut ce dosage comme marqueur précoce potentiel. La cytologie n’est pas un marqueur en tant que tel mais peut aider au diagnostic dans la mesure où du matériel cellulaire peut être obtenu par prélèvement de suc pancréatique ou de bile, par brossage d’une sténose biliaire ou pancréatique, par cytoponction guidée sous écho-endoscopie. La sensibilité de la cytologie varie en fait de 27 à 85 % avec une spécificité allant de 83 à 100 %. Les performances de ce moyen diagnostique varient considérablement en fonction de la richesse cellulaire du prélèvement et de l’anatomopathologiste. Le développement de la cytoponction sous écho-endoscopie avec obtention de “mini-carottes” biopsiques est en train d’améliorer le diagnostic histologique des masses pancréatiques. Toutefois, les lésions concernées ne répondent pas toujours aux critères de “lésions précoces”, c’est-à-dire résécables. L’amplification génique a autorisé une analyse moléculaire fiable à partir des divers milieux biologiques accessibles en pratique clinique courante. La puissance de cette amplification permet donc une analyse génomique à partir d’un échantillon faible en cellularité. Des études ont porté sur des oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur fréquemment mutés au cours du La lettre de l’hépato-gastroentérologue - no 2 - vol. IV - avril 2001 cancer pancréatique. Le principal oncogène (Ki-ras) et les principaux antioncogènes altérés au cours du cancer pancréatique sont répertoriés dans le tableau I. L’ONCOGÈNE KI-RAS Le gène Ki-ras appartient à une famille de trois gènes homologues (Harvey, Kirsten, et N) ras ; Il s’agit d’un proto-oncogène qui code pour une protéine de 21 kDa, la protéine p21-ras. Cette protéine lie les nucléotides à guanine (GDP et GTP) et représente le prototype d’une grande famille regroupée sous le nom de “petites protéines G”. Ces protéines sont actives lorsqu’elles lient le GTP. Elles possèdent une activité GTPasique intrinsèque qui provoque en retour un état inactif liant le GDP. La protéine p21-ras se positionne comme un “interrupteur moléculaire” essentiel à la transduction du signal mitogène induit par de nombreux facteurs de croissance. Une seule mutation de Ki-ras, sur le codon 12, 13 ou 61, transforme ce gène en oncogène. Cette mutation supprime l’activité GTPase de la protéine qui reste liée au GTP et figée dans son état activé. Les études sur pièces opératoires ont montré que cet oncogène était muté dans 85 à 100 % des cancers pancréatiques. Il s’agit d’une mutation ponctuelle (hétérozygote) portant presque exclusivement sur le codon 12 avec remplacement de la séquence GGT (codant pour la glycine) par une autre séquence (le plus fréquemment GAT-acide aspartique) (tableau I). Cette mutation se recherche après amplification génique par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) du fragment d’ADN susceptible de comporter la mutation. La recherche de mutation peut se faire selon plusieurs méthodes répertoriées dans le tableau II. La méthode de référence, et devant être utilisée pour confirmation, est le séquençage direct. L’analyse de la mutation du gène Ki-ras a été étudiée dans différents sites au cours d’études cliniques comparant le plus souvent deux groupes de patients atteints respectivement de cancer et de pancréatite chronique. Les principaux résultats de ces études sont colligés dans le tableau III, la spécificité ayant été calculée à partir des résultats obtenus chez les patients porteurs de pancréatite chronique (1-12). La sensibilité diagnostique de la recherche de mutation de l’oncogène dans les selles, la bile ou le liquide duodénal (8, 11, 12) est globalement inférieure à celle observée dans les voies pancréatiques (1-7). D’autres études sont nécessaires en ce qui concerne notamment la cytoponction, volontiers guidée sous écho-endoscopie. L’analyse du Ki-ras pourrait dans ce cadre améliorer la sensibilité de la cytoponction (10). Les problèmes mis à jour par certains travaux sont le fait que chez des patients porteurs de pancréatite chronique une mutation du Ki-ras pouvait être détectée. La présence de mutations de l’oncogène dans des lésions dites “prénéoplasiques” (hyperplasie papillaire, adénomateuse ou muqueuse) et que l’on peut rencontrer au cours de la pancréatite chronique pourrait expliquer ces résultats. Toutefois, la fréquence moyenne de ces mutations au cours de la pancréatite chronique ne semble pas dépasser 15 % (13-16). Elle est tout de même à prendre en compte si l’on doit s’appuyer sur l’oncogène Ki-ras en cas de diagnostic différentiel entre pancréatite chronique pseudo-tumorale et cancer. La lettre de l’hépato-gastroentérologue - no 2 - vol. IV - avril 2001 Tableau I. Oncogène et gènes suppresseurs de tumeur altérés au cours du cancer pancréatique. Gène Locus Perte d’hétérozygotie Altérations géniques Ki-ras 12p12 - Mutation codon 12 (80 à 100 %) p53 17p13 100 % Mutations (70 %) p16/MTSI 9p21 85 % Mutations, délétions, hyperméthylation (78 %) DPC4 18q21.1 91 % Mutations (50 %) Tableau II. Principales méthodes de recherche de la mutation de l’oncogène Ki-ras. Nom de la méthode Principe général Séquençage direct Séquençage automatique de nucléotides après amplification de la zone contenant le codon 12 RFLP Amplification par PCR de la région contenant le codon 12 dont la mutation crée un nouveau site de restriction. Après digestion enzymatique, le profil de migration du brin muté sur gel sera différent du brin sans mutation. SSCP Une variation de séquence nucléotidique du brin d’ADN muté est responsable d’une migration différente sur gel par rapport au brin sauvage. Hybridation Hybridation du produit d’amplification avec des sondes spécifiques ou non de la mutation recherchée. (RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphism - SSCP : Single-Strand Conformation Polymorphism.) Tableau III. Recherche de la mutation de l’oncogène Ki-ras dans différents sites anatomiques. Méthode Patients (Cancer/PC**) Sensibilité (%)/ Spécificité (%) Tubage duodénal 60 (19/29) 63 /98 Cytoponction 93 (41/52) 59 /100 Bile 20 (20/-) 55/- Voies pancréatiques* 486 (199/287) 73 /90 * Cumul de 6 séries y compris celle de notre centre ; analyse après prélèvement de suc pancréatique pur et/ou brossage sous CPRE. ** PC = pancréatite chronique. 63 D O S S I E R T La mutation de l’oncogène Ki-ras semble apparaître très précocement au cours de la cancérogénèse pancréatique. La présence de mutations du Ki-ras sur des lésions dysplasiques précancéreuses, et ce au cours de modèles expérimentaux ou sur pièces opératoires, laisse présager d’un phénomène précoce au cours de la cancérogénèse pancréatique. De même des tumeurs à potentiel dégénératif, comme les tumeurs intraductales mucineuses papillaires présentent une mutation de l’oncogène Ki-ras dans 92 % des cas (17). Enfin des observations privilégiées, certes en petit nombre, font état de la présence de la mutation dans le suc pancréatique jusqu’au quarantième mois avant le développement d’un cancer invasif (7, 18). La recherche de cette mutation peut donc constituer un marqueur précoce de l’affection. Une étude multicentrique française est actuellement en cours pour évaluer si la recherche de cette mutation dans le suc pur peut amener à un diagnostic plus précoce du cancer pancréatique chez des patients avec une symptomatologie certes peu parlante mais pouvant autoriser ce diagnostic précoce. Un suivi à long terme doit permettre de répondre aux attentes que suscite cette technique. LES GÈNES SUPPRESSEURS DE TUMEUR Leur altération aboutit à une perte de fonction souvent inhibitrice et principalement perte d’un effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire. Leur inactivation est le fait d’altérations homozygotes avec mutation ou délétion associée à une perte d’hétérozygotie de l’allèle controlatéral (tableau I). p53 La protéine p53 est une phosphoprotéine nucléaire possédant des propriétés inhibitrices sur le cycle cellulaire (induction de la CDKI p21) mais aussi des effets pro-apoptotiques et de réparation de l’ADN. Elle est capable de se fixer spécifiquement sur l’ADN pour activer des facteurs de transcription. La survenue de mutations intragéniques (plusieurs centaines décrites à ce jour) empêchent cette fixation à l’ADN et donc une perte de fonction de la p53. Ces mutations sont présentes dans près de 76 % des cancers pancréatiques avec, en parallèle, une perte d’hétérozygotie propre aux gènes suppresseurs de tumeur, au niveau du bras court du chromosome 17 (près de 100 % des cancers pancréatiques) (tableau I). Un taux élevé d’anticorps anti-p53 dans le sérum de patients atteints de cancer pancréatique (alors que ces anticorps sont peu ou pas présents dans la population générale) a été observé dans près de 30 % des cas (19). Cette mesure ne peut constituer à l’heure actuelle un marqueur utilisable en pratique clinique. MTS1 et DPC4 Le gène MTS1 (codant pour la protéine p16, CDKI impliquée dans la régulation négative du cycle cellulaire) est inactivé dans près de 80 % des cancers pancréatiques (tableau I) (20, 21). Il est difficile de savoir si l’altération de MTS1 apparaît précocement au cours de la cancérogénèse pancréatique et des études complémentaires sont nécessaires sur ce plan. La recherche de la mutation de MTS1 à partir du suc prélevé par CPRE est possible de même que celles de l’anti-oncogène DPC4. Ce gène a été récemment identifié comme gène suppresseur de tumeur pour 64 H É M A T I Q U E le cancer pancréatique. Il code pour la protéine Smad4 impliquée dans le signal de transduction du TGFβ et son effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire. DPC4 est inactivé dans 50 % des cancers pancréatiques (22). De plus, une mutation de DPC4 est systématiquement associée à une mutation de MTS1. Le caractère précoce de la mutation de DPC4 n’est pas encore reconnu. Nos premiers résultats établis à partir de suc pancréatique pur font état d’un taux de mutations homozygotes de l’ordre de 50 % des deux gènes suppresseurs MTS1 et DPC4 au cours des pancréatites chroniques, ce qui semble limiter cette recherche pour un diagnostic spécifique du cancer du pancréas (23, 24). CONCLUSION ET PERSPECTIVES La mutation de l’oncogène Ki-ras est donc à l’heure actuelle l’altération génique la plus fréquente et la plus spécifique du cancer pancréatique. Sa recherche nécessite une méthodologie stricte devant obéir aux règles de l’amplification génique et devrait enfin comporter une confirmation par séquençage direct. La recherche simultanée d’autres altérations géniques ne semble pas apporter à l’heure actuelle un intérêt clinique par rapport à l’analyse du Ki-ras seule. Cette dernière s’appliquerait principalement à des situations cliniques pouvant correspondre à une phase dite “de début” du cancer pancréatique : il peut donc s’agir de patients se présentant avec une pancréatite aiguë “a priori” idiopathique ou des symptômes peu spécifiques mais accompagnés d’anomalies parenchymateuses ou canalaires échographiques (notamment écho-endoscopiques) et/ou radiologiques pancréatiques. Le résultat des études cliniques en cours nous permettra vraisemblablement d’établir si l’analyse du Ki-ras va aider à la décision clinique : quand opérer et qui ? quand surveiller et qui ? La connaissance toute récente du génome humain assortie de la puissance actuelle des analyses génomiques permettra vraisemblablement de progresser en parallèle dans la connaissance de la cancérogénèse pancréatique, voire dans la détermination de nouveaux marqueurs. ■ Mots clés. Diagnostic précoce – Oncogènes – Gènes suppresseurs de tumeur. R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S 1. Miki H, Matsumoto S, Harada H et al. Detection of c-Ki-ras point mutation from pancreatic juice. A useful diagnostic approach for pancreatic carcinoma. Int J Pancreatol 1993 ; 14 : 145-8. 2. Van Laethem JL, Vertongen P, Deviere J et al. Detection of c-Ki-ras gene codon 12 mutations from pancreatic duct brushings in the diagnosis of pancreatic tumours. Gut 1995 ; 36 : 781-7. 3. Watanabe H, Yamaguchi Y, Ha A et al. Quantitative determination of K-ras mutations in pancreatic juice for diagnosis of pancreatic cancer using hybridization protection assay. Pancreas 1998 ; 17 : 341-7. 4. 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