Les outils de la biologie moléculaire
publicité
Les outils de la biologie moléculaire • Enzymes qui coupent les acides nucléiques • Enzymes qui changent les contraintes des AN • Enzymes qui travaillent sur les phosphates • Enzymes qui recopient les acides nucléiques Dr. Jacques PAOLETTI Polarité de la chaîne d’ADN C A 3’ P 3’ P 5’ G 3’ P 5’ Dr. Jacques PAOLETTI P 5’ Les nucléases Les enzymes de restriction La DNase I La nucléase S1 Dr. Jacques PAOLETTI Les enzymes de restriction Définition Le palindrome Symétrie de la coupure Coupure à bouts collants Coupure à bouts francs Restriction et méthylation de l’ADN Dr. Jacques PAOLETTI Les enzymes de restriction Les enzymes de restriction sont des outils utilisés pour couper l’ADN. La coupure de l’ADN se fait en un site particulier reconnu par l’enzyme. Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique. Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique 3’ 5’ 3’ 5’ Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’). 3’ 5’ 3’ 5’ Dr. Jacques PAOLETTI Enzymes de restriction Dr. Jacques PAOLETTI Palindrome LAVAL Les séquences de nucléotides Reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’à3’ (gauche - droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite - gauche pour le second brin (sens 5’à3’). Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4 ou 6 paires de bases. Mot palindromique 5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’ Séquence palindromique Dr. Jacques PAOLETTI Sites de restriction Dr. Jacques PAOLETTI Symétrie des enzymes de restriction Dr. Jacques PAOLETTI LES COUPURES À BOUTS COLLANTS Enzyme Eco RI : 5' - G ê AATT 3' - C 5’ – G – 3’OH 3’ – CTAAG – 5’P C- 3' T TAAéG- 5' 5’P – AATTC – 3’ 3’OH – G – 5’ Dr. Jacques PAOLETTI LES COUPURES À BOUTS FRANCS Enzyme Hae III : 5' - GGêCC - 3' 3' - CCéGG - 5‘ 5’ – GG – 3’OH 3’ – CC – 5’P 5’P – CC – 3’ 3’OH – GG – 3’ Dr. Jacques PAOLETTI Les nucléases La DNAse I La nucléase S1 Dr. Jacques PAOLETTI LA DNase I 5' 3' 3' 5' C'est une endonucléase Ses coupures se font au hasard Elle coupe l'ADN (simple ou double brin) Dr. Jacques PAOLETTI La DNase La DNase 1 est une endonucléase qui dégrade l’ADN double brin ou simple brin. Les coupures (« nicks ») sont complètement aléatoires sans spécificité de site. Les produits de la réaction sont des oligonucléotides qui possèdent un groupement phosphate en 5’. L’activité dépend des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+) P P P P P 3’ P P OH P P 5’ P Dr. Jacques PAOLETTI La Nucléase S1 La nucléase S1 dégrade l’ADN simple brin. Nettoie les extrémités simples brins. Coupe un misappariement Sans activité sur le double brin « parfait » Sans activité sur les hybrides ADN/ARN S1 5’ 3’ 3’ 5’ Dr. Jacques PAOLETTI Enzymes des phosphates Les phosphatases Les kinases Dr. Jacques PAOLETTI Phosphatases et Kinases Les phosphatases sont des enzymes qui enlèvent les groupements phosphates situés en 5’ d’une chaîne d’ADN. Phosphatase alcaline est active à pH basique. Les kinases, à l’inverse des phosphatases, sont des enzymes qui ajoutent un groupement phosphate à l’extrèmité 5’ d’un ADN , en présence d’ATP. ã â á A C’est le phosphate en ã de l’ATP qui est transféré. Dr. Jacques PAOLETTI
