Intérêts et limites de la coproculture dans le
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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année 2011 - Thèse n°18 Intérêts et limites de la coproculture dans le diagnostic des diarrhées d’origine bactérienne du chien et le chat THESE Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 4 juillet 2011 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par LAURET Aurélie Née le 12 janvier 1986 A Saint Louis (Ile de la Réunion) 1 2 VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année 2011 - Thèse n°18 Intérêts et limites de la coproculture dans le diagnostic des diarrhées d’origine bactérienne du chien et le chat THESE Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 4 juillet 2011 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par LAURET Aurélie Née le 12 janvier 1986 A Saint Louis (Ile de la Réunion) 3 4 5 6 REMERCIEMENTS À Monsieur le Professeur Dominique Peyramond Qui nous a fait l’honneur d’accepter de présider ce jury Qu‟il trouve ici le témoignage de notre profond respect À Madame le Docteur Marine Hugonnard Qui m’a encadrée et soutenue tout au long de l’élaboration de ce travail, qui a toujours su me donner de précieux conseils et sans qui ce dernier n’aurait pas eu lieu Qu‟elle soit assurée de ma reconnaissance et ma gratitude À Monsieur le Professeur Angeli Kodjo Qui m’a apporté son aide, qui a accepté de juger ce travail et de participer à notre jury de thèse Qu‟il trouve ici l‟expression de mes sincères remerciements Au laboratoire Idexx Alfort, Pour sa collaboration et sa disponibilité Qu‟il soit remercié pour l‟attention portée à la conception de ce travail 7 8 À mes parents, à qui je dois tant…, qui ont toujours tout fait pour que je puisse réaliser mes rêves, qui ont toujours été là pour moi et qui ont toujours cru en moi. Vous êtes des parents formidables et c‟est grâce à vous que je suis arrivée là où je suis. À Emmanuelle et Alexandra, mes sœurs adorées, pour tous ces souvenirs partagés ensemble, nos fous rires, nos disputes… je vous souhaite tout le bonheur et toute la réussite possibles. À Mémé Antoinette, merci pour tes petites attentions, ta générosité et ton amour. J‟espère te garder encore très longtemps À Mamie Philippe, merci pour ton soutien, ton amour, tes « petits coups de fils » malgré la distance À Pépé Ariste et Papy Christian, vous resterez à jamais dans mon cœur À ma marraine, parce que tu m‟as toujours accompagnée et soutenue À mes oncles et tantes, à ma bande de cousins et cousines, pour tous ces repas en famille et autres bons moments passés ensemble À Christophe, toi qui m‟a toujours soutenu dans mes nombreux moments de doute… merci de m‟avoir toujours encouragée et poussée à me dépasser chaque jour. Merci pour ta patience, pour ton amour, pour ton optimisme et pour cette merveilleuse année passée à tes côtés. Tu es la meilleure chose qui me soit arrivée dans ma vie. À la famille Clin, merci de m‟avoir si bien accueillie À Dinette, parce que venir à Lyon m‟a fait rencontrer la véritable amie que tu es. Merci pour ton amitié sincère qui j‟espère durera encore de nombreuses années. À Kindy, Marie, Fanny et Margot (le « cœur » du Chat Méchant !), Aurélie P., Prachette, Laure, Laetitia et Schnapy, merci pour nos soirées, nos délires et ces cinq années à l‟école À Soso, Juju, Gwegwe et Elisou mes amies de toujours… A nos années prépa, qui grâce à vous ont été inoubliables. À Audrey et Cathy, mes amies « de la Réunion », je vous souhaite le meilleur À mon ancienne, à nos bons moments passés ensembles À ma poulotte, la meilleure de toutes À Aurélie F., à nos soirées bananes flambées devant un bon film de filles À Cécilou, ma toulousaine préférée, pour ces quatre mois à Saint Hyacinthe À Gaspard et Christelle, j‟ai passé de très bons moments avec vous « Rue Sicotte » ! À Paule, Simone, Jean Pierre, René, Mireille, Jean-Roland et Carole, vous qui m‟avez accueilli dans vos familles pendant trois ans. Merci d‟avoir été présents. À Jacky, pour ta générosité sans faille. Tu nous manques beaucoup. À tous mes maîtres de stages, qui m‟ont beaucoup appris au cours de ces cinq dernières années À Ussley, Babzy, Louping et Taouk, boules de poils à quatre pattes pour qui j‟en suis arrivé là… 9 10 SOMMAIRE Remerciements…………………………………………………………………7 Sommaire………………………………………………………………………11 Liste des figures ................................................................................................. 15 Introduction ....................................................................................................... 17 Partie 1 : Les bactéries entéropathogènes du chien et du chat ..................... 19 A. La flore microbienne physiologique du tractus intestinal du chien et du chat ...... 21 1. Composition............................................................................................................... 21 2. Rôle physiologique .................................................................................................... 23 3. La régulation de la flore microbienne intestinale ...................................................... 24 Les mécanismes de régulation dépendant de l‟hôte ............................................... 24 a) b) Les facteurs environnementaux régulant la flore intestinale ................................. 25 Conséquences d‟un déséquilibre de la flore endogène .............................................. 26 4. B. Prévalence des causes bactériennes dans les diarrhées du chien et du chat .......... 28 1. Clostridium spp.......................................................................................................... 28 a) Clostridium perfringens ......................................................................................... 28 b) Clostridium difficile ............................................................................................... 29 2. Campylobacter spp. ................................................................................................... 30 3. Salmonella spp. . ........................................................................................................ 33 4. Escherichia coli ......................................................................................................... 36 C. Incidence clinique des bactéries entéropathogènes chez le chien et le chat………………………………………………………………………………………….41 1. Clostridium spp.......................................................................................................... 41 a) Clostridium perfringens ......................................................................................... 41 i. Etiologie et épidémiologie ................................................................................. 41 ii. Pathogénie .......................................................................................................... 42 iii. Signes cliniques .................................................................................................. 44 b) Clostridium difficile ............................................................................................... 44 i. Etiologie et épidémiologie ................................................................................. 44 ii. Pathogénie .......................................................................................................... 45 iii. Signes cliniques .................................................................................................. 46 11 2. Campylobacter spp. ................................................................................................... 46 a) Etiologie et épidémiologie ..................................................................................... 46 b) Pathogénie .............................................................................................................. 47 c) Signes cliniques ..................................................................................................... 49 d) Potentiel zoonotique............................................................................................... 49 3. Salmonella spp. .......................................................................................................... 50 a) Etiologie et épidémiologie ..................................................................................... 50 b) Pathogénie .............................................................................................................. 52 c) Signes cliniques ..................................................................................................... 55 d) Potentiel zoonotique............................................................................................... 56 4. Escherichia coli ......................................................................................................... 57 a) Etiologie et épidémiologie ..................................................................................... 57 b) Pathogénie .............................................................................................................. 59 i. Escherichia coli entérotoxinogènes (ECET) ...................................................... 59 ii. Escherichia coli entéropathogènes (ECEP) ....................................................... 62 iii. Escherichia coli vérotoxinogènes (ECVT ou ECST)........................................ 66 c) Signes cliniques ..................................................................................................... 66 d) Potentiel zoonotique............................................................................................... 66 Partie 2 : La coproculture dans le diagnostic de laboratoire des diarrhées d’origine bactérienne du chien et du chat : aspects techniques et pratiques ............................................................................................................................. 69 A. Choix de l’échantillon et acheminement au laboratoire .......................................... 71 1. Critères de choix de l‟échantillon .............................................................................. 71 a) Selles fraîches ou écouvillons rectaux ?................................................................... 71 b) Caractéristiques des prélèvements ........................................................................... 73 i. Moment du prélèvement ................................................................................. 73 ii. Quantité et mode de prélèvement ................................................................... 74 2. Modalités de transport : milieux de transport et réfrigération ................................... 76 3. Délais d‟acheminement et de traitement des prélèvements ....................................... 78 a) Bactéries nécessitant un court délai de transport : Campylobacter et Clostridium spp. ……………………………………………………………………………………78 b) Bactéries ne nécessitant pas un délai de transport particulier : Escherichia coli et Salmonella spp. ............................................................................................................. 79 12 4. La formulation de la demande de l‟examen accompagnant le prélèvement de selles : exemple du laboratoire Idexx Alfort................................................................................. 79 B. Mise en culture des prélèvements .............................................................................. 80 1. L‟enrichissement des prélèvements ........................................................................... 80 2. Ensemencement : les milieux de culture sélectifs et non sélectifs ............................ 81 a) Salmonella spp. ...................................................................................................... 81 b) Campylobacter spp. ............................................................................................... 88 c) Clostridium spp. . ................................................................................................... 83 d) Escherichia coli ..................................................................................................... 84 3. Identification des micro-organismes isolés ............................................................... 85 C. Les examens complémentaires à la coproculture ..................................................... 85 1. La cytologie fécale ..................................................................................................... 85 2. L‟immunodétection des toxines................................................................................. 90 L‟entérotoxine A de Clostridium perfringens........................................................ 90 a) b) Les toxines de Clostridium difficile ....................................................................... 91 c) Les toxines des Escherichia Coli entérotoxinogènes (ETEC) et vérotoxinogènes (ECVT) .......................................................................................................................... 93 3. Rôle de la Réaction de Polymérisation en chaîne (PCR) dans l‟identification des germes entéropathogènes et des gènes codant pour des facteurs de virulence ............... 93 a) Gènes codant pour des toxines bactériennes .......................................................... 93 i. Clostridium perfringens ..................................................................................... 94 ii. Clostridium difficile............................................................................................ 94 iii. Escherichia coli entérotoxinogènes et vérotoxinogènes .................................... 95 b) Gènes impliqués dans la pathogénie de la diarrhée : cas des ECEP ...................... 96 c) Détection de Salmonella spp. et Campylobacter spp. par PCR ............................. 96 4. Le sérotypage des souches bactériennes isolées ........................................................ 98 5. Les examens complémentaires proposés par le laboratoire Idexx Alfort ................. 98 D. Le compte-rendu du laboratoire ................................................................................ 98 1. Flore physiologique perturbée ................................................................................... 99 2. Absence de croissance ............................................................................................... 99 3. Absence de germe pathogène spécifique ................................................................. 100 4. Culture bactérienne pure .......................................................................................... 100 5. Deux à trois cultures bactériennes pures ................................................................. 100 6. Antibiogramme ........................................................................................................ 100 13 Partie 3 : Place et intérêt de la coproculture face à une diarrhée .............. 103 A. Quand demander une coproculture ?...................................................................... 105 1. Les indications de réalisation de la coproculture..................................................... 105 a) La coproculture lors d‟atteinte individuelle .......................................................... 105 b) La coproculture lors de pathologies d‟élevage .................................................... 107 c) 2. La coproculture lors de diarrhée aiguë ou chronique ........................................... 108 A quel moment demander une coproculture ? ......................................................... 109 a) Stade de la maladie .............................................................................................. 109 b) Diarrhée aiguë ou chronique ................................................................................ 109 c) Traitements antibiotiques ..................................................................................... 109 B. Intégration des résultats de la coproculture fournis par le laboratoire dans un contexte clinique donné : application à chaque germe entéropathogène .................... 110 1. Clostridium spp........................................................................................................ 111 2. Campylobacter spp. ................................................................................................. 112 3. Salmonella spp. ........................................................................................................ 112 4. Escherichia coli ....................................................................................................... 113 C. Guide pratique pour le diagnostic des diarrhées bactériennes chez le chien et le chat…. ................................................................................................................................ 114 1. Clostridium perfringens ........................................................................................... 114 2. Clostridium difficile ................................................................................................. 114 3. Campylobacter spp. ................................................................................................. 115 4. Salmonella spp. ........................................................................................................ 115 5. Escherichia coli ....................................................................................................... 116 Conclusion ........................................................................................................ 117 Liste des définitions ......................................................................................... 119 Bibiographie ..................................................................................................... 123 14 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Composition de la microflore intestinale (nombre d‟organismes par g ou ml) (Strombeck, 1996) .................................................................................................................... 23 Figure 2 : Les différents toxinotypes de Clostridium perfringens (Marks and Kather, 2006) ........................................................................................................ 42 Figure 3 : Sources de salmonelles et facteurs prédisposant à une salmonellose clinique (d‟après Quarter and Quinn, 2000)........................................................................................... 51 Figure 4 : Etapes du développement d‟une diarrhée inflammatoire à Salmonella Typhimurium (d‟après Libby et al., 2004) ...................................................................................................... 53 Figure 5 : Représentation schématique des différentes étapes de la genèse d‟une entérite salmonellique (Barrow et al., 2010) ......................................................................................... 54 Figure 6 : Microscopie électronique à transmission. Cas d‟un chiot infecté montrant l‟adhésion de la bactérie aux entérocytes sans destruction des microvillosités (Drolet et al., 1994)…………………………………………………………………………...60 Figure 7 : Microscopie électronique à transmission. Cas d‟un chiot infecté montrant la colonisation massive de la surface des microvillosités, sans atteinte de la bodure en brosse (tête de flèche) (Drolet et al., 1994).. …………………………………………………………600 Figure 8 : Mécanisme d‟action à l‟échelle cellulaire de la toxine thermostable STb d‟Escherichia coli entérotoxinogène (Gyles and Fairbrother, 2010) ....................................... 61 Figure 9 : Représentation schématique des étapes de la pathogénèse d‟une infection à ECET (d‟après Gyles and Fairbrother, 2010) ..................................................................................... 62 Figure 10 : Mécanisme de la formation des lésions d‟attachement-effacement (Wales et al., 2005) .................................................................................................................. 64 Figure 11 : E.coli attachants-effaçants et destruction des microvillosités à la microscopie électronique (Ettinger and Feldman, 2005, b). ......................................................................... 65 15 Figure 12 : Microscopie électronique à transmission. E.coli attachants-effacants chez un chien, formant un piedestal au pôle apical des entérocytes avec un effacement des microvillosités. (Drolet et al., 1994). ....................................................................................... 65 Figure 13 : Coupes histologiques à partir de biopsies coliques montrant une infiltration neutrophilique associée à des érosions de l‟épithélium. Grossissement×20. (Service d‟Anatomie Pathologique du Campus Vétérinaire de Lyon). .................................................. 72 Figure 14 : Détail de la zone 1. Infiltrat neutrophilique. Grossissement ×40. (Service d‟Anatomie Pathologique du Campus vétérinaire de Lyon). ................................................... 72 Figure 15 : Détail de la zone 2. Erosion épithéliale. Grossissement×40. (Service d‟Anatomie Pathologique de Campus Vétérinaire de Lyon). ...................................................................... 73 Figure 16 : Milieu Rappaport : Aspect du milieu avant ensemencement (gauche) et après ensemencement (droite) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html). .. 81 Figure 17 : Milieu McConkey : aspect du milieu avant ensemencement (gauche) et après ensemencement (droite, colonies lactose +) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) ........................................... 82 Figure 18 : Gélose au jaune d‟œuf : aspect du milieu avant ensemencement (gauche) et après ensemencement (gauche, lécithinase +) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) ........................................... 84 Figure 19 : Gélose Hektoen : aspect après ensemencement (E.coli, colonies vertes) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) ........................................... 85 Figure 20 : Leucocytes à la cytologie fécale avec une coloration de Diff-Quik® (Broussard, 2003)......................................................................................................................................... 87 Figure 21 : Cytologie fécale et bactéries Campylobacter-like (Broussard, 2003) ................... 88 Figure 22 : Frottis fécal coloré (coloration de Wright modifiée) provenant d‟un chat cliniquement sain et présentant de nombreuses endospores de Clostridium perfringens. Grossissement×1000 (Cook, 2008) .......................................................................................... 89 16 INTRODUCTION La diarrhée est une des manifestations principales de l‟atteinte de la sphère digestive. Elle se définit par une augmentation de la fréquence d‟émission des selles et/ou une diminution de leur consistance et/ou une augmentation de leur volume. C‟est un motif de consultation fréquent chez le chien et le chat. La diarrhée reconnaît des causes extradigestives et digestives. Parmi les causes digestives, les déséquilibres de la flore intestinale impliquant ou non des germes entéropathogènes représentent une cause importante de diarrhée, notamment chez le chien. Les bactéries les plus fréquemment rencontrées dans les diarrhées d‟origine infectieuse canines et félines sont : Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter spp., Escherichia coli et Salmonella spp.. La coproculture, ou examen bactériologique des selles, consiste en la recherche des bactéries par ensemencement des selles sur des milieux de culture appropriés. Le but est de rechercher parmi une flore commensale très abondante, soit des bactéries habituellement absentes et réputées pour leur pouvoir pathogène, soit une espèce bactérienne anormalement prédominante. Certaines bactéries peuvent aussi exister en tant que constituants normaux de la flore microbienne physiologique intestinale ou ne pas être nécessairement associées à la présence de symptômes digestifs. Leur isolement à partir de selles peut rendre par conséquent l‟interprétation des résultats de cet examen difficile. Par ailleurs, les diarrhées bactériennes sont souvent de durée brève et des traitements symptomatiques sont entrepris sans qu‟aucun diagnostic étiologique ne soit établi. Il convient d‟établir clairement les indications de la réalisation d‟une coproculture chez les chiens et chats atteints de diarrhée afin de redonner à cet examen une pertinence clinique. Nous allons donc étudier les limites et les intérêts de la coproculture dans l‟approche diagnostique d‟une diarrhée chez le chien et le chat. Dans un premier temps nous nous intéresserons aux germes entéropathogènes du chien et du chat en précisant les mécanismes pathogéniques de la diarrhée, le tableau clinique associé à chacun d‟eux, ainsi que leur fréquence d‟isolement. J‟ai choisi de ne parler que des bactéries les plus couramment rencontrées et qui sont, par conséquent, les plus étudiées. Bien d‟autres bactéries potentiellement entéropathogènes existent, mais soit leur prévalence est très faible (Bacillus piliformis par exemple), soit leur rôle exact dans le mécanisme pathogénique n‟est pas encore élucidé (Yersinia spp., Anaerobiospirillum,…). Nous parlerons ensuite des aspects techniques et pratiques de la coproculture. Il s‟agira dans cette partie d‟étudier les différents aspects de cet examen : du prélèvement de l‟échantillon aux résultats fournis par le laboratoire en passant par les modalités de transport de l‟échantillon et les méthodes de mise en culture. Enfin, nous nous pencherons sur l‟aspect médical en étudiant la place de la coproculture dans le diagnostic des diarrhées bactériennes du chien et le chat. Nous évaluerons ses limites et ses indications, dans quelles circonstances le vétérinaire peut demander sa réalisation et comment confronter les résultats du laboratoire aux données cliniques. 17 Ce travail a été réalisé avec l‟aimable collaboration du laboratoire Idexx d’Alfort qui a su apporter son point de vue vis-à-vis de cet examen qu‟est la coproculture. 18 Partie 1 : Les bactéries entéropathogènes du chien et du chat 19 20 A. La flore microbienne physiologique du tractus intestinal du chien et du chat (Leib, 2008, a et b ; Strombeck, 1996 ; Person, 1982) 1. Composition Les muqueuses digestives supportent le plus grand nombre et la plus grande variété d‟espèces bactériennes. En effet, un millier d‟espèces bactériennes différentes peuvent être retrouvées (Strombeck, 1966). Le nombre et les espèces de bactérie sont différents selon la localisation anatomique au sein du tube digestif. Chaque espèce bactérienne possède sa niche écologique préférentielle au sein de ce dernier. La flore microbienne se compose de deux types de population bactérienne : - Une population bactérienne dite « résidente » ou endogène car les espèces qui la composent sont toujours retrouvées et en très grand nombre. Cette population endogène est donc très stable et représentative de la microflore digestive. - Une population exogène constituée d‟espèces bactériennes « contaminantes » représentant ainsi une flore de transit, très fluctuante, venant de la cavité buccale et de la nourriture ingérée. La flore microbienne physiologique est très complexe et varie grandement d‟un individu à l‟autre. Chacun possède une flore bactérienne endogène intestinale qui lui est propre, vivant en symbiose avec son hôte, et qui est stable dans le temps chez les individus sains. En effet, la microflore intestinale se met en place rapidement chez l‟animal nouveau-né, dès les premières semaines de vie, et une fois établie, il devient très difficile de la modifier et impossible à faire disparaître. Cette stabilité s‟exprime d‟une part dans le fait que des bactéries externes à cette flore, y compris des bactéries entéropathogènes, ont de grandes difficultés à coloniser le système digestif et d‟autre part dans l‟impossibilité à changer la composition de la flore endogène intentionnellement (par l‟utilisation de probiotiques par exemple). Les bactéries transitoires ne peuvent s‟installer durablement au sein du tractus intestinal car, introduites dans un nouveau milieu, elles sont moins bien adaptées et leur croissance s‟en trouve ralentie. Elles sont éliminées par les mécanismes de défense locaux et de manière passive par le péristaltisme avant qu‟elles ne puissent se multiplier et coloniser le milieu. L‟adaptation d‟une bactérie à son environnement et la colonisation exigent un temps plus long que celui passé dans le tube digestif lors d‟un transit. Deux propriétés fondamentales caractérisent ainsi la flore digestive physiologique des carnivores : variabilité dans les espèces et le nombre de bactéries représentées tout au long du tube digestif et stabilité de la flore endogène à un endroit donné. Cette dernière propriété se vérifie surtout au niveau de la flore colique. En effet, une étude chez le chien a montré qu‟il existe une grande variabilité dans le temps de la composition de la flore endogène de l‟intestin grêle, tant sur le plan qualitatif (espèces bactériennes) que sur le plan quantitatif (nombre total de bactéries) (Mentula et al., 2005). Cette flore de l‟intestin grêle apparaît également très variable d‟un individu à l‟autre, les espèces bactériennes prédominantes de l‟intestin grêle varient ainsi d‟un chien à l‟autre (Mentula et al., 2005). Chaque individu semblerait avoir une 21 flore jéjunale qui lui est propre. En revanche la flore endogène du côlon aurait globalement la même composition entre les individus et la composition en espèces bactériennes serait plus stable dans le temps (Mentula et al., 2005). Nous distinguerons ainsi la microflore de l‟intestin grêle de celle du gros intestin. En effet, celles-ci sont très différentes tant au niveau du nombre de bactéries qu‟au niveau de leur composition. La figure 1 rappelle la composition de la microflore intestinale. La flore microbienne endogène de l‟intestin grêle La concentration bactérienne dans l‟intestin grêle crânial, à jeun, est faible et varie de 10 à 102 par gramme de contenu intestinal. Après un repas, la charge bactérienne est de 102 à 103 par gramme dans cette même région. Dans les parties moyenne et caudale elle augmente progressivement jusqu‟à 103 à 104 par gramme. La flore endogène de l‟intestin grêle est très influencée, surtout dans sa partie crâniale, par l‟apport alimentaire de bactéries. La partie crâniale de l‟intestin grêle contient en majorité des bactéries Gram positives dont des streptocoques, des clostridies, des lactobacilles et des staphylocoques. Bacteroides et Bifidobacterium spp. sont également présents en plus petit nombre tout le long de l‟intestin grêle. La composition en espèces bactériennes en région moyenne et caudale se rapproche ensuite de plus en plus de celle du côlon. On y retrouve notamment des coliformes (Klebsiella et Enterobacter) ainsi que des entérocoques. La flore microbienne commensale de l‟intestin grêle du chat serait beaucoup plus riche en bactéries anaérobies strictes que celle du chien et le nombre total de bactéries serait aussi plus important. 1 La flore microbienne endogène du gros intestin Le caecum, le côlon et le rectum sont les sites les plus riches en bactéries. Un gramme de fèces peut contenir jusqu‟à 1011 bactéries. La flore bactérienne endogène y est très stable et est beaucoup moins influencée par un apport exogène alimentaire par rapport à celle de l‟intestin grêle. Les bactéries anaérobies (sporulées ou non) y sont prédominantes, représentant plus de 90% de la population bactérienne endogène totale. Parmi celles-ci, les genres Bacteroides spp. et Bifidobacterium spp. sont les plus nombreux. Les clostridies sont aussi présentes à l‟état physiologique. Les entérobactéries telles qu‟Escherichia coli et Klebsiella spp., les streptocoques et les lactobacilles sont également présents en grande quantité. Les bactéries endogènes du gros intestin sont en majorité des fermenteurs de carbohydrates, leur développement nécessite un apport en polysaccharides complexes. Elles ne possèdent pas d‟activité protéolytique et utilisent l‟ammoniac comme source d‟hydrogène. La flore microbienne endogène varie également en fonction de l‟âge de l‟animal (Buddington, 2003). Chez le chien adulte les bactéries anaérobies Gram négatives (Bacteroides spp.,…) représentent la majorité de la population bactérienne endogène (75%) alors que chez le jeune chien, ce sont les bactéries anaérobies Gram positives (Clostridium spp. et Bifidobactrium spp.) et les bactéries de la flore lactique (Lactobacillus et Streptococcus) qui sont majoritaires. Ceci s‟explique par le passage d‟une alimentation lactée à une alimentation carnée provoquant ainsi le passage d‟une flore lactique à une flore protéolytique. 22 Famille Genre Pseudomonaceae Enterobacteriaceae Pseudomonas Escherichia coli Klebsiella Enterobacter Bacteroidaceae Bacteroides Nesseriaceae Neisseria Veillonella Micrococaceae Staphylococcus Lactobaciliaceae Streptococcus Lactobacillus Bifidobactrium Ruminococcus Propionobacteriaceae Eubacterium Corynebacteriaceae Corynebacterium Bacillaceae Bacillus Clostridium Levures Métabolisme Intestin grêle Gros intestin A ANF ANF ANF AN ANF AN ANF ANF ANF AN AN ANF AN AN 101-103 101.6 101 100.4 101-103 102 Présent 100.1-104 Présent 107 - 108 107 - 108 108 - 1010 Présent 105.9 104.7 108 - 109 108 - 109 106.6 Présent Présent 108.7 105.4 107 - 109.1 105 Figure 1 : Composition de la microflore intestinale (nombre d’organismes par g ou ml) A : aérobie, AN : anaérobie, ANF : anaérobie facultative (Strombeck, 1996) 2. Rôle physiologique La microflore endogène du tractus intestinal est nécessaire à son fonctionnement physiologique. Tout d‟abord elle assure une fonction digestive. Elle permet le bon déroulement du processus physiologique de la digestion et une bonne absorption des nutriments. Les bactéries du côlon (Bifidobacterium et Lactobacillus spp. par exemple) métabolisent les carbohydrates, les protéines et les lipides. Les carbohydrates sont fermentés en acides gras à chaînes courtes (acétate, propionate et butyrate) et en gaz (hydrogène, méthane et dioxyde de carbone). Les acides gras à chaine courte inhibent la multiplication de bactéries pathogènes. Ils sont également absorbés et sont soit métabolisés par les entérocytes (butyrate), soit transportés vers d‟autres tissus (acétate et propionate) et utilisés comme source d‟énergie. La microflore a également un rôle trophique. En effet, les bactéries résidentes fournissent une part importante de vitamines à l‟organisme. Elles sont aussi nécessaires au bon développement de la muqueuse intestinale. La structure de cette dernière est influencée par la présence de la flore endogène. En effet, les animaux axéniques (ou « germ free ») possèdent un épithélium intestinal cuboïde plutôt que prismatique. De plus, le renouvellement cellulaire de l‟épithélium est plus faible chez ces animaux. A l‟inverse, lorsque le nombre de bactérie de la flore endogène augmente, le renouvellement cellulaire augmente ainsi que le nombre de cellules inflammatoires dans la lamina propria. Le type et le nombre de bactéries de la flore endogène influencent donc grandement la structure de la muqueuse intestinale. Une autre fonction capitale de la microflore physiologique intestinale est un rôle de défense. Elle prévient des éventuelles implantations et colonisations de l‟intestin par des 23 bactéries pathogènes transitoires, venant de l‟environnement ou des bactéries de la flore endogène ne se trouvant pas dans leur localisation anatomique habituelle. Cette microflore fait partie intégrante de la barrière épithéliale intestinale et joue en quelque sorte le rôle de « barrière microbiologique ». L‟adhérence à la muqueuse intestinale et la colonisation sont empêchées par des phénomènes de compétition (les bactéries endogènes utilisant l‟espace à la surface de la muqueuse et les nutriments ainsi que les facteurs de croissance nécessaires à leur métabolisme) et par la production d‟agents bactéricides, de protéases,… par la flore intestinale résidente. De plus, les bactéries de la flore endogène modifient les caractéristiques physico-chimiques du milieu par leur métabolisme et peuvent donc le rendre impropre à la multiplication d‟autres espèces bactériennes. Il existe par ailleurs, un phénomène de régulation des croissances des populations bactériennes de la flore endogène avec des relations antagonistes mais aussi synergiques entre les différentes espèces. Enfin, la flore endogène microbienne influence positivement le développement du système immunitaire local digestif. 3. La régulation de la flore microbienne intestinale Les variations quantitative et qualitative de la flore intestinale que l‟on observe d‟un bout à l‟autre du tube digestif ainsi que la stabilité de la flore endogène à un endroit donné dans le temps sont soumis à des puissants phénomènes de régulation. Ceux-ci permettent le maintien de l‟équilibre d‟un écosystème nécessaire à la bonne santé de l‟hôte. Les mécanismes physiologiques de régulation font intervenir des facteurs tenant à l‟hôte et des facteurs environnementaux. a) Les mécanismes de régulation dépendant de l‟hôte La sécrétion d‟acide chlorhydrique gastrique La sécrétion d‟acide chlorhydrique par l‟estomac permet de conserver une relative stérilité de son contenu. En effet, les bactéries atteignant l‟estomac à partir de la cavité buccale et des aliments sont, en grande partie, détruites par les sécrétions acides gastriques. Cette sécrétion d‟acide chlorhydrique est très importante dans la prévention de l‟implantation et de l‟invasion de bactéries entéropathogènes. Dans l‟intestin grêle, les sécrétions acides gastriques sont inhibées au fur et à mesure par les sécrétions basiques intestinales. Lorsque la sécrétion d‟acide chlorhydrique est inhibée ou réduite, le nombre de bactérie dans l‟intestin grêle augmente, surtout dans sa partie crâniale. On observe alors une augmentation du nombre d‟Escherichia coli et de clostridies ainsi qu‟une migration de la flore colique crânialement, vers l‟intestin grêle. Les thérapeutiques prolongées aux anti-acides peuvent entraîner ce genre de phénomène. 24 Le péristaltisme intestinal Le péristaltisme est indispensable pour garantir une charge bactérienne faible dans l‟intestin grêle. Il va dans le sens duodénum-jéjunum-iléon empêchant ainsi toute bactérie de se multiplier intensément, car elles sont éliminées plus vite qu‟elles ne se multiplient. Le péristaltisme est plus important dans le duodénum et le jéjunum expliquant en partie la colonisation plus importante de l‟iléon que des autres parties de l‟intestin grêle. Lors de troubles du péristaltisme, la flore physiologique intestinale augmente de manière significative et les bactéries de la flore colique remontent progressivement dans les régions crâniales de l‟intestin grêle. Les bactéries du genre Bacteroides spp., Bifidobactrium spp. et les coliformes prédominent. De même, lors de diarrhée, la flore intestinale est très perturbée et ne retrouve son état normal que lorsque le péristaltisme est rétabli. La barrière épithéliale intestinale Elle est constituée d‟une couche cellulaire épithéliale et d‟une couche de mucus à la surface de celle-ci. Ce système de défense non spécifique prévient l‟adhérence puis la pénétration dans les cellules intestinales et l‟invasion de l‟organisme par les bactéries. La surface des entérocytes est aussi recouverte du glycocalyx, au-dessus duquel se trouve la couche de mucus sécrétée par les cellules caliciformes. Cette barrière se compose également d‟un dernier élément de défense spécifique : les anticorps de classe immunoglobuline A. Ils sont excrétés par les entérocytes après avoir été synthétisés par les plasmocytes sousmuqueux. Ces anticorps sont des éléments de défense efficaces contre des bactéries entéropathogènes. b) Les facteurs environnementaux régulant la flore intestinale La stabilité de la flore endogène intestinale tient également à la présence de nombreux facteurs environnementaux. Influence de l‟alimentation sur la flore endogène Le régime alimentaire d‟un animal détermine en partie la composition de sa flore intestinale physiologique. Cette influence est plus grande sur la flore de l‟intestin grêle que celle du gros intestin (Strombeck, 1996). Elle explique aussi la substitution de la flore lactique par une flore protéolytique lors du sevrage. Chez l‟animal, il existe peu d‟études sur l‟effet du régime alimentaire sur la nature de la flore endogène intestinale par rapport à l‟homme. Chez ce dernier, des régimes alimentaires pauvres en protéines ou une malnutrition provoquent des phénomènes de malabsorption par des changements quantitatifs et qualitatifs de la flore (Strombeck, 1996). Une étude récente menée chez le chien a montré que des changements répétés du régime alimentaire chez des chiens possédant une flore endogène stable conduit aussi à des changements de la flore microbienne physiologique en réduisant progressivement la diversité des bactéries existantes (Bell et al., 2008). L‟alimentation peut aussi être la source de bactéries entéropathogènes. Même si dans la plupart des cas, la bactérie incriminée est éliminée par les mécanismes de défense locaux et 25 la présence de la flore endogène, elle peut toutefois subsister longtemps à des seuils très bas dans la lumière intestinale. L‟animal devient ce que l‟on appelle un « porteur sain ». Influence des agents antibactériens exogènes Les antibiotiques administrés par voie orale peuvent éliminer certaines populations bactériennes de la flore endogène ou les réduire considérablement (Bell et al., 2008). Les bactéries éliminées, sensibles à l‟antibiotique administré, permettront une croissance importante des bactéries ayant survécu, causant ainsi un déséquilibre de la flore. Cette surpopulation de certaines bactéries endogènes par rapport à d‟autres peut leur conférer un pouvoir pathogène. Ce déséquilibre peut aussi favoriser l‟implantation de bactéries transitoires entéropathogènes. Si on arrête le traitement, le repeuplement du tube digestif survient rapidement. Au bout d‟une semaine la flore revient à son état normal. Néanmoins, une utilisation irraisonnée des antibiotiques peut entraîner de grosses perturbations de la flore avec un rétablissement difficile. Influence du stress Le stress peut jouer un rôle significatif dans le développement de maladies gastrointestinales en provoquant des changements sur la flore endogène. Le mécanisme exact n‟est pas connu mais il semblerait que ce soit une altération du péristaltisme intestinal qui entraînerait un changement de la microflore et donc l‟apparition de maladies. 4. Conséquence d’un déséquilibre de la flore endogène La flore endogène intestinale est dans un état perpétuel d‟équilibre grâce à des phénomènes de régulation complexe abordés précédemment. Toute rupture de cet équilibre (régime alimentaire, stress, antibiothérapie, parasitisme, infections virales digestives…) entraîne des changements de la microflore physiologique. Ces derniers peuvent soit impliquer des bactéries endogènes qui peuvent devenir pathogènes (micro-organismes pathogènes occasionnels), soit des bactéries transitoires entéro-pathogènes provenant de l‟environnement ou de l‟alimentation, qui ont pu coloniser le tractus digestif car les conditions locales leur ont été favorables. Une fois que la colonisation a eu lieu, les bactéries pathogènes strictes ou occasionnelles peuvent se multiplier et induire une diarrhée. L‟homéostasie du tractus gastro-intestinal est primordiale et détermine l‟apparition ou non de maladies digestives (Bell et al., 2008). Plus particulièrement, la flore microbienne résidente est déterminante dans la santé de l‟hôte car elle offre une résistance contre les agents entéropathogènes (Buddington, 2003). L‟organisme est constamment en contact avec des bactéries qui ne font pas partie de sa flore microbienne physiologique, mais les troubles digestifs qui pourraient en résulter ne sont pas systématiques. Les bactéries transitoires ne deviennent pathogènes qu‟une fois qu‟elles ont pu coloniser le tractus intestinal. Cette colonisation n‟arrive que lorsqu‟il y a rupture d‟un ou plusieurs mécanismes d‟homéostasie (Buddington et al, 2003). L‟étude de la flore microbienne endogène colique du chien a montré que lors des épisodes diarrhéiques répétés, les changements dans sa fonction et/ou sa composition sont marqués et durables dans le temps 26 (Bell et al., 2008). Ceci renforce l‟idée que la flore microbienne endogène joue un rôle significatif dans l‟apparition d‟épisodes aigus de maladies digestives. La complexité des populations bactériennes de la flore endogène digestive ainsi que celle de leur régulation rend leur étude difficile. Elle explique aussi pourquoi la réalisation, et surtout l‟interprétation, d‟un examen complémentaire qu‟est la coproculture peuvent être délicates. En effet, la flore physiologique abrite elle-même des bactéries occasionnellement pathogènes pouvant être responsables de l‟apparition de diarrhée. Pour exemple, Clostridium perfringens ou Escherichia coli, sont des hôtes commensaux du gros intestin mais sont aussi agents de colites ou entérocolites chez le chien et le chat. Leur découverte lors d‟une coproculture devra être précautionneusement interprétée et réintégrée dans un contexte clinique donné. L‟abord des entérites bactériennes au laboratoire est délicat par le fait que de nombreuses espèces peuvent avoir un pouvoir entéropathogène (soit strict, soit occasionnel, soit opportuniste en fonction des conditions locales digestives). L‟attribution d‟un pouvoir pathogène à une bactérie est souvent peu aisé et il faut bien se garder d‟affirmer immédiatement que la bactérie isolée est la seule cause des symptômes observés. Ainsi, avant d‟interpréter l‟isolement d‟une bactérie à partir d‟un prélèvement biologique quelconque il convient tout d‟abord de distinguer plusieurs catégories de microorganismes pathogènes (déterminant chez un hôte une maladie qui peut se traduire par des signes cliniques ou, au contraire, rester inapparente) : - Microorganismes pathogènes occasionnels : habituellement saprophytes ou commensaux, ils peuvent éventuellement déterminer une maladie, lorsque la résistance que peut leur opposer leur hôte diminue. - Microorganismes opportunistes : saprophytes (ou commensaux) ne se montrant pathogènes que lorsque des conditions très exceptionnelles se trouvent accidentellement réunies. - Microorganismes pathogènes stricts (pathogène exclusif) : toujours pathogènes pour un hôte donné. Certains peuvent se rencontrer à l‟état saprophytique ou commensal chez des sujets particulièrement résistants ; ces derniers sont alors porteurs sains et peuvent jouer un rôle important dans la dissémination des maladies correspondantes. Isoler une bactérie d‟un prélèvement biologique tel que les selles ne veut pas toujours dire isoler une bactérie pathogène, à cause de cette frontière étroite qu‟il existe entre une bactérie pathogène et une bactérie non pathogène. Toutes celles étudiées dans ce travail manuscrit, à savoir : Campylobacter spp., Salmonella spp., Clostridium perfringens, Clostridium difficile et Escherichia coli, sont retrouvées chez des chiens et chats cliniquement sains et certaines font même partie de la flore microbienne physiologique intestinale. Beaucoup d‟études sont donc encore nécessaires pour étudier le rôle précis de la flore physiologique intestinale et des bactéries entéropathogènes dans les maladies intestinales. 27 B. Prévalence des principales bactéries entéropathogènes du chien et du chat Nous allons, dans ce paragraphe, faire un état des lieux de la situation épidémiologique des bactéries entéropathogènes par des données concernant les fréquences d‟isolement aussi bien chez les chiens et chats porteurs asymptomatiques que chez les chiens et chats présentant de la diarrhée. Les fréquences d‟isolement pour une bactérie donnée dans ce contexte représentent le pourcentage d‟animaux (chien et/ou chat) ayant eu un résultat de coproculture positif pour cette même une bactérie. 1. Clostridium spp. a) Clostridium perfringens La majorité des souches canines sont du type A, c‟est-à-dire qu‟elles produisent la toxine alpha et l‟entérotoxine de type A (CPE pour Clostridium Perfringens Enterotoxin). Les différentes études citées ci-dessous ne s‟intéressent qu‟au rôle de l‟entérotoxine de type A dans la diarrhée du chien et le chat. Plusieurs ont ainsi montré une association significative entre l‟immunodétection par la méthode ELISA de l‟entérotoxine dans les selles et la présence de la diarrhée canine. Dans trois études (Kruth et al., 1989 ; Weese et al., 2001, b ; Marks et al., 2002), l‟entérotoxine était présente respectivement dans 41%, 28% et 34,4% des chiens atteints de diarrhée contre 7%, 5% et 14,3% des chiens cliniquement sains. Dans une autre étude (Weese et al., 2001, a), l‟entérotoxine n‟était présente dans les fèces qu‟au cours des épisodes diarrhéiques chez deux chiens malades et non lorsque les fèces étaient normales. En revanche, les taux d‟isolement de Clostridium perfringens à partir des selles ne montrent aucune différence significative entre chiens cliniquement normaux et chiens atteints de diarrhée (Marks et al., 1999 ; Marks et al., 2002). Les prévalences de Clostridium perfringens sont également élevées chez les chiens sains : 83% (Marks et al., 2002), 71% (Weese et al., 2001, b) et 54% (Marks et al., 1999). Une association significative existe également entre la détection par PCR du gène codant pour l‟entérotoxine (cpe) et la présence de la diarrhée chez le chien (Marks et al., 2002). Cependant, certaines études se contredisent quant à l‟association de la diarrhée à la détection de l‟entérotoxine dans les selles. L‟étude de Marks et al., 1999 ne montre aucune association en utilisant la méthode Reverse Passive Latex Agglutination (RPLA), alors que celle de Cave et al., 2002 montre une association significative par cette même méthode mais pas par la méthode ELISA. Dans cette dernière étude sur des chiens hospitalisés la prévalence dans les selles de l‟entérotoxine était de 14,3% chez les chiens atteints de diarrhée contre 12% chez les chiens sains par la méthode ELISA et de 45% contre 25% par la méthode RPLA. Clostridium perfringens peut également être associé à des épidémies de diarrhées nosocomiales (Kruth et al., 1989). La diarrhée était associée à de multiples sérotypes de Clostridium perfringens entérotoxinogènes et aucun autre agent n‟a pu être isolé des selles. 28 b) Clostridium difficile Les fréquences d‟isolement de Clostridium difficile vont de 0 à 40% chez les chiens sains ou atteints de diarrhée (Marks and Kather, 2003). Aucune différence significative entre les fréquences d‟isolement du germe entre chiens sains et souffrant de diarrhée n‟a été constatée. Concernant les toxines sécrétées par Clostridium difficile (toxines A et B, présentées dans le paragraphe C.1.b.ii.), une association significative a été démontrée entre leur détection et la présence de la diarrhée chez le chien (Cave et al., 2002 ; Weese et al., 2001, b ; Marks et al., 2002). On retrouve très souvent Clostridium difficile en milieu hospitalier vétérinaire car c‟est un agent de diarrhée nosocomiale chez les chiens et les chats hospitalisés. Les taux d‟isolement de la bactérie dans les selles de chiens et chats hospitalisés vont de 9 à 40% (Madewell et al., 1999 ; Clooten et al., 2008 ; Stuble et al., 1994 ; Riley et al., 1991). Le taux de portage fécal de Clostridium difficile est plus élevé chez les patients hospitalisés que chez les animaux non hospitalisés (Struble et al., 1994 ; Madewell et al., 1999). Une étude menée dans un service de soins intensifs a montré une association significative entre l‟acquisition de Clostridium difficile durant l‟hospitalisation et le développement d‟une diarrhée (Clooten et al., 2008). De plus, l‟incidence du taux de colonisation par la bactérie augmentait avec la durée de l‟hospitalisation. Clostridium perfringens et difficile sont retrouvés à la fois chez les chiens et chats cliniquement sains et ceux présentant de la diarrhée, avec des fréquences d‟isolement similaires. Les prévalences de ces agents sont élevées car ce sont aussi des agents commensaux de la flore intestinale des carnivores domestiques. Les toxines sécrétées par ces deux bactéries (entérotoxine de type A pour C.perfringens et toxines A et B pour C.difficile) sont cependant associées de manière significative à la présence de diarrhée chez le chien et le chat. Clostridium difficile est, quant à lui, un agent important de diarrhée nosocomiale dans les milieux hospitaliers vétérinaires. 29 2. Campylobacter spp. Les espèces impliquées dans les maladies digestives chez le chien et le chat sont : Campylobacter jejuni, Camylobacter coli, Campylobacter upsaliensis et Campylobacter helveticus. Toutes ces campylobactéries ont été isolées à partir de selles de chats et chiens cliniquement sains et ceux atteints de diarrhée, dans toutes les études citées ci-dessous. L‟espèce de campylobactérie la plus retrouvée dans les selles des chiens et chats domestiques est Campylobacter upsaliensis. C‟est la principale campylobactérie colonisatrice du tractus intestinal des chiens et des chats et isolée à partir des selles (Parsons et al., 2010 ; Baker et al., 1999 ; Bender et al., 2005 ; Hald et al., 2004 ; Koene et al., 2004 ; Sandberg et al., 2002 ; Wieland et al., 2005 ; Shen et al., 2001 ; Burnens et al., 1992). La prévalence de Campylobacter upsaliensis chez le chien et le chat serait supérieure à celle de Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. Un petit nombre d‟études (Hald and Madsen, 1997 ; Fox et al., 1989) donnent des résultats inverses. Ces discordances résulteraient des progrès effectués dans les techniques d‟isolement des campylobactéries dans les études récentes, surtout vis-àvis de Campylobacter upsaliensis. Campylobacter coli est quant à lui retrouvé dans de très faibles proportions chez le chien : 0.7 % (Hald et al., 2004), 2% (Baker et al., 1999) et 5% (Hald and Madsen, 1997) et chez le chat : 0.6% (Sandberg et al., 2002). En ce qui concerne Campylobacter helveticus, il serait davantage présent chez le chat que chez le chien. Les fréquences d‟isolement chez le chat pour cette espèce sont supérieurs à ceux des chiens (Wieland et al., 2005 ; Rossi et al., 2008 ; Moser et al., 2001). Ils varient de 16.7% (Rossi et al., 2008) à 83% (Shen et al., 2001). A l‟inverse les chiens sont colonisés de manière prédominante par Campylobacter upsaliensis. Cependant, les données épidémiologiques concernant Campylobacter helveticus sont encore insuffisantes car elle n‟est pas encore systématiquement recherchée dans les études et son identification est difficile. Elle est aussi plus souvent isolée à partir de selles de chats sains que de chats atteints de diarrhée. Selon certaines études, de manière générale, les chiens seraient plus souvent porteurs de campylobactéries toutes espèces confondues, avec des taux de portage plus élevés par rapport aux chats (Rossi et al., 2008 ; Baker et al., 1999 ; Hald and Madsen, 1997 ; Burnens et al., 1992). D‟autres auteurs rapportent des taux similaires entre les chiens et les chats (Wieland et al., 2005 ; Sandberg et al., 2002 ; Lopez et al., 2002 ; Moser et al., 2001). Ces taux varient en fonction du pays où a eu lieu l‟étude et donc de la population canine ou féline prise en compte. Certains facteurs de risque ont été clairement associés à une excrétion fécale plus importante des campylobactéries et à des fréquences d‟isolement plus élevées. L‟âge est considéré comme un facteur de risque vis-à-vis du portage fécal de campylobactéries. Wieland et al. ont montré que les fréquences d‟isolement de Campylobacter upsaliensis dans les selles sont plus élevées chez les individus de moins d‟un an (67,6% et 51,4% respectivement). Il en est de même pour l‟étude de Moser et al. avec une fréquence d‟isolement chez les chiens de moins d‟un an pour Campylobacter spp. de 75% contre 32,7% pour les chiens adultes. Plusieurs autres études rapportent également que les individus de moins d‟un an ont plus de chances d‟être porteurs de campylobactéries (Torre 30 and Tello, 1993 ; Moser et al., 2001 ; Sandberg et al. 2002 ; Lopez et al., 2002 ; Hald et al., 2004 ; Bender et al. 2005 ; Acke et al., 2006 ; Parsons et al., 2010). Une étude épidémiologique prospective menée au Danemark (Hald et al., 2004) a révélé que 60 % des chiots de 3 mois étaient porteurs de Campylobacter. A un an 100% étaient porteurs excréteurs de Campylobacter, avec une excrétion intermittente. A deux ans, 67% restaient porteurs. Ce n‟est qu‟après cette limite que la fréquence d‟isolement de la bactérie à partir des selles diminue. Le mode de vie des animaux, c‟est-à-dire s‟ils vivent ou ont séjourné pendant une longue période dans un environnement de forte densité, en cohabitation avec d‟autres animaux domestiques sur une longue période (chenils, animaleries, chatteries), est également un facteur de risque. Dans les études d‟Acke et al. (2006) ; de Baker et al. (1999) et de Torre and Tello (1993), les chiens et chats venant de refuges, de chenils ou d‟animaleries représentent une catégorie à risque concernant les fréquences d‟isolement des campylobactéries à partir des selles (jusqu‟à 87% de chiens de chenil positifs à la coproculture). En effet, les chiens ou chats vivant dans un tel contexte ont une exposition plus importante aux fèces des autres animaux, les contacts sont plus étroits, les risques de contamination inter et intra-espèces sont ainsi augmentés. Hald et al. ont également trouvé une corrélation positive entre les chiens vivant en ville et une infection à Campylobacter spp. En ville, les densités des populations canines et félines sont plus importantes et les contacts avec les selles d‟autres congénères sont augmentés. Dans l‟étude de Wieland et al. les chats ayant régulièrement accès à l‟extérieur et n‟utilisant pas régulièrement leur litière sont aussi une catégorie à risque. Pour établir un lien entre la présence de diarrhée chez l‟animal et le fait d‟isoler une campylobactérie dans les selles, plusieurs études ont comparé les fréquences d‟isolement à partir des selles entre animaux asymptomatiques et ceux atteints de diarrhée. Ceci permettrait de donner une signification clinique à la bactérie lorsqu‟elle est isolée des selles. Les résultats diffèrent selon les études mais il y a une nette tendance à ne trouver aucune corrélation entre le statut clinique de l‟animal (présence de diarrhée) et la présence de la bactérie dans les selles (Parsons et al., 2010 ; Koene et al., 2009 ; Rossi et al., 2008 ; Bender et al., 2005 ; Hald et al., 2004 ; Acke et al., 2006 ; Sandberg et al., 2002 ; Lopez et al., 2002 ; Moser et al., 2001 ; Baker et al., 1999 ; Olson and Sandstedt, 1987 ; Hosie et al., 1979). En effet, les auteurs retrouvent autant de chiens et/ou chats asymptomatiques porteurs de campylobactéries que d‟animaux atteints de diarrhée chez lesquels on isole des campylobactéries. On peut citer pour exemple l‟étude de Sandberg et al. qui retrouvent des fréquences d‟isolement de Campylobacter spp. chez des chiens sans diarrhée de 23% et chez des chiens avec diarrhée de 27%. Chez les chats sains, ils trouvent une fréquence de 18% alors que chez les chats avec diarrhée cette fréquence n‟est que de 16%. Cependant, Burnens et al. rapportent une association significative entre la présence de diarrhée et l‟excrétion fécale de campylobactéries, mais uniquement chez les chiens de moins d‟un an. Quarante quatre pour cents des jeunes chiens présentant de la diarrhée excrètent soit Campylobacter upsaliensis, soit Campylobacter jejuni dans leurs selles, ce qui représente deux fois plus que la fréquence d‟isolement de ces campylobactéries chez des jeunes chiens asymptomatiques (21%). Cette 31 association significative entre l‟infection et les signes cliniques n‟a pas été retrouvée chez les chats quelque soit l‟âge, ni chez les chiens supérieur de plus d‟un an. Les fréquences d‟isolement de Campylobacter spp. dans les selles des chiens et chats varient beaucoup d‟une étude à l‟autre. Chez le chien asymptomatique les fréquences d‟isolement données par différentes études sont : 23% (Sandberg et al., 2002) ; 24,1% (Olson and Sandsted, 1987) ; 26% (Torre and Tello, 1993) et 41,2 % (Wieland et al., 2005). Chez les chiens asymptomatiques et ceux atteints de diarrhée regroupés, les fréquences d‟isolement de Campylobacter spp. vont de 35 % (Burnens et al., 1992) à 77% (Koene et al., 2004). Chez le chat asymptomatique les fréquences d‟isolement vont de 18% (Sandberg et al., 2002) à 92% (Shen et al., 2001). Chez les chats asymptomatiques et ceux atteints de diarrhée confondus ils vont de : 5% (Hald and Madsen, 1997) à 47.8% (Moser et al., 2001). Ces variations peuvent s‟expliquer par les différences de populations étudiées, les différentes techniques d‟isolement utilisées (certaines étant plus adaptées à certaines espèces bactériennes que d‟autres) et par les découvertes de nouvelles espèces de campylobactéries au fil des années (notamment Campylobacter upsaliensis et helveticus). Ainsi les fréquences d‟isolement de l‟espèce Campylobacter spp. à partir des selles de chiens et de chats varient en fonction de leur âge, de l‟espèce de campylobactérie, de la technique d‟isolement utilisée, des conditions de vie (habitat et environnement) de l‟animal, de le présence ou non d‟autres affections digestives intercurrentes ou d‟autres organismes entéropathogènes. Les jeunes animaux (âgés de 6 mois à un an), les animaux vivant dans un contexte de forte densité ou cohabitant avec de nombreux autres congénères (chenils, chatteries, refuges…) ont des fréquences d‟isolement beaucoup plus élevés. De manière générale, les fréquences d‟isolement en Europe restent dans une fourchette assez élevée, faisant des chiens et chats domestiques des réservoirs potentiels de campylobactéries pathogènes pour l‟homme (Campylobacter jejuni et upsaliensis) et suggèrent également que ce genre bactérien pourrait être commensal chez le chien et le chat (Parsons et al., 2010). 32 3. Salmonella spp. Les informations concernant la prévalence des salmonelles dans les selles des chiens et des chats, notamment celles renseignant sur le statut de porteur asymptomatique, sont très importantes dans le domaine de la santé publique car la salmonellose est une zoonose. De plus, les animaux domestiques sont en général en contact étroit avec leur propriétaire, ce qui facilite la transmission de salmonelles de l‟animal vers l‟homme. Les études concernant Salmonella spp. révèlent des fréquences d‟isolement assez faibles parmi la population canine. Celles-ci sont similaires entre les différents pays où ont lieu ces études : 1% en Turquie (Bagcigil et al., 2007), 0.01% au Japon (Fukata et al., 2002), inférieur à 0.6% (Schotte et al., 2007) en Allemagne dans un chenil militaire, 3.6% à Trinidad (Seepersadsingh et al., 2004), 1,2% en Californie (Cave et al., 2002), 2,3% au Colorado (Hackett and Lappin, 2003) et 2.1% à Taïwan (Tsai et al., 2007). Les légères différences observées peuvent s‟expliquer par les situations géographiques, les méthodes d‟isolement employées, les stratégies d‟échantillonnage qui sont différentes d‟une étude à l‟autre. En moyenne, les fréquences d‟isolement des salmonelles dans les selles de chiens adultes asymptomatiques varient de 0 à 2% et chez les chiens diarrhéiques de 0 à 1 % (Marks and Kather, 2003). Chez les chats asymptomatiques les fréquences d‟isolement varient de 1 à 18% (Greene, 2006 ; Hill et al., 2002). Il a été démontré dans plusieurs études que le fait de nourrir des chiens à base d‟aliments crus augmente le risque d‟héberger et d‟excréter des salmonelles dans leurs selles. Une étude a évalué le risque d‟infection salmonellique chez des chiens nourris à base de viande de poulet crue (Joffe and Schlesinger, 2002). La présence de Salmonella spp. dans les aliments crus a été évaluée et 80% des échantillons de nourriture contenaient des salmonelles. Trente pour cents des chiens (asymptomatiques) qui en mangeaient excrétaient des salmonelles dans leurs selles (avaient des coprocultures positives pour Salmonella spp.). Dans une autre étude, des chiens de laboratoire de race Beagle ont été nourris avec un régime alimentaire composé d‟aliments crus contaminés expérimentalement par des salmonelles (Finley et al, 2007). Ces chiens avaient 11,4 fois plus de risque d‟excréter des salmonelles dans leurs fèces. Quarante quatre pour cents des chiens nourris avec ce régime particulier ont excrété des salmonelles 1 à 7 jours après le repas infecté, sans aucun signe de maladie, alors qu‟aucun des chiens du groupe témoin n‟a excrété de salmonelles dans ses selles. La plupart des chiens excrétaient les mêmes sérovars que ceux qui étaient présents dans l‟alimentation contaminée. Cette étude a ainsi montré que l‟excrétion fécale asymptomatique peut survenir sur une durée de presque deux semaines et très rapidement, après la consommation d‟un seul repas contaminé. Enfin, une dernière étude chez des chiens a révélé que tous ceux qui avaient un résultat de coproculture positif pour Salmonella spp. à de multiples occasions étaient des consommateurs réguliers de viande crue (Lefebvre S.L. et al., 2007). Les fréquences d‟isolement des salmonelles dans les selles variaient de 2,5 à 25% chez les chiens consommateurs de viande crue alors qu‟elle variait de 0 à 2,6% chez les chiens qui n‟en consommaient pas. Ces chiens nourris à base de viande ou aliments crus sont une source de contamination environnementale via leurs fèces et augmentent aussi le risque de salmonellose chez leurs propriétaires et leurs congénères sains. Leonard et al., 2010 ont étudié plusieurs 33 facteurs de risques potentiels et leur association à l‟excrétion fécale asymptomatique de salmonelles chez des chiens domestiques au Canada. Le plus important était d‟administrer des repas quotidiens à base d‟aliments crus ou des rations ménagères cuites préparées à la maison. Environ quarante quatre pour cents des chiens qui hébergeaient des salmonelles dans leurs selles étaient nourris avec des aliments crus. Par ailleurs la fréquence d‟isolement des salmonelles chez les chiens domestiques dans cette étude était de 23% ce qui est supérieur à la moyenne des données des autres études. Ce chiffre reflète la différence de régime alimentaire entre les populations étudiées et dans l‟étude de Leonard et al., 2010, la majorité des chiens échantillonnés étaient nourris avec des aliments non cuits. La pratique de nourrir son animal domestique à base d‟aliments crus redevient populaire. Les régimes alimentaires à base d‟os et d‟aliments crus sont soit des rations ménagères préparés par le propriétaire lui-même soit des préparations commercialisées déjà préparées et congelées. Bien qu‟il n‟ait jamais été prouvé scientifiquement que ce type d‟alimentation soit plus bénéfique à la santé des animaux domestiques, certains propriétaires choisissent toutefois cette option et augmentent ainsi les risques d‟excrétion fécale de salmonelles par leur animal domestique. Ainsi, si on considère des populations canines très particulières telles que les chiens à haute performance comme les chiens de course de traîneau ou les chiens de race Greyhound spécialisés dans la course, les fréquences d‟isolement sont plus élevées. En effet, ces chiens nécessitent dans leur alimentation une part importante de protéines principalement constituées de viande crue. Les pourcentages de chiens hébergeant des salmonelles dans leurs selles sont plus élevés et reflètent ainsi les habitudes alimentaires de ces catégories d‟individus. Dans une étude évaluant fréquence d‟isolement dans les selles chez les chiens de traîneau, 69% des chiens asymptomatiques avaient un résultat de coproculture positif pour Salmonella spp. (Canton et al., 1997). De plus, en comparant les fréquences d‟isolement entre chiens atteint de diarrhée et non atteint de diarrhée, aucune différence significative n‟a été constatée (63% et 57% respectivement). Dans un élevage de chiens de course de race Greyhound nourris à base de viande crue la fréquence d‟isolement est très élevée soit 93% (Morley et al., 2006). Il a été prouvé dans cette étude que la source primaire de contamination de l‟élevage était bien la viande crue donnée aux chiens de course. Cette fréquence (93%), très élevée, suggère que la pratique de nourrir les chiens domestiques à base de viande crue est un facteur de risque pour les infections salmonelliques chez le chien mais aussi un risque indirect pour la santé de l‟homme au contact de ces chiens. D‟autres catégories de populations canines ont des fréquences d‟isolement plus élevées (Carter and Quinn, 2000 ; Ketaren et al., 1981 ; Ettinger and Feldman, 2005). Les chiens vivants en chenils (16%), les chiens errants (16 à 23%), les chiens de ferme (4,3%), les chiens hospitalisés (4 à 20%) ont en général des taux plus élevés que les chiens domestiques de particuliers car leur exposition aux sources de salmonelles est plus élevée (Carter and Quinn, 2000). Une étude comparant les fréquences d‟isolement des salmonelles entre des chiens domestiques et errants a trouvé une différence significative entre les deux valeurs, 2,1% contre 6,3 % (Tsai et al., 2007). 34 Les salmonelloses cliniques et leur manifestation sous forme de diarrhée chez les chiens et les chats sont très rares. Les cas rapportés chez les chiens sont sporadiques et la plupart des infections sont asymptomatiques (Marks and Kather, 2003). Seules quelques épidémies à salmonelles chez le chien ont été rapportés soit dans des cliniques vétérinaires (Cherry et al., 2004 ; CDC, 2001 ; Wright et al., 2005 ; Ketaren et al., 1981 ), soit dans des chenils (Schotte et al., 2007 ; Morley et al., 2006). Chez le chat, il a été rapporté une salmonellose clinique (gastroentérite et septicémie) chez deux chats nourris avec une ration ménagère à base de viande de bœuf crue (Stiver et al., 2003). Chez un des deux chats les mêmes sérotypes ont été isolés dans l‟alimentation et à partir du contenu intestinal. Une épidémie chez des chats domestiques a aussi été rapportée suite à une contamination par ingestion d‟oiseaux sauvages infectés (Tauni and Österlund , 2000). En conclusion, les infections asymptomatiques ou le portage fécal de salmonelles chez le chien et le chat ont des fréquences très faibles chez les chiens de particulier mais peuvent devenir élevées selon le mode et le lieu de vie de l‟animal (chien de course, chiens errants, habitudes alimentaires…). Les fréquences d‟isolement faibles peuvent s‟expliquer probablement par l‟augmentation du nombre d‟animaux domestiques nourris à base d‟alimentation industrielle et donc ayant subi des traitements thermiques adéquats. 35 4. Escherichia coli Escherichia coli est la principale bactérie de la flore intestinale commensale anaérobie facultative de la plupart des espèces animales. Cependant il existe certaines catégories d’Escherichia coli pathogènes (pathotypes), capables de causer des infections intestinales et d‟induire une diarrhée. Chaque pathotype est défini par un jeu de facteurs de virulence qui lui est propre (toxines, facteurs de colonisation -adhésines-,…) et induisent une diarrhée par des mécanismes pathogéniques différents. Les trois pathotypes retrouvés et étudiés chez le chien et le chat sont les Escherichia coli entérotoxinogènes (ECET), les Escherichia coli entéropathogènes (ECEP) et les Escherichia coli vérotoxinogènes ou productrices de Shigatoxine (ECVT ou ECST). Escherichia coli entérotoxinogènes Alors que les ECET sont des agents bien connus de diarrhée sécrétoire chez l‟homme, les bovins et les porcins, leur rôle exact dans la diarrhée canine est beaucoup moins bien défini (Holland et al., 1999). Elles produisent deux types de toxines : les toxines thermolabile et thermostable, responsables de l‟apparition de la diarrhée en induisant une hypersécrétion de fluides dans la lumière intestinale. Bien que certaines études aient découvert des ECET dans les fèces de chiens sains (Holland et al., 1999 ; Staats et al., 2003) et de ceux atteints de diarrhée, peu de données sont disponibles pour quantifier l‟importance de ces germes et démontrer leur rôle inducteur de diarrhée chez le chien. Les diarrhées associées aux souches ECET sont plus fréquentes chez les chiots et jeunes adultes (Staats et al., 2003 ; Drolet et al., 1994), surtout chez ceux élevés en chenils ou animaleries. On retrouve majoritairement chez le chien des souches productrices de toxines thermostables. Wasteson et al. (1988) ont isolé chez quatre chiens souffrant de diarrhée des Escherichia coli productrices de toxines thermostables, aucune ne produisait la toxine thermolabile. Les gènes codant pour les toxines ainsi que les toxines elles-mêmes ont été mises en évidence. Hammermueller et al. (1995) ont associé de manière significative la présence de la diarrhée à la présence de souches productrices de toxines thermostables. Elles ont été retrouvées chez 31% des animaux atteints de diarrhée alors qu‟aucune d‟entre elles n‟a été retrouvée chez des chiens apparemment sains. En revanche, dans une autre étude, on a isolé, à partir des selles, des Escherichia coli possédant le gène codant pour la toxine thermostable (sta) chez 81 % des jeunes chiens sains (Holland et al., 1999). La plupart des souches exprimaient le gène et produisaient la toxine correspondante. Enfin, dans une étude récente, les ECET avaient une faible prévalence chez des Greyhounds (sains et présentant de la diarrhée confondus), avec le gène codant pour la toxine thermostable présent chez 3% des chiens sains et 2% des chiens diarrhéiques (Staats et al., 2003). Par ailleurs, c‟est la seule étude rapportant la présence d’Escherichia coli productrice de toxine thermolabile (retrouvée chez 2,6% des chiens sains et 5 % des chiens souffrant de diarrhée). La véritable incidence des ECET dans la diarrhée canine n‟est pas encore totalement déterminée avec des fréquences d‟isolement parmi les chiens diarrhéiques allant de 0% (Turk et al., 1998) à 31% (Hammermueller et al., 1995). 36 Très peu d‟études rapportent la présence d‟Escherichia coli entérotoxinogènes aussi bien chez les chats sains que chez les chats souffrant de diarrhée (Willard and Marks, 2006). Les ECET ne sont pas des germes entéropathogènes majeurs chez le chat. Escherichia coli entéropathogènes Elles ne produisent pas d‟entérotoxines ni de vérotoxines (shiga-toxines) et ne sont pas entéroinvasives. Elles provoquent des lésions dites d‟ « attachement-effacement » au niveau des microvillosités intestinales. C‟est la présence du gène eae (Escherichia coli attaching effacing) qui est nécessaire pour induire ces lésions et est donc recherché comme facteur de virulence. Il est situé sur un îlot de virulence appelé LEE (Locus of Enterocyte Effacement). Un autre facteur de virulence recherché est le gène bfpA codant pour un fimbriae (BFP OU Bundle Forming Pili) impliqué dans les premières phases de l‟adhésion mais non nécessaire pour induire les lésions d‟ « attachement-effacement ». Les Escherichia coli qui provoquent de telles lésions sont aussi appelées « Escherichia coli attachants-effaçants » (ECAA). Les ECEP seraient, selon certaines études, une des causes de diarrhée à envisager lors de diarrhée du jeune chien. Dans une étude, douze cas sur treize de colibacillose intestinale étaient dus à des ECAA, toutes possédant le gène eae (Drolet et al., 1994). La plupart des chiots concernés provenaient de chenil ou d‟animalerie. Deux autres études décrivent des lésions typiques d‟attachement-effacement chez des chiots associées à une infection à ECEP (Janke et al., 1989 ; Broes et al., 1987). Dans l‟étude de Janke et al., les ECEP étaient les seuls pathogènes retrouvés suggérant le rôle pathogène primaire de ce pathotype. En revanche, dans celle de Broes et al. le chiot souffrant de diarrhée était aussi atteint d‟autres infections intestinales concomitantes (giardiose, coccidiose), le rôle spécifique de ce type d‟Escherichia coli dans la pathogénie de la diarrhée n‟a donc pas pu être démontré. Dans une étude récente, sur 122 cas de chiens souffrant de diarrhée au moment de la mort (Turk et al., 1998), 44 (36 %) d‟entre eux possédaient des Escherichia coli entéropathogènes qui avaient le gène eae. Aucun des isolats ne produisait d‟entérotoxines ni de shiga-toxines. Des lésions histologiques typiques ont été retrouvées chez 45% de ces chiens et Escherichia coli était le seul entéropathogène isolé dans 34% des cas. Dans les autres cas (66%), des parvovirus, Clostridium perfringens, des coccidies,…ont été également isolés, faisant conclure à un rôle soit pathogène primaire soit secondaire d‟Escherichia coli dans l‟apparition de la diarrhée. Les ECEP sont aussi isolées chez les chiens sains (Nakazato et al., 2004). Parmi les isolats d‟Escherichia coli retrouvés dans les selles des chiens de l‟étude de Nakazato et al. 12,3% étaient entéropathogènes. Ces souches ont été mises en évidence par la détection par PCR du gène eae à partir des isolats cultivés à partir des selles. Treize pour cents de ces isolats provenaient des chiens souffrant de diarrhée et 8,3 % provenaient de chiens sains. Cette différence entre les taux d‟isolement n‟était pas significative. Une autre étude a caractérisé les souches d‟Escherichia coli isolées à partir des selles chez des chiots de cinq mois en bonne santé et vivant en chenil (Holland et al., 1999). Sur les cinquante deux chiens de l‟étude 82,7% portaient des Escherichia coli dans leurs selles dont 28% étaient entéropathogènes (possession du gène eae). 37 Les ECEP ont également été isolées chez des chats atteints de diarrhée (Pospischil et al., 1987 ; Goffaux et al., 2000). Elles ont été isolées du contenu intestinal de chats souffrant de diarrhée et d‟anorexie (Pospischil et al., 1987) . Les chats présentaient aussi des lésions typiques d‟attachement-effacement à l‟autopsie. Les ECEP sont aussi retrouvés chez les chats sains (Morato et al., 2009). On a isolé des souches eae + chez 4,7% des chats (13 sains et 1 seul présentant de la diarrhée) dans cette étude menée au Brésil. Une faible proportion de chats excrétait des ECEP dans cette étude et la plupart des souches eae + provenaient de chats sains. Ainsi, d‟après les différentes études citées, les ECEP seraient plus fréquentes chez le chien. Elles seraient aussi moins virulentes chez le chat. Même si elles ont parfois été associées à la maladie dans certaines études, leur rôle en tant que pathogène strict n‟est pas encore vraiment prouvé. Escherichia coli vérotoxinogènes Les Escherichia coli vérotoxinogènes (ECVT) induisent également des lésions typiques d‟ « attachement-effacement » au niveau des microvillosités intestinales mais produisent aussi des cytotoxines appelées vérotoxines ou Shiga toxines. On distingue deux variants antigéniques de la vérotoxine : VT I et VT II. Les gènes codant pour ces cytotoxines (stx1 et stx2) ainsi que les cytotoxines elles-mêmes sont recherchés en tant que facteurs de virulence pour caractériser ce pathotype. Les ECVT sont plutôt retrouvés en grande majorité chez les ruminants et de manière sporadique chez les chiens et chats domestiques (Beutin et al., 1993). Quelques études ont été menées chez le chat pour ce pathotype. Les ECVT ont été isolées à partir de selles de chats sains (Abaas et al., 1989 ; Beutin et al., 1993). Les prévalences des infections à ECVT dans ces études étaient de 12 % et 13,8% respectivement chez des chats apparemment sains. Pour d‟autres études, les ECVT semblent jouer un rôle entéropathogène strict. Dans celle d‟Abaas et al. (1989), les isolats d‟Escherichia coli chez les chats souffrant de diarrhée produisent plus fréquemment des vérotoxines et à des titres plus élevés que ceux des chats sains. Quatre-vingt quinze pour cents des souches isolées chez les chats atteints de diarrhée produisaient des vérotoxines contre 40% des souches isolées des chats sains. Cette étude était la première qui suggérait un rôle entéropathogène des ECVT chez le chat. En revanche d‟autres études qui ont suivi n‟ont trouvé aucune association significative entre une infection à ECVT et une diarrhée (Smith et al., 1998). La prévalence des infections entériques causée par ECVT était de 12,3% dans cette étude (chats sains et atteints de diarrhée confondus) avec 11 chats sains et 11 souffrant de diarrhée. Comme nous l‟avons vu pour les ECEP, le rôle des ECVT en tant qu‟entéropathogène strict n‟est pas encore clairement prouvé et établi. D‟autres études plus récentes ont associé la présence à la fois des gènes stx et des vérotoxines à la présence de la diarrhée chez le chien (Staats et al., 2003 ; Hammermueller et al., 1995). Staats et al. ont trouvé une corrélation significative entre la détection du gène stx 1 et de la vérotoxine correspondante à la diarrhée chez le chien. Le gène stx 1 était présent chez 38 3 % des animaux sains contre 15 % des animaux souffrant de diarrhée. Les vérotoxines (I et II confondues) étaient présentes chez 48% des chiens atteints de diarrhée contre 25% des chiens sains. Hammermueller et al. (1995) trouvent quant à eux une association significative entre la vérotoxine II (VT II) et la diarrhée canine. Il a été possible de mettre en évidence le gène codant pour VT II ainsi que la toxine chez 22% des chiens atteints de diarrhée alors qu‟ils n‟ont pas été identifiés dans les selles provenant d‟animaux cliniquement sains. Le gène codant pour la vérotoxine I a été mis en évidence chez 8,9% des chiens avec de la diarrhée et chez 12,3% des chiens normaux. Les chiens semblent également pouvoir être porteurs asymptomatiques d‟Escherichia coli producteurs de VT I ou de VT II (Hammermueller et al., 1995 ; Staats et al., 2003) vu que l‟on met en évidence les gènes codant pour les toxines et les toxines associées dans les fèces d‟animaux cliniquement sains. Aucune étude n‟établit l‟âge ou certains mode de vie comme facteurs de risque vis-àvis d‟une infection à ECVT chez le chien ni le chat domestique. Les trois pathotypes d‟Escherichia coli évoqués peuvent se retrouver aussi bien chez le chien ou le chat cliniquement sains que chez le chien ou le chat souffrant de diarrhée. L‟importance des diarrhées due à Escherichia coli n‟est pas encore clairement définie car il existe encore peu d‟études à ce sujet. Le rôle pathogène strict et l‟importance de ces bactéries comme cause de diarrhée chez le chien et le chat ne sont donc pas encore très bien connu (Leib and Steiner, 2008, b ; Guilford and Strombeck, 1996, a). Le chien semble davantage atteint par des infections entériques à Escherichia coli que le chat mais les études épidémiologiques concernant la diarrhée due à Escherichia coli sont encore moins nombreuses chez le chat que chez le chien et des études complémentaires sont donc nécessaires. Il est également difficile de déterminer le rôle pathogène primaire des Escherichia coli parce que les fréquences d‟isolement des souches potentiellement pathogènes sont similaires entre les chiens sains et ceux atteints de diarrhée et parce qu’Escherichia coli fait partie de la flore endogène intestinale (Marks and Kather, 2003). De plus, des infections intestinales intercurrentes (clostridiose, coccidiose, parvovirose…) compliquent la compréhension du rôle pathogène d‟Escherichia coli dans la diarrhée canine. 39 CONCLUSION : D‟après les nombreuses études épidémiologiques (Hill et al., 2000 ; Hackett, 2003 ; Cave et al., 2002 ; Marks and Kather, 2003) concernant les prévalence des diarrhées associées aux bactéries entéropathogènes chez le chien et le chat, celles des Salmonella spp. et Escherichia coli entérotoxinogènes, entéropathogènes ou vérotoxinogènes ne sont pas significativement importantes. En revanche, les bactéries entéropathogènes les plus retrouvées dans les selles (qu‟il s‟agisse ou non d‟animaux souffrant de diarrhée) sont les Campylobacter spp. (les espèces upsaliensis et helveticus) et Clostridium spp.. 40 C. Incidence clinique des bactéries entéropathogènes chez le chien et le chat Nous allons nous intéresser ici aux bactéries entéropathogènes spécifiques du chien et du chat. J‟ai choisi ici de ne parler que de celles qui sont les plus fréquemment rencontrées et les plus étudiées. Ainsi nous aborderons les germes du genre Clostridium, Campylobacter, Salmonella et la bactérie Escherichia coli ainsi que le pouvoir pathogène de chacun dans la sphère digestive. De plus, ces bactéries ont un intérêt en santé publique car certaines ont un potentiel zoonotique. 1. Clostridium spp. Certaines clostridies font partie de la flore microbienne physiologique intestinale. Cependant, Clostridium perfringens type A et Clostridium difficile peuvent être des agents de maladies gastro-intestinales chez le chien et le chat. a) Clostridium perfringens i. Etiologie et épidémiologie Clostridium perfringens est un bacille à Gram positif, sporulé, anaérobie strict, immobile et capsulé. Les spores sont couramment observées dans les selles mais rarement en culture. C‟est un hôte commensal du côlon du chien et du chat et participe ainsi à l‟écologie microbienne du gros intestin (Ettinger and Feldman, 2005). C‟est également un germe saprophyte largement répandu dans l‟environnement où on le rencontre dans le sol, l‟eau, l‟air, les produits alimentaires (viandes, légumes, conserves,…). Il est pathogène pour l‟homme, bien connu comme agent de gangrènes gazeuses. Il est reconnu comme agent potentiel d‟entérotoxémie chez presque tous les mammifères (bovins, ovins, caprins, équins, porcins et volailles notamment) (Songer, 1996). Il peut aussi être l‟agent de mammites, d‟hépatites nécrosantes… chez les animaux de rente essentiellement. Clostridium perfringens produit de nombreux facteurs de virulence dont des toxines, très importantes dans la pathogénie des infections clostridiennes. On distingue au sein de cette espèce cinq toxinotypes (A à E, caractérisé par une association de toxines qui lui est propre) en fonction de la production de quatre toxines majeures : α, β, ε, ζ, de sept toxines mineures : θ, κ, λ, μ, ν, sialidase et d‟une entérotoxine A (appelée Clostridium perfringens enterotoxin ou CPE). Les cinq toxinotypes possèdent le gène codant pour l‟entérotoxine A (gène cpe) et peuvent donc produire la toxine associée, mais ce sont les souches du type A qui l‟expriment le plus souvent. Chaque toxine possède une activité différente et à chaque toxinotype correspond une maladie spécifique (Songer, 1996). La figure 2 montre quelles sont les toxines associées à chaque toxinotype de Clostridium perfringens. Certaines toxines (α, β, ε et ζ), surtout chez les animaux de rente, peuvent traverser la barrière intestinale et être à l‟origine d‟une maladie systémique (entérotoxémie) pouvant entraîner une mort brutale. Les souches entérotoxinogènes uniquement productrices de l‟entérotoxine A n‟ont en revanche 41 qu‟une action locale sur l‟épithélium intestinal (Twedt, 1997). Ce sont ces souches qui sont responsables d‟intoxication alimentaire chez l‟homme, mais aussi de diarrhées sporadiques ou de diarrhées associées à l‟administration d‟antibiotiques. Chez le chien et le chat, Clostridium perfringens entérotoxinogène a été associé à des diarrhées aiguës nosocomiales (Kruth et al., 1989), des entérites hémorragiques nécrosantes (Kruth et al., 1989 ; Sasaki et al. 1999) et des diarrhées chroniques du gros intestin (Weese et al. 2001). En revanche, les entérotoxémies sont plutôt rares chez les carnivores domestiques (Sasaki et al.1999). Ce sont les souches du type A que l‟on retrouve le plus fréquemment dans le tractus intestinal des animaux à sang chaud ainsi que dans l‟environnement (Songer, 1996). Chez le chien, c‟est également le type rencontré dans la quasi-totalité des infections digestives (Marks and Kather, 2006). Les entérotoxicoses à Clostridium perfringens sont plus fréquentes chez le chien et surviennent occasionnellement chez le chat (Leib, 2008, a). Toxinotype Toxines majeures α β ε Entérotoxine A ζ A + +/B + + + +/C + + +/D + + +/E + + +/Figure 2 : Les différents toxinotypes de Clostridium perfringens (Marks and Kather, 2006) ii. Pathogénie (Twedt, 1997 ; Songer, 1996 ; Marks and Kather, 2006) Nous étudierons ici le mécanisme pathogénique d‟une infection clostridienne par une souche entérotoxinogène, donc productrice de l‟entérotoxine A (ou CPE). Ce sont ces souches qui sont la plupart du temps impliquées dans les infections digestives clostridiennes chez les carnivores domestiques. Il semblerait également que l‟entérotoxine A soit le principal facteur de virulence associé à l‟apparition de la diarrhée (Willard and Marks, 2006). Malgré les nombreuses études réalisées sur ce dernier, le mécanisme d‟apparition de la diarrhée associée aux souches entérotoxinogènes de Clostridium perfringens n‟est pas encore totalement élucidé. De plus c‟est un germe commensal et il est isolé des selles de chiens sains (Songer, 1996), ce qui complique davantage la compréhension du pouvoir pathogène. Tout d‟abord, il semblerait que certaines conditions doivent être réunies pour que la maladie apparaisse. Celle-ci surviendrait secondairement (Weese, 2001 ; Sasaki , 1999 ; Willard and Marks, 2006), après une rupture d‟équilibre de la flore commensale intestinale, c‟est-à-dire, soit après une antibiothérapie, soit un changement de régime alimentaire trop brutal, soit une maladie intestinale intercurrente… prédisposant à une prolifération et une sporulation massive des clostridies commensales entérotoxinogènes. Cette sporulation massive autorise ainsi la libération d‟une quantité importante d‟entérotoxine A. En effet, la toxine est libérée pendant la sporulation, lors de la lyse de la cellule mère végétative. C‟est un 42 polypeptide de 35 kDa ayant une action locale sur la muqueuse digestive, surtout jéjunoiléale. Une fois libérée dans la lumière intestinale, la toxine se lie aux protéines des jonctions serrées des entérocytes, formant un complexe protéique de 90 kDa, qui s‟insère ensuite au sein de leur membrane plasmique. Ce complexe protéique interagit à son tour avec d‟autres protéines membranaires, formant d‟autres complexes plus importants (un de 155 kDa et un autre de 200 kDa incluant l‟occludine des jonctions serrées). La toxine ne rentre jamais dans le cytoplasme cellulaire mais sa présence au sein de la membrane plasmique entérocytaire entraîne l‟altération de la structure et de la fonction des jonctions serrées. Ceci a pour conséquence une augmentation de la perméabilité cellulaire par formation de pores membranaires. S‟ensuit alors une fuite des ions intracellulaires (Na+ et Cl-), des acides aminés et des nucléotides vers la lumière intestinale. Au fur et à mesure que les pores s‟élargissent, on observe une perte de protéines de plus gros poids moléculaire et une inhibition de la synthèse macromoléculaire. Cette atteinte directe de la muqueuse intestinale provoque une hypersécrétion de fluide, de sodium et de chlore dans la lumière intestinale, une inhibition de la capture du glucose, une destruction des entérocytes et un ralentissement du péristaltisme. Une diarrhée sécrétoire profuse survient très rapidement. Le stimulus de départ provoquant la sporulation des formes végétatives n‟est pas connu. La bactérie a tendance à coloniser très rapidement l‟intestin grêle distal et la partie antérieure du côlon. Dans un modèle expérimental chez le lapin, l‟entérotoxine exerce son pouvoir cytotoxique de manière plus importante sur l‟iléon avec peu ou pas d‟effets sur le côlon. On ne sait pas si ce même phénomène survient chez le chien ou le chat. Des recherches approfondies sur le mécanisme d‟action de l‟entérotoxine dans ces espèces sont nécessaires sachant que l‟on rapporte le plus souvent une atteinte du côlon lors de diarrhée associée à Clostridium perfringens. Plusieurs auteurs (Marks et al., 2002 ; Weese et al., 2001 ; Kruth et al., 1989) se sont penchés sur la relation entre la diarrhée et la présence de l‟entérotoxine A dans les selles. Leurs études ont révélé une forte association entre l‟immunodétection de l‟entérotoxine dans les selles par la méthode ELISA avec la présence de la diarrhée. L‟entérotoxine a été isolée dans les selles de 34,4%, 28% et 41% de chiens souffrant de diarrhée. Ces études mettent en avant le rôle possible de Clostridium perfringens entérotoxinogène dans le développement de la diarrhée et l‟utilisation de tests immunologiques pour diagnostiquer une clostridiose digestive. Cependant l‟entérotoxine est retrouvée aussi dans les selles de chiens sains. Ceci peut s‟expliquer soit par des faux positifs, soit par la présence effective de l‟entérotoxine dans les selles mais à des niveaux trop bas pour engendrer des signes cliniques. En effet le test ELISA ne quantifie pas la toxine et Clostridium perfringens est un hôte commensal du côlon pouvant sporuler et donc libérer de petites quantités de toxines. D‟autres toxines clostridiennes peuvent intervenir dans le mécanisme pathogénique d‟apparition de la diarrhée mais leur mode d‟action est encore moins bien connu que celui de l‟entérotoxine A. La toxine alpha est une toxine hémolytique, létale et nécrosante. Elle possède une activité de phospholipase et de sphingomyélinase. Elle a été associée à des gastroentérites hémorragiques chez le chien (Songer, 1996). Une mort brutale est souvent observée lors de nécrose importante de la muqueuse digestive. Une seule étude (Thiede, 2001) 43 rapporte une infection à Clostridium perfringens dans laquelle la toxine β2 était impliquée. Vingt quatre échantillons (selles et contenu intestinal) provenant de chiens atteints de diarrhée ont été évalués : 32% ont un résultat de PCR positif pour la recherche du gène codant pour la toxine β2 (cpb2) et 16% sont positifs à la fois pour le gène de la toxine β2 et le gène de l‟entérotoxine A (cpe). C‟est pourquoi l‟isolement de souches non entérotoxinogènes (non productrices de CPE) à partir d‟échantillons de selles diarrhéiques n‟exclut pas leur implication dans la maladie. La toxine β2 pourrait donc jouer un rôle dans le développement de la diarrhée mais il n‟est pas encore connu. iii. Signes cliniques (Marks and Kather, 2006) Clostridium perfringens est caractérisé comme étant un germe pathogène du gros intestin avec des signes typiques de diarrhée du gros intestin : ténesme, présence de mucus et de sang non digéré dans les selles, augmentation de la fréquence de défécation… Des vomissements, une perte de poids ou une douleur abdominale peuvent être observés moins fréquemment. Il existe également des atteintes de l‟intestin grêle seul (diarrhée très aqueuse et en quantité très importante) ou des atteintes diffuses. Les diarrhées peuvent être chroniques ou aiguës. Lors de diarrhées chroniques les symptômes peuvent durer de plusieurs semaines à plusieurs mois (Twedt, 1997). La diarrhée est alors observée par intermittence. Dans les cas aigus, les symptômes durent en moyenne trois à cinq jours. Ils peuvent se résoudre d‟euxmêmes ou nécessiter une antibiothérapie. Une évolution vers la chronicité peut aussi avoir lieu. Les diarrhées aiguës nosocomiales surviennent lors d‟une hospitalisation de l‟animal ou après avoir séjourné dans un chenil. Les diarrhées à Clostridium perfringens doivent aussi être envisagées lors de diarrhée hémorragique sévère. b) Clostridium difficile i. Etiologie et épidémiologie Clostridium difficile est un bacille Gram positif, sporulé, anaérobie strict. Il était auparavant nommé « Bacillus difficile » car c‟était un germe difficile à cultiver. Il est reconnu comme étant l‟agent étiologique des colites pseudomembraneuses de l‟homme survenant suite à une antibiothérapie (clindamycine, pénicillines et céphalosporines principalement) mais aussi comme cause fréquente de diarrhée nosocomiale chez les patients humains hospitalisés (Marks and Kather, 2006). Clostridium difficile est aussi responsable de maladies gastrointestinales chez de nombreuses espèces animales (chevaux, porcs, animaux de laboratoire,…). La transmission de la bactérie se fait par voie oro-fécale, les spores étant très résistantes dans le milieu extérieur. Elles résistent aussi à la plupart des désinfectants usuels ce qui explique la forte prévalence de la bactérie en milieu hospitalier. La bactérie a été isolée de nombreuses sources telles que les sols, les milieux hospitaliers (humains et vétérinaires), les selles de patients humains non diarrhéiques, les chevaux, chiens, chats, oiseaux domestiques… (Songer, 1996). De nombreux réservoirs de Clostridium difficile existent donc, 44 qu‟ils soient endogènes (environnement). (portage asymptomatique de la bactérie) ou exogènes Clostridium difficile possède de nombreuses propriétés communes avec Clostridium perfringens et, comme ce dernier, peut faire partie de la flore endogène microbienne intestinale du chien et du chat. C‟est un germe entéropathogène très bien caractérisé chez l‟homme et les chevaux, chez lesquels les infections surviennent suite à une altération de la microflore endogène suivie d‟une colonisation et multiplication massive de souches toxinogènes. Le rôle entéropathogène de Clostridium difficile n‟est pourtant pas encore très bien défini chez les carnivores domestiques (Marks and Kather, 2006). Il peut être cultivé à partir de selles de chiens et chats sains mais aussi de selles de chiens et chats diarrhéiques. Il intervient également, comme Clostridium perfringens, dans les diarrhées nosocomiales (Leib, 2008, b ; Clooten et al., 2008). C‟est un germe que l‟on rencontre fréquemment dans l‟environnement hospitalier vétérinaire et dans les selles des animaux hospitalisés (Riley et al., 1991 ; Struble et al., 1994 ; Madewell et al., 1999). Contrairement à l‟homme où l‟antibiothérapie en milieu hospitalier est associée à l‟apparition d‟une diarrhée à Clostridium difficile, le phénomène n‟est pas prouvé chez le chien et le chat. L‟antibiothérapie ou tout traitement immunosuppresseur ne semblent pas être des facteurs de risques intervenant dans l‟apparition d‟une diarrhée associée à Clostridium difficile ou sur le portage fécal de souches toxinogènes pour certains auteurs (Struble et al., 1994, Marks et al., 2002 ; Weese et al., 2001). Les souches toxinogènes peuvent produire jusqu‟à cinq toxines mais seules deux d‟entres elles (la toxine A, entérotoxine et la toxine B, cytotoxine) ont été entièrement caractérisées. Ce sont également ces deux toxines qui sont associées à la clinique d‟une infection clostridienne. Les souches de Clostridium difficile ont été classées en souches toxinogènes et non toxinogènes sur la base de la production de ces deux toxines. On a toujours pensé que les souches toxinogènes produisaient simultanément les deux toxines. Cependant, quelques études ont rapporté des cas humains atteints par des souches variantes ne produisant qu‟une seule toxine (Marks and Kather, 2003). Aucune de ces souches variantes n‟ont été isolées chez le chien (Marks and Kather, 2006). ii. Pathogénie (Marks and Kather, 2006) Les toxines A et B sont les deux principaux facteurs de virulence impliqués dans la pathogénie des diarrhées associées à Clostridium difficile. La toxine A est une entérotoxine et la toxine B, une cytotoxine. Plusieurs études ont rapporté une association significative entre la présence de la diarrhée chez le chien et la détection par la méthode ELISA des toxines A et B (Weese et al., 2001 ; Marks et al., 2002). Les gènes codant pour les toxines ont été entièrement séquencés et ne sont retrouvés que chez les souches toxinogènes. Le mécanisme d‟action de ces deux toxines passe par l‟inactivation de la protéine Rho par glycosylation provoquant ainsi la dépolymérisation des filaments d‟actine, la désorganisation du cytosquelette, une vacuolisation cellulaire et enfin la 45 mort cellulaire. La diarrhée associée à l‟action des deux toxines de Clostridium difficile est une diarrhée par mécanisme d‟hypersécrétion. Les deux toxines agissent en synergie. Ce n‟est qu‟une fois que la toxine A a agi en provoquant des lésions de la muqueuse intestinale que la toxine B peut exercer son action cytotoxique. Expérimentalement, la toxine A introduite directement dans l‟intestin grêle de lapin, hamster ou de souris, induit une nécrose de la muqueuse intestinale ainsi qu‟une hypersécrétion hémorragique. La toxine B a en revanche une action cytotoxique sur les cellules in vitro. Les effets de ces deux toxines sont doses et espèces dépendantes. Certaines espèces animales sont plus sensibles à leurs effets cytopathiques. Aucune étude n‟a encore évalué la sensibilité de l‟épithélium intestinal des carnivores domestiques vis-à-vis de ces deux toxines. Une troisième toxine a été caractérisée dans les infections digestives clostridiennes de l‟homme et du cheval : l‟ADP-Ribosyltransférase CDT. C‟est une toxine binaire composée de deux parties protéiques indépendantes (CDTa ET CDTb). Elle catalyse, via sa partie enzymatique (CDTb), l‟ADP-ribosylation de l‟actine monomérique provoquant une altération du cytosquelette. Cependant son rôle exact dans les diarrhées équine et humaine n‟est pas encore totalement compris. Les souches de Clostridium difficile productrices de la toxine CDT n‟ont jamais été isolées chez le chien et le chat. iii. Signes cliniques Chez le chien, les symptômes peuvent être très variés. Ils vont d‟un portage asymptomatique à un syndrome digestif hémorragique aigu. Comme pour Clostridium perfringens il n‟y a pas de localisation anatomique précise de la diarrhée. Celle-ci peut aussi bien être du gros intestin, que de l‟intestin grêle ou mixte. Chez le chat, une infection digestive clostridienne peut se manifester par un épisode aigu d‟anorexie, d‟abattement et par une diarrhée aqueuse avec du mucus. Une étude a rapporté ces signes chez deux cas suspects de diarrhée à Clostridium difficile (Weese et al., 2001). L‟autre chat présentait de la fièvre, des vomissements et une douleur abdominale. 2. Campylobacter spp. a) Etiologie et épidémiologie Les Campylobacter sont des bacilles Gram négatifs, de forme incurvée ou spiralée. Ils sont très mobiles grâce à un flagelle polaire. Ce sont des bactéries microaérophiles ou microaérobies car leur culture s‟obtient dans une atmosphère à pression partielle en oxygène réduite (mélanges gazeux de Kiggins et Plastridge : 5% O2, 8 à 10 % CO2, 85%N2 ou de Skirrow et Benjamin : 1/3 d‟air et 2/3 d‟un mélange de CO2). Leur isolement nécessite des milieux complexes adaptés à leurs exigences nutritives (Acke et al., 2008). On distingue classiquement deux groupes d‟espèces de campylobactéries : - les espèces catalases positives : Campylobacter coli et Campylobacter jejuni 46 - les espèces catalases négatives ou faiblement positives : Campylobacter upsaliensis et helveticus Les campylobactéries sont des bactéries commensales du tractus gastro-intestinal des mammifères et des oiseaux (Joens, 2004 ; Ettinger and Feldman, 2005). Campylobacter jejuni et coli est présent en grand nombre dans le tractus intestinal des animaux de compagnie et des animaux de production (107UFC/g de contenu intestinal) (Joens, 2004). La majorité des espèces sont capables de survivre dans l‟environnement (eau, aliments crus). Toutes les espèces de Campylobacter peuvent être responsables d‟infection, soit chez l‟homme, soit chez l‟animal, ou très souvent à la fois chez l‟homme et l‟animal. Campylobacter jejuni est une cause fréquente de toxi-infection alimentaire chez l‟homme qui se contracte principalement par ingestion de viande crue ou mal cuite (surtout la viande de volaille), le germe étant transmis par contamination aux aliments par contaminations croisées dans les cuisines et ateliers de préparation. Quatre-vingt quinze pour cents des infections humaines sont dues à Campylobacter jejuni (Joens, 2004). La transmission de Campylobacter s‟effectue par voie oro-fécale par des aliments, de l‟eau ou du lait cru contaminé ou par contact direct avec des matières fécales d‟hommes ou d‟animaux infectés. Chez le chien et le chat les espèces de Campylobacter qui ont un intérêt en médecine vétérinaire sont surtout Campylobacter jejuni et Campylobacter upsaliensis et dans une moindre mesure Campylobacter coli. Les chiens et les chats peuvent héberger ces bactéries dans leur tractus digestif sans manifester aucun signe de maladie digestive, puisque ces bactéries peuvent être isolées des selles d‟individus cliniquement sains comme nous l‟avons vu dans la partie B. Le véritable rôle pathogène de ces bactéries est donc encore controversé et le diagnostic difficile, d‟autant plus qu‟une campylobactériose clinique chez l‟animal domestique est rare. b) Pathogénie Campylobacter est un agent entéro-invasif capable d‟adhérer et de pénétrer au sein des cellules de la muqueuse intestinale (Guilford and Strombeck, 1996 ; Greene et al., 1996,b). Campylobacter jejuni colonise le jéjunum, l‟iléon, le caecum et le côlon mais les lésions histopathologiques sont essentiellement observées dans le gros intestin (Guilford and Strombeck, 1996). Campylobacter jejuni peut être à l‟origine d‟une diarrhée sécrétoire par la production d‟une entérotoxine après l‟adhésion à la surface de la muqueuse intestinale. Celle-ci serait similaire aux toxines cholérique et thermolabile d‟Escherichia coli. Le mécanisme est dépendant de l‟AMP cyclique. La toxine activerait l‟adénylate cyclase des entérocytes à l‟origine de la production d‟AMP cyclique. Ceci a pour effet d‟inhiber (par des mécanismes de phosphorylation de protéines membranaires) l‟absorption de sodium et de chlore et d‟augmenter l‟excrétion de potassium et de chlore dans la lumière intestinale, provoquant une diarrhée par hypersécrétion (Guilford and Strombeck, 1996). Certaines souches de Campylobacter jejuni seraient aussi capables de produire une cytotoxine appelée : « cytolethal 47 distending toxin », mais son rôle dans le mécanisme pathogénique des infections intestinales est encore inconnu. In vitro, cette cytotoxine provoque une distension des cellules et bloque le cycle cellulaire en métaphase I (Fox, 2006). La diarrhée peut aussi être d‟origine inflammatoire lorsque la bactérie exprime son caractère invasif, ce qui dépend de la souche bactérienne impliquée. L‟adhésion aux entérocytes se fait par l‟intermédiaire de facteurs d‟attachement (fibronectine, lipoprotéine, adhésines…). L‟adhésion va permettre l‟invasion des entérocytes par un mécanisme d‟endocytose. La bactérie se retrouve alors dans la lamina propria et dans la sous-muqueuse de l‟épithélium intestinal, au contact des cellules inflammatoires. L‟inflammation engendrée mène à l‟altération de la muqueuse intestinale (atrophie des villosités intestinales, destructions cellulaires…). Cette dernière devient alors incapable de résorber les fluides créant ainsi une accumulation passive de fluides au sein de la lumière intestinale. Si l‟infection progresse, on observe une rupture de la barrière intestinale avec une perte totale de la perméabilité autorisant une perte importante de fluides interstitiels, de protéines et de sang. Campylobacter jejuni peut survivre dans les cellules mononucléées de la lamina propria et de la sousmuqueuse de l‟épithélium intestinal. Sa survie va déterminer la sévérité de la maladie, la durée des signes cliniques et les phénomènes de rechutes observés (Joens, 2004). Le mécanisme pathogénique d‟une infection digestive à Campylobacter upsaliensis est encore moins bien connu que celui de Campylobacter jejuni. La bactérie pénétrerait dans la couche de mucus et adhèrerait par la suite aux entérocytes. Elle produit également une toxine cytolytique ayant pour cible les entérocytes et les lymphocytes T. La toxine déclencherait l‟apoptose des cellules épithéliales probablement par arrêt du cycle cellulaire (Joens, 2004). Toutefois, les facteurs de virulence que sont les entérotoxines ou cytotoxines, ne sont pas recherchés lors du diagnostic d‟une diarrhée à Campylobacter chez le chien et le chat. Au niveau histologique (Marks and Kather, 2006), lors d‟une infection par Campylobacter, on peut observer une congestion, un épaississement et un œdème de la muqueuse du gros intestin chez des chiots infectés naturellement et expérimentalement. Une atrophie des entérocytes, de la bordure en brosse et une diminution du nombre de cellules caliciformes sont observées. L‟hyperplasie des cellules glandulaires de l‟épithélium intestinal est à l‟origine de son épaississement. Chez des chiens adultes inoculés avec une souche de Campylobacter jejuni, on observe un effondrement des villosités intestinales, une infiltration de la lamina propria par des cellules inflammatoires et une hyperplasie des plaques de Peyer. Chez des chiens adultes infectés naturellement il y a une hyperplasie de la muqueuse colique caractérisée par une hyperplasie des entérocytes qui sont immatures, hyperchromatiques et avec un index mitotique élevé. On observe également une atteinte des cryptes intestinales qui sont profondes et irrégulières. 48 c) Signes cliniques Les chiots et chatons (de moins de six mois) sont les plus sensibles à une infection à Campylobacter et sont les plus susceptibles de développer une campylobactériose clinique. Ceci peut s‟expliquer par l‟état naïf de leur système immunitaire vis-à-vis de la bactérie et donc de l‟absence d‟anticorps (Fox, 2006). Chez les animaux adultes, Campylobacter agirait en tant que bactérie pathogène opportuniste, provoquant une maladie digestive suite à une baisse des défenses immunitaires de l‟hôte. Le stress (d‟une hospitalisation, d‟une chirurgie ou encore environnemental), des affections digestives intercurrentes dues à d‟autres organismes entéropathogènes tels que les parvovirus, Giardia ou Salmonella sont des facteurs de risques pour le développement d‟une campylobactériose clinique (Guilford and Strombeck, 1996, a). La plupart des chiens et chats restent des porteurs asymptomatiques. Ce sont les espèces Campylobacter jejuni et upsaliensis qui sont associées en routine à la diarrhée, lorsqu‟elle se manifeste. Campylobacter helveticus est le plus souvent responsable d‟infections asymptomatiques chez le chat. La sévérité de la clinique dépend d‟une exposition préalable ou non à la bactérie (et le développement d‟anticorps protecteurs), de l‟âge de l‟animal atteint, du nombre et de la virulence des microorganismes ingérés et de la présence concomitante d‟autres organismes entéropathogènes (Greene et al., 2008, a). La période d‟incubation peut aller de trois à sept jours (Guilford and Strombeck, 1996, a). Les diarrhées à Campylobacter sont en général des diarrhées du gros intestin. Chez le chien, les symptômes peuvent aller d‟une diarrhée bénigne transitoire à une diarrhée sévère profuse aqueuse ou muco-hémorragique associée à du ténesme, en passant par des vomissements, une anorexie et un abattement marqué. Chez le chat, la présence de symptômes est souvent associée à la présence d‟autres entéropathogènes tels que Giardia, Salmonella, Toxocara, Isospora... (Fox, 2006). Les diarrhées sont très souvent de nature mucoïde et hémorragique. Dans les deux espèces, la fièvre est généralement absente (Guilford and Strombeck, 1996, a). L‟épisode diarrhéique est la plupart du temps aigu et dure 5 à 15 jours. Dans de rares cas on peut observer une diarrhée chronique intermittente durant de plusieurs semaines à plusieurs mois (Fox, 2006). d) Potentiel zoonotique Le potentiel zoonotique est élevé pour les campylobactéries. On estime que 5 à 11% des diarrhées humaines résultent d‟une infection à Campylobacter jejuni. Près de 5% des cas sont la conséquence d‟une exposition à des chiens ou chats infectés par Campylobacter spp. (Guilford and Strombeck, 1996, a). L‟homme est plus sensible que les chiens ou les chats à une infection par des campylobactéries et présente des diarrhées plus sévères. En raison de ce risque, une antibiothérapie chez les animaux domestiques présentant une campylobactériose digestive et se trouvant dans l‟entourage de personnes à risque est recommandée. Les propriétaires d‟animaux domestiques doivent être conscients des risques de transmission du chien ou du chat vers les membres de la famille et respecter des mesures d‟hygiène en conséquence. Les animaux atteints de diarrhée ne doivent pas être en contact avec des enfants jusqu‟à ce que l‟épisode diarrhéique soit résolu. 49 3. Salmonella spp. a) Etiologie et épidémiologie Les Salmonella sont des bacilles à Gram négatifs, anaérobies facultatives, appartenant à la famille des Enterobacteriaceae et sont presque toujours mobiles, grâce à un flagelle péritriche. Elles sont très faciles à cultiver. Le genre comporte deux espèces, dont la principale, Salmonella enterica, est divisée en sept sous-espèces. Les sérovars de Salmonella enterica subsp. enterica regroupent 99% des salmonelles isolées en pratique médicale vétérinaire (Leib and Steiner, 2008, b). Il en existe plus de 2400. Ils sont identifiés par l‟étude des antigènes somatiques (O), flagellaires (H) et d‟enveloppe (Ki). Les antigènes permettent d‟établir la formule antigénique de chaque souche de Salmonella et de définir le type sérologique. Tous les types sérologiques actuellement connus sont identifiés grâce à la classification de Kauffmann-White-Le Minor qui comporte les formules antigéniques des souches de salmonelles avec les noms correspondants. De nombreux sérovars ont été isolés à partir des selles des chiens et chats domestiques. Les variations nationales et régionales des fréquences de sérovars reflètent les différences entre les régimes alimentaires des animaux et les environnements des animaux qui sont des sources de bactéries (Carter and Quinn, 2000). Il n‟y a pas de sérovars adaptés de manière spécifique au chien et au chat domestiques. Les sérovars les plus isolés chez ces derniers sont Salmonella Typhimurium et Enteritidis (Greene, 2006 ; Carter and Quinn, 2000 ; Willard and Marks, 2006 ; Greene et al., 2008, a). Les autres sérovars de salmonelles couramment rencontrés sont : Newport, Kentucky, Heidelberg, Javiana, Infantis (Seepersadsingh et al., 2004 ; Finley et al., 2007 ; Lefebvre et al., 2007 ; Morley et al., 2006 ; Stiver et al., 2003). Les sources d‟infections sont nombreuses pour le chien et le chat domestique (Greene, 2006). Les sources de salmonelles sont répertoriées sur la figure 3. La transmission se fait par la voie féco-orale. La nourriture représente une source importante de salmonelles, surtout pour les animaux nourris à base d‟aliments crus ou ceux nourris avec une ration ménagère (Lefebvre et al., 2007 ; Finley et al., 2007 ; Leonard et al., 2010). Les salmonelles sont isolées de 80% des produits à base de viande de poulet crue destinées à l‟alimentation animale (Joffe and Schlesinger, 2002). Les chiens et les chats domestiques peuvent aussi s‟infecter par l‟eau de boisson contaminée. Les chiens ou chats porteurs asymptomatiques sont aussi une source importante de contamination environnementale par leurs selles. Les chiens peuvent s‟infecter lors de promenades ou sorties quotidiennes par exemple. Les objets ou surfaces peuvent être aussi le relais d‟une infection. Dans un milieu hospitalier vétérinaire on peut citer : les récipients dans lesquels le repas est administré, les cages, le matériel médical….Tous ces éléments peuvent disséminer les germes. Enfin les chiens ou chats qui ont un accès libre au milieu extérieur sont très exposés de par leur comportement de chasse (oiseaux, rongeurs…infectés) et occasionnel de coprophagie. 50 Sources de salmonelles pour les chiens et chats domestiques Comportement Alimentaire o Abats o Carcasses d’animaux sauvages o Déchets/restes alimentaires o Denrées crues/os Chasse o Rongeurs, oiseaux sauvages, reptiles Selles/matières contaminées par les selles de porteurs asymptomatiques Animaux de rente Chiens/chats Homme Animaux sauvages Facteurs tenant à l’hôte Facteurs dépendant de la bactérie Chien Taille de l’inoculum Sérotype/souche Capacité de colonisation du tube digestif Chat Facteurs prédisposant Statut immunitaire Stress Maladies intercurrentes (infestation parasitaire…) Âge Malnutrition Antibiothérapie Cortico-chimiothérapie Hospitalisation/infections nosocomiales Chirurgie majeure Anesthésie prolongée Animal porteur Salmonellose Excréteur subclinique clinique Figure 3 : Sources de salmonelles et facteurs prédisposant à une salmonellose clinique (d’après Quarter and Quinn, 2000) 51 b) Pathogénie (Greene, 2006 ; Libby et al., 2004 ; Carter and Quinn, 2000 ; Marks and Kather, 2003) Nous n‟allons aborder que le mécanisme pathogénique d‟une infection digestive par Salmonella. Nous ne parlerons pas des salmonelloses systémiques. Un grand nombre de bactéries sont nécessaire pour qu‟il y ait colonisation du tractus gastro-intestinal, qu‟il y ait ou non des signes cliniques digestifs. Plus de 106 organismes sont nécessaires pour la colonisation de la muqueuse intestinale du chat (Tauni and Österlund, 2000). En effet, une grande partie des bactéries sont détruites par le faible pH stomacal. Ce n‟est que lorsque les salmonelles ont résisté à la barrière stomacale en nombre suffisant qu‟elles peuvent infecter leur hôte et coloniser la muqueuse iléale. La virulence des souches de salmonelles dépend de leur capacité à adhérer à la muqueuse, à l‟envahir et à s‟y multiplier. Dans la sphère intestinale, des moyens de défenses non spécifiques tenant à l‟hôte empêchent également la colonisation par les bactéries : la couche de mucus (contenant des facteurs immunitaires humoraux et cellulaires), les lysozymes, les acides biliaires, la lactoferrine, le péristaltisme et la flore commensale résidente. Dans le gros intestin, la flore résidente très complexe est un obstacle majeur à la colonisation. La plus grande sensibilité des jeunes animaux à une infection salmonellique peut s‟expliquer en partie par une flore commensale qui n‟est pas encore stable et achevée. Tout ce qui altère un ou plusieurs des mécanismes de défenses (diminution de l‟acidité gastrique, altération de la flore endogène bactérienne…) cités ci-dessus favorise la colonisation et le développement d‟une salmonellose clinique. Tout ceci explique que les salmonelloses cliniques soient rares comparées à la fréquence d‟isolement des salmonelles chez les animaux domestiques. Les salmonelles adhèrent préférentiellement au sommet des villosités intestinales. La première étape consiste en l‟adhésion, l‟invasion et l‟internalisation de la bactérie au sein des entérocytes ou des cellules M des plaques de Peyer, comme l‟illustre la figure 5. Les salmonelles possèdent des adhésines permettant leur adhésion aux cellules cibles. Puis, des protéines spécifiques codées par des gènes dits « invasifs » sont introduites dans les cellules cibles et permettent l‟envahissement cellulaire. Ces protéines déclenchent un signal intracellulaire à l‟origine de l‟internalisation de la bactérie au sein des cellules. Elles activent par une voie de transduction du signal, des changements profonds du cytosquelette permettant la macropinocytose de la bactérie par la formation de protrusions membranaires. Une fois que la bactérie se retrouve dans la cellule cible, il se produit une phosphorylation des canaux d‟ions chlorures et des protéines membranaires impliquées dans l‟absorption de chlorure et de sodium. Une diarrhée apparaît et les entérocytes sont détruits par l‟invasion bactérienne. La destruction de l‟épithélium intestinal (destruction des microvillosités, érosion et raccourcissement des villosités, perte de l‟intégrité épithéliale…) permet aux bactéries d‟accéder aux tissus sous-muqueux, stimulant ainsi une forte inflammation. Cette dernière est caractérisée par une migration importante de polynucléaires neutrophiles depuis les vaisseaux jusqu‟à la lamina propria et la lumière intestinale et par l‟accumulation de macrophages. Des cytokines pro-inflammatoires sont également produites au fur et à mesure que les salmonelles détruisent les macrophages de la lamina propria, entretenant l‟inflammation. Selon le statut 52 immunitaire de l‟hôte et la virulence de la souche de salmonelle, l‟infection peut soit se limiter à la sphère digestive et se manifester par une diarrhée secondaire à l‟inflammation, soit traverser la barrière intestinale et devenir systémique (bactériémie et endotoxémie). La plupart des salmonelles peuvent survivre et se multiplier dans les macrophages au sein desquels ils sont transportés vers d‟autres organes menant à des colonisations extra-intestinales. Dans cette localisation intra-macrophagique, elles sont résistantes aux antibiotiques. Ce phénomène explique le phénomène de portage qui peut s‟installer après un épisode aigu d‟entérite salmonellique. Le portage fécal de Salmonella spp. après une infection peut se poursuivre sur une durée de 6 semaines, et peut durer jusqu‟à 14 semaines chez le chat en raison de sa persistance dans les nœuds lymphatiques (Wall et al., 1995 ; Marks and Kather, 2003). L‟excrétion fécale est continue la première semaine puis devient intermittente. Ci-dessous, sont résumées les étapes du développement d‟une diarrhée inflammatoire causée par Salmonella Typhimurium. 15 min post infection Invasion des entérocytes et des cellules M 1 h post infection Accumulation de neutrophiles dans lamina propria et augmentation de la perméabilité vasculaire (œdème) 3 h post infection Effondrement des villosités, perte de l’intégrité épithéliale et accumulation de fluides 8 h post infection Exsudat neutrophilique dans la lumière intestinale 12-48 h Formation d’une pseudomembrane sur l’épithélium endommagé et diarrhée post infection Figure 4 : Etapes du développement d’une diarrhée inflammatoire à Salmonella Typhimurium (d’après Libby et al., 2004) 53 Protrusions membranaires Vaisseau sanguin Vaisseau lymphatique Membrane basale Entérocyte Bordure en brosse Figure 5 : Représentation schématique des différentes étapes de la genèse d’une entérite salmonellique. (1) Intéractions avec les entérocytes et libération de protéines Sop dans le cytoplasme ; (2) les protéines Sip et SopE induisent la formation de protrusions membranaires permettant l‟invasion par les salmonelles; (3) les salmonelles sont à l‟intérieur de vésicules intracytoplasmiques ; (4) la protéine SopB entraîne une accumulation d‟inositol phosphate intracellulaire antagonisant la fermeture des canaux chlorures. Le transport des électrolytes est affecté et une sécrétion de fluides apparaît ; (5) les entérocytes infectés sécrètent des chémokines attirant des cellules inflammatoires vers le foyer d‟infection ; (6) intéraction des salmonelles avec les cellules inflammatoires stimulant la libération de cytokines proinflammatoires qui entretiennent l‟inflammation ; (7) stimulation de la migration des granulocytes entre les entérocytes par les salmonelles ; (8) phagocytose des salmonelles par les cellules inflammatoires ; (9) extrusion des entérocytes infectés avec effondrement des villosités et diminution de l‟absorption de fluides ; (10) migration des cellules infectées et des bactéries vers les vaisseaux lymphatiques. PEEC : pathogen-elicited epithelial chemoattractant ; PGE2 : prostaglandine E2. (Barrow et al., 2010) Certains auteurs suggèrent l‟existence d‟une entérotoxine thermostable, produite par certaines souches de Salmonella, provoquant une hypersécrétion de fluides par la muqueuse intestinale (Greene, 2006 ; Chah and Oboegbulem, 1999). La diarrhée provoquée par une infection digestive à salmonelles serait ainsi régie par de multiples mécanismes. 54 c) Signes cliniques (Carter and Quinn, 2000 ; Greene, 2006) Les salmonelloses cliniques sont rares chez le chien et le chat adultes. Les infections subcliniques et asymptomatiques sont très fréquentes. La sensibilité à une infection et sa sévérité dépendent de la virulence de la souche bactérienne, de la dose infectieuse et d‟un certain nombre de facteurs de résistance de l‟hôte. Ces derniers peuvent être modulés par de nombreuses variables : - L‟âge de l‟hôte : les très jeunes et les animaux âgés sont les plus sensibles - Le statut immunitaire - Le stress causé par une hospitalisation, une opération chirurgicale, une thérapie immunosuppressive (chimiothérapie, corticothérapie), une antibiothérapie - Le mode de vie : chenils, chatteries, refuges, cohabitation - Maladies intercurrentes Tous ces facteurs de risques favorisent le développement d‟une salmonellose clinique. Dans une étude plusieurs chatons ont contracté une salmonellose systémique suite à une vaccination par un vaccin vivant atténué contre le virus de la parvovirose féline (Foley et al., 1999). Les auteurs suggèrent que le vaccin aurait favorisé l‟apparition de la salmonellose : les vaccins vivants atténués peuvent en effet, dans certains cas, produire certains des symptômes observés lors d‟une infection par le virus de la panleucopénie féline (neutropénie associée à une immunosuppression modérée), facilitant par la suite la dissémination systémique des salmonelles (Tham and Studdert, 1987). Les salmonelloses cliniques peuvent se classer en différentes catégories : salmonellose digestive, bactériémie et endotoxémie, salmonellose localisée à un ou plusieurs organes extraintestinaux, infection subclinique (portage asymptomatique). Nous allons nous intéresser uniquement aux signes cliniques intéressant la sphère digestive. Les salmonelles sont responsables d‟une entérocolite aiguë qui se développe dans les trois à cinq jours suivant l‟exposition. Elle se manifeste par une diarrhée aqueuse ou mucoïde avec du sang non digéré dans les cas les plus sévères. La diarrhée peut s‟accompagner de fièvre (40 à 41°C), d‟anorexie, de vomissements, d‟abattement, de douleur abdominale et d‟une déshydratation progressive. Les chats présentent souvent de l‟hypersalivation du fait des vomissements persistants. L‟amaigrissement et la déshydratation deviennent très importants au bout de quelques jours. Cependant, dans la plupart des cas, la salmonellose digestive est bénigne et auto-limitante et se manifeste uniquement sous la forme d‟une légère diarrhée sans fièvre. Moins de 10% des animaux infectés meurent lors de la phase aiguë de salmonellose (Greene, 2006). Les très jeunes et les très vieux animaux présentent les formes les plus sévères (Stiver et al., 2003). La plupart des animaux guérissent complètement en 3 à 4 semaines mais le portage fécal peut durer jusqu‟à 6 semaines après la guérison clinique. Un cas de portage chronique d‟une salmonelle multi-résistante chez un chaton a été rapporté, après un épisode aigu de 7 jours de maladie (diarrhée, vomissements, fièvre). Le portage fécal de la salmonelle a duré 12 semaines consécutives (Wall et al., 1995). Les cas de diarrhée chronique ou intermittente sont très rares (Greene, 2006). 55 Dans quelques rares cas les salmonelles peuvent se disséminer à l‟ensemble de l‟organisme après la traversée de la barrière intestinale, provoquant une septicémie avec une endotoxémie. Deux cas de salmonellose septicémique ont été rapportés chez deux chats ayant été nourris avec de la viande de bœuf crue contaminée (Stiver et al., 2003). d) Potentiel zoonotique La salmonellose est une zoonose d‟importance majeure. Tous les sérotypes de salmonelles (exceptés Typhi et Paratyphi) peuvent infecter à la fois l‟homme et l‟animal. Tout comme les animaux, les hommes peuvent développer des formes localisées ou généralisées de salmonelloses. Bien que la majorité des infections soient bénignes avec une diarrhée spontanément résolutive, des vomissements, une douleur abdominale et de la fièvre, des formes cliniques plus sévères sont également fréquentes. Le premier réservoir de salmonelles pour l‟homme est les denrées animales. La transmission se fait principalement par ingestion de viande de volailles mal cuite, de produits laitiers, d‟ovo-produits… contaminés par les selles d‟animaux ou lors de contamination croisée (préparation, manipulation des denrées avant consommation). Cependant, les animaux domestiques sont aussi reconnus comme étant une source d‟infection pour l‟homme. Les contacts directs avec les selles des animaux infectés de manière asymptomatique représentent une importante source d‟exposition. Les salmonelles peuvent aussi se retrouver sur les mains d‟un propriétaire après avoir manipulé son animal domestique, sur des objets en contact avec l‟animal, dans sa nourriture s‟il y a une mauvaise hygiène… Bien que les cas de transmission de souches de Salmonella du chien ou du chat vers l‟homme soient rarement confirmés, ce mode de transmission zoonotique ne doit pas être négligé dans les mesures de prévention. Plusieurs cas de transmission de salmonelles à partir d‟animaux domestiques malades ont été rapportés. Une étude rapporte quatre épidémies de salmonelloses humaines due à Salmonella Typhimurium associées à la fréquentation de cliniques vétérinaires ou de refuges pour animaux (Wright et al., 2005). La seule exposition commune entre tous les cas était soit la clinique vétérinaire, soit le refuge. Les employés des cliniques vétérinaires et/ou les clients dans chaque structure sont tombés malades après la survenue de la maladie chez l‟animal. Ces structures peuvent ainsi servir de relais pour une transmission zoonotique de salmonelles de l‟animal vers l‟homme mais aussi pour une transmission nosocomiale entre les animaux. En 2003, une épidémie de salmonellose humaine associée également à une clinique vétérinaire a été rapportée (Cherry et al., 2004). Il s‟agissait de techniciens vétérinaires qui se sont occupés des animaux malades et des propriétaires de ces animaux. Le même phénomène a été observé en 1999 dans trois états américains (Idaho, Minnesota, Washington) (Center for Disease Control and Prevention, 2001). Les contacts directs avec les animaux dans des cliniques vétérinaires étaient la source de l‟infection. La contamination de nourriture ou de surfaces par les selles peut survenir en raison d‟une mauvaise hygiène dans les cliniques vétérinaires. Les personnes travaillant dans des chenils, chatteries ou refuges sont également plus à risques d‟être infectés car elles sont plus exposées aux selles des animaux. De plus, la fréquence d„isolement des salmonelles à partir des selles est plus importante dans cette catégorie d‟animaux domestiques. Ceci augmente le risque de transmission zoonotique aux employés des chenils ou chatteries, aux personnes y adoptant 56 leur animal domestique mais aussi le risque de transmission nosocomiale entre chiens ou entre chats. Les animaux nourris à base d‟os et d‟aliments crus sont également des catégories plus à risque dans la transmission zoonotique de salmonelles. Les personnes manipulant ces aliments ou étant en contact avec les selles des animaux nourris avec un tel régime sont les plus exposées (Finley et al., 2007 ; Lefebvre et al., 2007 ; Joffe and Schlesinger, 2002). De plus, par leur statut de porteur asymptomatique, les chiens et les chats sont des sources de contamination environnementale. Ils représentent donc un risque non négligeable pour la transmission de salmonelles à leur propriétaire. Le fait que les animaux domestiques et l‟homme ont des contacts étroits quasi-permanents renforce d‟autant plus ce risque. Au Japon, un enfant de trois mois a été contaminé par Salmonella Virchow par les chiens domestiques du foyer qui étaient excréteurs asymptomatiques (Sato et al., 2000). Le spectre de sensibilité aux antibiotiques et le pattern d‟ADN par restriction enzymatique était identique entre les salmonelles isolées des chiens et de l‟enfant. Pour réduire le risque d‟infection à partir des animaux domestiques il est donc recommandé de se laver les mains après avoir manipulé son animal domestique, surtout avant de manger, de nettoyer certains objets régulièrement en contact avec l‟animal et susceptibles d‟être contaminés par des selles. Dans les cliniques vétérinaires ou des structures telles que des chenils, etc. il est important de porter des gants lors des diverses manipulations, du nettoyage des cages des animaux, de se laver les mains après avoir effectué toutes opérations impliquant un contact avec des selles d‟animaux. Il n‟est pas non plus recommandé de manger ou de boire dans ces enceintes. Toutes surfaces contaminées par des selles doivent être nettoyées et désinfectées. Les épidémies récentes liées à une exposition aux animaux infectés dans des cliniques vétérinaires montrent l‟importance de responsabiliser la communauté vétérinaire dans le domaine de la santé publique afin de parvenir à une meilleure prévention des zoonoses. Le rôle des vétérinaires dans l‟information des propriétaires vis-à-vis de cette zoonose est également important. 4. Escherichia coli a) Etiologie et épidémiologie Escherichia coli fait partie de la flore endogène microbienne du tractus gastrointestinal de nombreux animaux (notamment le chien et le chat) mais aussi de l‟homme. Présent en quantité inférieure par rapport aux bactéries commensales anaérobies strictes, il est le bacille Gram négatif anaérobie facultatif prédominant dans le gros intestin (Janke et al., 1989 ; Drolet et al., 1994). La plupart de ces Escherichia coli sont non pathogènes mais certaines souches peuvent être responsables de diarrhée par la présence de facteurs de virulence souvent portés par des plasmides. Les souches pathogènes sont classées en différentes catégories selon la possession ou non de certains facteurs de virulence qui sont à l‟origine des différentes infections intestinales selon des mécanismes pathogéniques différents. Sur la base des propriétés de ces facteurs de virulence, on distingue parmi les Escherichia coli susceptibles d‟engendrer une diarrhée : 57 - - - - Les E. coli entérotoxigéniques ou ECET: elles possèdent des fimbriae permettant l‟adhésion aux entérocytes de l‟intestin grêle et produisent des entérotoxines thermolabiles et thermostables, à l‟origine d‟une diarrhée par hypersécrétion. Elles ne produisent pas de modifications morphologiques de la muqueuse intestinale. Les E. Coli entéroinvasives ou ECEI: elles envahissent le gros intestin et se multiplient dans les colonocytes, provoquant leur destruction. La diarrhée est de nature inflammatoire. Les E. coli entéropathogènes ou ECEP : elles produisent d‟importants changements morphologiques de l‟épithélium intestinal par des lésions d‟attachement/effacement. Elles ne produisent pas d‟entérotoxines et ne sont pas invasives. Ces lésions sont observées à la fois sur l‟intestin grêle et le gros intestin. Les E. coli entérohémorragiques ou ECEH : elles sont aussi à l‟origine de lésions d‟attachement/effacement mais produisent en plus des vérotoxines (VT) ou shiga-like toxines (SLT). Elles colonisent préférentiellement le gros intestin et induisent des colites hémorragiques. Ces E.coli sont un sous-groupe pathogène des E. coli vérotoxinogènes (ECVT) encore appelées Shiga toxin-producing E. coli (STEC). Les ECEP et les ECEH sont aussi appelées E. coli attachantes/effaçantes (ou ECAE) en raison de cette lésion caractéristique que l‟on peut observer avec ces souches : adhésion intime au pôle apical des entérocytes avec destruction des microvillosités et formation d‟un « piedestal » au site d‟adhésion. La distinction entre ces souches pathogènes et les souches normalement présentes dans la flore intestinale nécessite l‟identification des facteurs de virulence (toxines, gènes impliqués dans les lésions d‟attachement/effacement, fimbriae) par des techniques immunologiques (ELISA…) ou génétique moléculaire (PCR, hybridation d‟ADN…) (Ettinger and Feldman, 2005,a et b). Les Escherichia coli sont des bacilles soit mobiles, soit immobiles, parfois capsulés. Les types sérologiques, très importants à déterminer dans les études épidémiologiques, sont définis par l‟identification des antigènes de surface O (somatique), H (flagellaire) et K (capsulaire), grâce à des réactions d‟agglutination. Les antigènes O sont très importants car ils conditionnent le pouvoir pathogène des souches ainsi que l‟immunité conférée. Les antigènes capsulaires protéiques correspondent à des fimbriae qui confèrent aux bactéries des propriétés adhésives. Ils sont spécifiques d‟espèces pour certain (antigène K88 des souches entéropathogènes porcines, K99 de celles du veau…). Seules les ECET et les ECEP ont clairement été associées aux maladies entériques chez les jeunes chiens. Les ECVT ou ECST ont été isolés des fèces des chiens sains ainsi que de fèces de chiens atteint de diarrhée, mais leur rôle dans la diarrhée canine n‟est pas encore bien connu (Beutin, 1999). Chez le chat, ces pathotypes semblent encore moins fréquents et moins virulents. Des études épidémiologiques supplémentaires sont nécessaires car les 58 données sont encore insuffisantes. Les ECEI n‟ont pas été signalées chez les chiens et les chats. b) Pathogénie (Gyles and Fairbrother, 2010) i. Escherichia coli entérotoxinogènes (ECET) Ce pathotype exprime des entérotoxines responsables d‟une hypersécrétion de fluides dans la lumière intestinale à l‟origine de la diarrhée. Elles ne provoquent aucune lésion histologique de la muqueuse intestinale. Les ECET expriment des facteurs d‟adhésion appelés fimbriae qui déterminent leur spécificité d‟hôte et dont l‟action est ciblée plus spécifiquement sur l‟intestin grêle (Beutin, 1993 ; Janke et al., 1989). Les ECET canines sont différentes des souches isolées des humains, des porcins et des bovins car elles expriment leur propre facteur d‟adhésion. Peu d‟ETEC canines possèdent les adhésines fimbriales communément retrouvées dans les autres espèces animales (Beutin, 1999). Les toxines produites par les ECET sont divisées en deux groupes selon leur stabilité thermique : les toxines thermolabiles (LT pour heat-labil toxin) et thermostables (ST pour heat-stable toxin). La quasi totalité des ECET retrouvées chez les chiens sont productrices de toxines thermostables. Parmi celles-ci on distingue STa (ou STI) et STb (ou STII) qui ont des mécanismes d‟induction de la diarrhée différents. Les ECET canines produisent majoritairement le type STa. Peu de souches expriment le type STb et quelques souches expriment les deux à la fois. La contamination se fait par voie orale. Si un nombre suffisant de bactéries est présent la colonisation de l‟intestin grêle s‟effectue grâce aux adhésines fimbriales qui se lient sur des récepteurs spécifiques ou au glycocalyx. Les figures 6 et 7 représentent des images histologiques observées lors d‟infection par des ECET. 59 20 µ 0.5 µ Figure 6 : Microscopie électronique à transmission. Cas d’un chiot infecté montrant l’adhésion de la bactérie aux entérocytes sans destruction des microvillosités (Drolet et al., 1994) Figure 7 : Microscopie électronique à transmission. Cas d’un chiot infecté montrant la colonisation massive de la villosités sans atteinte de la bordure en brosse (tête de flèche) (Drolet et al., 1994) Les ECET se multiplient ensuite très rapidement, jusqu‟à 109 par gramme de contenu intestinal du jéjunum moyen jusqu‟à l‟iléon. Ce n‟est qu‟une fois qu‟elles adhèrent étroitement à l‟épithélium intestinal qu‟elles peuvent produire les entérotoxines (thermostable et thermolabile). L‟entérotoxine thermolabile est proche de la toxine cholérique et entraîne une dérégulation du système de l‟adénylate cyclase résultant en une surproduction d‟AMP cyclique. Les canaux à chlorures situés dans les cryptes intestinales s‟ouvrent, alors que l‟absorption du sodium (et donc de l‟eau) est bloquée au sommet des microvillosités. Eau et électrolytes sont alors perdus dans la lumière intestinale causant une diarrhée par hypersécrétion (Marks and Kather, 2003). L‟entérotoxine thermostable STa agit par la voie de la guanylate cyclase C avec surproduction de GMP cyclique avec les conséquences évoquées plus haut (Marks and Kather, 2003). La figure 8 illustre le mécanisme d‟action à l‟échelle cellulaire de la toxine thermostable STb. 60 Figure 7 : Mécanisme d’action à l’échelle cellulaire de la toxine thermostable STb d’Escherichia coli entérotoxinogène Liaison de la toxine STb au récepteur de l‟entérocyte (sulfatide) entraînant une augmentation de la concentration intra-cellulaire de calcium. Les fortes concentrations de calciums mènent à l‟activation du CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), de prostaglandines (PGE2) et du 5-hydroxytryptamine (5-HT). Il en résulte une sécrétion de Clet de HCO3- ainsi qu‟une inhibition de l‟absorption de Na+ ( Gyles and Fairbrother, 2010) . Les ECET ne sont pathogènes qu‟au niveau de l‟intestin grêle (Guilford and Strombeck, 1996, a). La figure 9 illustre les étapes de la pathogénèse lors d‟une infection à ECET. 61 Figure 8 : Représentation schématique des étapes de la pathogénèse d’une infection à ECET. (1) Les ECET sont ingérés par l‟animal ; (2) les ECET adhèrent à l‟épithélium de l‟intestin grêle où elles produisent des entérotoxines ; (3) stimulation de la sécrétion d‟eau et d‟électrolytes dans la lumière intestinale ; (4) apparition d‟une diarrhée (d’après Gyles and Fairbrother, 2010) Certaines souches produiraient des entérotoxines différentes de celles déjà caractérisées et différentes de celles retrouvées chez les ECET humaines et des autres espèces animales (Beutin, 1999), mais leur mode d‟action n‟a pas encore été entièrement décrit. ii. Escherichia coli entéropathogènes (ECEP) Les ECEP ne produisent pas de toxines thermolabiles ni de toxines thermostables et ne sont pas entéroinvasives. Le mécanisme pathogénique des ECEP repose sur leur capacité à provoquer des lésions dites d‟ « attachement-effacement » (lésions « AE »). Les ECEP possèdent toutes le gène eae codant pour une intimine, nécessaire à l‟établissement de ces lésions. Les ECEP possèdent également un autre facteur de virulence : le gène bfpA codant pour une protéine fimbriale appelée BFP (Bundle-forming pili) et situé sur un plasmide particulier nommé EAF pour EPEC Adherent Factor. Il est impliqué dans les premières phases de l‟adhésion aux entérocytes, c‟est-à dire une adhésion localisée mais lâche de la bactérie aux entérocytes. En revanche, le gène bfpA n‟est pas nécessaire à l‟établissement des lésions caractéristiques. La formation des lésions « AE » implique des gènes situés sur un îlot de virulence chromosomique appelé LEE ou Locus for Enterocyte Effacement. Ce facteur de virulence est suffisant à lui seul pour induire des lésions « AE ». Il contient les gènes codant pour l‟intimine et son récepteur (eae et tir), diverses protéines bactériennes sécrétées (E.coli secreted protein) dans l‟entérocyte (EspA, EspB et EspD) ainsi que des gènes codant pour un système de sécrétion de ces protéines (Goffaux et al., 2000). 62 La première étape de l‟infection fait intervenir la protéine fimbriale BFP, qui est responsable de l‟adhésion initiale c‟est-à-dire de la formation locale de micro colonies bactériennes à la surface des entérocytes, appelée « adhésion localisée ». Un signal médié par les protéines bactériennes EspA, EspB et EspD est ensuite délivré aux entérocytes permettant à la bactérie d‟adhérer intimement aux entérocytes. Ceci se fait grâce à la liaison entre l‟intimine (une protéine extra-membranaire et son récepteur TIR (Translocated Intimin Receptor) qui est incorporée au sein de la membrane entérocytaire par la bactérie elle-même. Les lésions d‟ « attachement-effacement » se forment par réorganisation du cytosquelette des entérocytes. Une polymérisation de l‟actine et une accumulation d‟autres protéines du cytosquelette juste au niveau du site d‟adhésion de la bactérie amènent à la formation d‟une structure en « piedestal ». Il y a alors « effacement » des microvillosités intestinales et de la bordure en brosse. Les différentes étapes décrites sont illustrées dans la figure 10. La perte de la surface d‟absorption par destruction des microvillosités mène à une diarrhée par malabsorption. Cependant, l‟apparition très rapide de la diarrhée suggère également un mécanisme actif de sécrétion provoqué par un signal émis par la bactérie sur les médiateurs intestinaux des transports ioniques (calcium, inositol phosphate et tyrosine kinase). Le développement de la diarrhée pourrait aussi être dû en partie à une augmentation de perméabilité des jonctions serrées entre les entérocytes, à une réponse inflammatoire locale au site de la lésion ou à une sécrétion de chlorure suivie par une migration de polynucléaires neutrophiles dans la lumière intestinale. 63 Figure 9 : Mécanisme de la formation des lésions d’attachement-effacement. (a) Adhésion « lâche » et translocation des protéines EspA, B et D via le système de sécrétion de type III puis translocation du récepteur à l‟intimine (Tir) dans la cellule hôte. (b) Transduction du signal entraînant une désorganisation du cytosquelette au site d‟adhésion : effacement des microvillosités. (c) Adhésion « intime » avec action sur l‟actine F de la cellule hôte : formation du piedestal. (Wales et al., 2005) Plusieurs auteurs ont étudié la formation ces lésions d‟ « attachement-effacement » chez le chien (Broes et al., 1988 ; Janke et al., 1989 ; Hart et al., 1990). Les lésions s‟observent principalement dans le jéjunum et l‟iléon (Broes et al., 1989), et dans une moindre mesure dans le gros intestin (Janke et al., 1897). Les bactéries sont attachées intimement au pôle apical des entérocytes induisant une destruction des microvillosités avec un creusement 64 caractéristique des membranes entérocytaires (formation du « piedestal » au site d‟adhésion bactérien). Les figures 11 et 12 montrent des images des lésions d‟attachement-effacement. Les villosités sont atrophiées, les cryptes intestinales hyperplasiées et la lamina propria de l‟iléon est infiltrée par des histiocytes, des plasmocytes et des lymphocytes. Une infection expérimentale par une souche ECEP humaine chez un chien a révélé qu‟au bout de quatre heures les bactéries adhèrent intimement à la couche de mucus recouvrant les entérocytes. Au bout de huit heures, elles pénètrent entre les microvillosités et sont attachées fermement aux entérocytes provoquant la formation d‟un piedestal et le creusement de la membrane au site d‟adhésion. La destruction de la bordure en brosse est visible à cette étape. Enfin après vingtquatre heures d‟incubation, les microvillosités et la bordure en brosse sont complètement détruites (Hart et al., 1990). Figure 10 : E.coli attachants-effaçants et destruction des microvillosités à la microscopie électronique (Ettinger and Feldman, 2005, b) 0.5 µ Figure 11 : Microscopie électronique à transmission. E.coli attachants-effaçants chez un chien, formant un piedestal au pôle apical des entérocytes avec un effacement des microvillosités (Drolet et al., 1994) 65 iii. Escherichia coli vérotoxinogènes (ECVT ou ECST) Elles sont aussi responsables de l‟apparition des lésions d‟ « attachement-effacement » au niveau de l‟intestin grêle mais produisent également des cytotoxines qui ont un effet cytopathogène in vitro sur les cellules Vero. Ces cytototoxines sont appelées vérotoxines (VT) ou Shiga-toxines (STX). Elles possèdent une certaine homologie au niveau de leur activité biologique avec les Shiga toxines de Shigella dysenteriae. Il existe deux variants antigéniques des vérotoxines : VTI ou STX 1 similaire à la Shiga toxine I et VT II ou STX 2 similaire à la Shiga toxine II. Les deux toxines peuvent être produites par la même souche bactérienne. Les ECVT canines et félines produisent les deux types de vérotoxines. Les bactéries sont ingérées à partir d‟une source environnementale. Elles passent par l‟estomac et les intestins, qu‟elles colonisent, puis produisent des vérotoxines. Celles-ci se lient à un récepteur spécifique glycolipidique Gb3 situé à la surface des entérocytes. La liaison permet l‟endocytose de la vérotoxine par l‟entérocyte, inactivant par la suite la synthèse protéique cellulaire. Les vérotoxines déclenchent également l‟apoptose cellulaire. Si les souches d‟ECVT possèdent également le LEE, il y a en parallèle la formation de lésions d‟attachement-effacement. Sinon, la liaison à l‟épithélium intestinal reste lâche et il n‟y pas de lésions typiques d‟ « attachement-effacement ». La diarrhée observée est aussi une diarrhée par malabsorption. c) Signes cliniques (Guilford and Strombeck, 1996, a) Les chiens et chats adultes peuvent être porteurs asymptomatiques de souches pathogènes d‟ECET, ECEP et ECVT. Les signes cliniques peuvent aller d‟un simple portage asymptomatique à une diarrhée hémorragique. Les ECET produisent en général une diarrhée aqueuse profuse de l‟intestin grêle. Les chiots et les chatons sont les plus sensibles aux infections par les ECEP et les ECET, ainsi que les animaux provenant de refuges, animaleries ou chatteries (Marks and Kather, 2003 ; Drolet et al., 1994). La diarrhée due aux ECEP est soit mixte soit de l‟intestin grêle uniquement. Les Escherichia coli attachantes-effaçantes (ECEP et ECVT) produisent en général des diarrhées chroniques. Les ECVT colonisent de manière plus spécifique le gros intestin et provoquent des colites hémorragiques (Drolet et al., 1994). Malheureusement, ces symptômes ne sont pas spécifiques d‟une infection entérique à Escherichia coli. Le diagnostic d‟une colibacillose intestinale est impossible à faire cliniquement. Il est nécessaire lorsque l‟on isole une Escherichia coli des selles d‟un animal malade de rechercher les facteurs de virulence (tests immunologiques, sérotypage, génétique moléculaire…) pour évaluer le potentiel pathogène de la bactérie isolée. 66 d) Potentiel zoonotique Plusieurs études suggèrent la possibilité d‟une transmission zoonotique de souches d‟Escherichia coli pathogènes entre l‟homme et les carnivores domestiques, mais sans la prouver réellement. Des souches ECEP canines se sont révélées être génétiquement proches des souches pathogènes humaines (Goffaux et al., 2000) ou posséder des facteurs de virulence similaires ou appartenir au même sérotype que les souches humaines (Nakazato et al., 2004). Les chiens domestiques pourraient être ainsi une source potentielle d‟infection à ECEP pour l‟homme. Une autre étude suggère également une potentielle transmission de souches toxinogènes (ECET et ECVT) du chien (diarrhéique ou cliniquement sain) vers l‟homme. Les chats domestiques également sont colonisés par des sérotypes d‟ECEP (Morato et al., 2008) ou d‟ECVT (Smith et al., 1998) identiques à des sérotypes pathogènes décrits chez l‟homme, faisant d‟eux des réservoirs potentiels d‟Escherichia coli pathogènes pour l‟homme. Cependant, les pathotypes retrouvés chez les carnivores domestiques sont assez spécifiques d‟espèces. Même si les carnivores domestiques peuvent être des porteurs asymptomatiques d‟ECVT, d‟ECET ou d‟ECEP, le potentiel zoonotique reste tout de même faible (Guilford and Strombeck, 1996, a ; Leib and Steiner, 2008, b). Après avoir dressé un état des lieux de la situation épidémiologique des principales bactéries entéropathogènes, étudié leurs caractéristiques et la pathogénie des maladies qu‟elles induisent nous allons nous intéresser au diagnostic des diarrhées associées à ces germes. Un des moyens les plus simples et les plus accessibles pour un clinicien dans le cadre du diagnostic des diarrhées bactériennes est la mise en culture des selles. Dans certains contextes cliniques (que nous étudierons dans la troisième partie), la coproculture permet de mettre en évidence une ou deux bactérie(s) prédominante(s) et de les relier aux symptômes observés. La deuxième partie est centrée sur la réalisation pratique de cet examen : la formulation de la demande de l‟examen au laboratoire, les bactéries susceptibles d‟être recherchées directement à partir des selles et leur caractérisation éventuelle par des méthodes complémentaires (moléculaire ou immunologiques). 67 68 Partie 2 : La coproculture dans le diagnostic de laboratoire des diarrhées d’origine bactérienne du chien et du chat : aspects techniques et pratiques 69 Nous allons caractériser les différentes étapes de la coproculture et les exigences qui s‟y rattachent concernant l‟échantillonnage des selles, l‟envoi et la demande au laboratoire pour que cet examen puisse avoir la plus grande performance diagnostique possible. A. Choix de l’échantillon et acheminement au laboratoire 1. Critères de choix de l’échantillon a) Selles fraîches ou écouvillons rectaux ? Pour réaliser une coproculture, deux types d‟échantillons peuvent être choisis : le prélèvement d‟une certaine quantité de selles fraîches ou l’écouvillon rectal. Il semblerait que les selles fraîches soient plus indiquées pour réaliser une coproculture. Les performances diagnostiques sont augmentées avec ce type d‟échantillon car il héberge une plus grande quantité de bactéries en raison d‟une plus grande quantité de matériel fécal. Les selles fraîches ne nécessitent pas, en pratique, de milieu de transport, contrairement aux écouvillons rectaux. Ces derniers présentent le défaut de porter une quantité de matériel fécal et une charge bactérienne inférieures. Les risques de faux négatifs seraient augmentés par rapport aux échantillons de selles fraîches (Jones, 2006). Une étude (Acke et al., 2006) a comparé les performances diagnostiques de ces deux types d‟échantillons pour identifier des campylobactéries. Le pourcentage d‟échantillons positifs pour Campylobacter spp. est significativement plus important lorsqu‟on choisit des selles fraîches (66,7%) par rapport aux écouvillons rectaux (51,1%), chez le chien. Les résultats inverses sont observés chez le chat (75% d‟échantillons positifs pour Campylobacter spp. avec les écouvillons rectaux contre 40% d‟échantillons positifs en utilisant des selles fraîches), sans qu‟aucune explication n‟ait pu être avancée. Cependant, pour évaluer la sensibilité réelle de ces deux types d‟échantillons, il faudrait comparer les taux d‟échantillons positifs issus de selles fraîches à ceux issus d‟écouvillons rectaux collectés à partir du même animal. Pour le moment, aucune étude n‟a véritablement évalué la sensibilité réelle de la coproculture en fonction du substrat (selles fraîches versus écouvillon). Le laboratoire Idexx Alfort indique que de son point de vue, il n‟existe pas un réel avantage diagnostique à choisir l‟un ou l‟autre type de prélèvement. Cependant, aucune étude scientifique ne permet de l‟affirmer de manière définitive. En ce qui concerne les différentes études épidémiologiques, le type d‟échantillon semble être choisi de manière aléatoire et ne représente pas un paramètre étudié quant à son influence sur les résultats. Les écouvillons rectaux semblent prépondérants dans les études épidémiologiques publiées concernant la recherche de Campylobacter spp. et Escherichia coli dans les selles de chiens et de chats. Les selles fraîches sont retrouvées plus fréquemment lorsqu‟il s‟agit de Clostridium spp. et Salmonella spp.. Des mises en culture de biopsies coliques pourraient en théorie être envisagées pour diagnostiquer des diarrhées chroniques d‟origine bactérienne, mais seulement lorsqu‟il s‟agit de bactéries entéroinvasives (Campylobacter et Salmonella par exemple). Dans une étude 70 récente sur la relation causale entre Escherichia coli et la colite histiocytaire du boxer, trois biopsies coliques sur sept se sont révélées positives en culture pour Escherichia coli alors que les coprocultures des sept chiens étaient toutes négatives (Mansfield et al., 2009). L‟auteur recommande d‟utiliser la mise en culture de biopsies coliques dans le cadre du suivi de cette affection. Cependant, aucune étude n‟existe concernant l‟intérêt de la mise en culture de biopsies coliques pour rechercher des germes tels que Salmonella et Campylobacter spp.. La mise en culture de biopsies coliques est ainsi peu répandue et les vétérinaires envoient trop rarement ce type de matériel pour pouvoir évaluer la performance diagnostique de ce type d‟échantillon. Ils sont aussi généralement peu enclins à réaliser ce prélèvement pour une analyse bactériologique en première intention. Lorsqu‟elles sont réalisées, les biopsies sont plutôt envoyées au laboratoire pour une analyse histologique. Par ailleurs, les biopsies ne conviennent pas quand il s‟agit d‟un épisode diarrhéique aigu (Guilford and Strombeck, 1996). Le temps d‟attente des résultats de la culture ou de l‟histologie est trop long par rapport à celui que dure l‟épisode diarrhéique. Les analyses histologiques de biopsies ne permettent pas de différencier les entérites causées par un germe entéropathogène strict de celles causées par une bactérie opportuniste, membre de la flore endogène intestinale (Guilford and Strombeck, 1996, d). Lorsque ce sont des diarrhées sécrétoires résultant de l‟action d‟une entérotoxine bactérienne, les changements secondaires au niveau de l‟épithélium intestinal, qui se produisent au bout de 24 heures, ne sont pas spécifiques. De plus, au début du processus, les entérotoxines agissent sans altérer la structure de l‟épithélium intestinal. Les Escherichia coli attachants/effaçants (ECAE) représentent un cas particulier où les biopsies intestinales peuvent avoir une valeur diagnostique intéressante (Broussard, 2003 ; Drolet et al., 1994 ; Turk et al., 1998 ; Pospischil et al., 1987 ; Broes et al., 1987 ; Hart et al., 1990 ; Janke et al., 1989). En effet, les lésions typiques d‟attachement/effacement, à l‟origine de la diarrhée, qu‟elles produisent sont caractéristiques. Il est possible d‟identifier ces lésions sur les préparations histologiques car la bordure en brosse est facilement visualisable. Les coupes histologiques de biopsies permettent alors de suspecter l‟agent causal. Il est en néanmoins généralement impossible d‟identifier la nature des agents pathogènes incriminés. Tout au plus peut-on observer dans les macrophages (sous réserve qu‟il n‟y ait pas de destruction tissulaire massive) des agents figurés compatibles avec des bactéries. Cela reste toutefois un exercice difficile pour le pathologiste. Les préparations histologiques de biopsies coliques entrent également dans le cadre de la démarche diagnostique pour la colite histiocytaire : visualisation d‟inclusions colorées à l‟acide périodique de Schiff dans les macrophages, associée à une ulcération de la muqueuse et une perte des cellules à mucus, en histologie conventionnelle. L‟identification des Escherichia coli adhérentes et invasives nécessite, quant à elle, l‟emploi d‟une méthode appelée « hybridation fluorescente in situ », utilisant des sondes marquées avec un fluorochrome et utilisées sur des coupes histologiques. Un avantage des coupes histologiques est qu‟elles permettent également de différencier une infection bactérienne d‟une MICI ou Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale (idiopathique). La première est souvent associée à une suppuration, comparée à la seconde (Guilford and Strombeck, 1996, d). Cette donnée est cependant à nuancer, car même 71 si les infiltrations neutrophiliques sont rares lors de MICI, elles peuvent néanmoins exister. Les images histologiques du côlon permettent aussi de donner des orientations dans la réalisation des coprocultures (Guilford and Strombeck, 1996, e). Si une infiltration neutrophilique avec des érosions ou des ulcérations de l‟épithélium dominent à l‟histologie d‟une biopsie colique, une colite bactérienne peut être suspectée et une coproculture est recommandée (Matz and Guilford, 2003 ; Guilford and Strombeck, 1996, e). Des exemples de telles images histologiques sont représentés avec les figures 13, 14 et 15. 2 Erosion 1 Infiltration du chorion par des polynucléaires neutrophiles en voie de dégénérescence Figure 12 : Coupes histologiques à partir de biopsies coliques montrant une infiltration neutrophilique associée à des érosions de l’épithélium. Grossissement×20. (Service d’Anatomie Pathologique du Campus Vétérinaire de Lyon). Figure 13 : Détail de la zone 1. Infiltrat neutrophilique. Grossissement ×40. (Service d’Anatomie Pathologique du Campus vétérinaire de Lyon). 72 Figure 14 : Détail de la zone 2. Erosion épithéliale. Grossissement×40. (Service d’Anatomie Pathologique de Campus Vétérinaire de Lyon). Si les images montrent une inflammation pseudo-membraneuse (présence de « fausses membranes » tapissant la paroi colique) une recherche de Clostridium difficile ainsi que de ses toxines sont indiquées. b) Caractéristiques des prélèvements (Broussard, 2003 ; Guilford and Strombeck, 1996, c) i. Moment du prélèvement La récolte et l‟envoi d‟un échantillon doit se faire assez tôt au cours de l‟épisode diarrhéique quand les pathogènes sont en nombre élevé dans les selles. En effet, pour la plupart, leur nombre diminue au fur et à mesure de l‟évolution du processus et leur isolement devient alors de plus en plus difficile (Guilford and Strombeck, 1996, c). Il est conseillé de récolter trois échantillons consécutifs dans le stade aigu de la diarrhée, soit les trois premiers jours (Jones, 2006). Les prélèvements doivent également être réalisés avant l‟instauration d‟une antibiothérapie, l‟animal testé risquerait alors d‟être un « faux-négatif ». Dans le cas des diarrhées chroniques auxquelles peuvent être associées occasionnellement Campylobacter, Salmonella et Clostridium spp. des prélèvements répétés doivent être réalisés car les animaux peuvent excréter la bactérie de manière intermittente. De plus, les excrétions fécales diffèrent d‟un germe à l‟autre, certains sont excrétés uniquement quelques jours après le début de l‟épisode diarrhéique, d‟autres sont en très faible nombre ou sont absents à des stades plus avancés de la maladie. Bien que trois cultures de selles ne soient pas absolument nécessaires dans tous les cas, les répéter est indiqué quand le tableau clinique suggère une infection bactérienne du tractus gastro-intestinal et que les premières cultures ne sont pas concluantes (Jones, 2006). 73 En ce qui concerne Clostridium perfringens et la recherche de sa toxine associée, les échantillons fécaux doivent être prélevés quand la diarrhée est présente, car la toxine peut être absente lors des phases asymptomatiques. ii. Quantité et mode de prélèvement (Broussard, 2003) Le prélèvement de matière fécale doit observer certaines précautions pour pouvoir interpréter correctement le résultat donné par le laboratoire. Un prélèvement classique effectué sans précaution particulière à même le sol n‟évalue que la flore colique aérobie qui représente moins de 10% de la flore endogène totale. De plus, la flore bactérienne dans les fèces ne représente pas la flore de l‟intestin grêle. Il existe une grande différence à la fois qualitative et quantitative entre les populations bactériennes des selles et du jéjunum (Mentula et al., 2005). Les bactéries du jéjunum sont majoritairement aérobies ou aérobies facultatives alors que celles isolées des selles sont plutôt anaérobies. Les échantillons fécaux sont ainsi incapables de représenter les populations bactériennes dans la portion haute du tractus intestinal. Les selles fraîches Les selles fraîches représentent le meilleur échantillon pour une coproculture. Les selles peuvent être obtenues à partir d‟un toucher rectal lors de l‟examen physique de l‟animal. Lorsque le toucher rectal est impraticable ou ne permet pas la récolte de selles, l‟emploi d‟une baguette en plastique à embout arrondi que l‟on insère directement dans le rectum de l‟animal est possible (« fecal loops » ou spatule). Un lavement rectal est aussi une autre méthode fiable pour obtenir des selles fraîches. L‟échantillon ainsi obtenu peut être directement placé sur des lames pour une cytologie fécale ou dans un pot stérile en plastique pour les coprocultures. Cependant, les selles obtenues à partir d‟un lavement rectal contiennent plus de sécrétions muqueuses et moins de matériel fécal, ce qui peut altérer la valeur de l‟échantillon. Les lavements rectaux sont idéaux pour les cytologies mais deviennent inappropriés lorsque l‟échantillon requiert une plus grande quantité de matériel fécal. Quand des échantillons plus importants en quantité sont nécessaires, des selles évacuées naturellement par l‟animal conviennent également. La défécation doit avoir lieu, dans la mesure du possible, dans un lieu propre et suivie immédiatement d‟un conditionnement et d‟un stockage adéquat de l‟échantillon. Pour les chats, il est conseillé d‟éviter le contact avec la litière. Elle pourra être remplacée par du papier journal. Des quantités de 2 à 10 grammes de selles fraîches ou de 3 à 10 ml si les selles sont très liquides, sont recommandées pour la réalisation d‟une coproculture (Guilford ans Strombeck, 1996, c). Les selles doivent être les plus fraîches possibles si l‟on recherche de bactéries anaérobies (Clostridium spp.) ou microaérophiles (Campylobacter spp.). Il est préférable de retirer des selles directement à partir du côlon pour éviter toute contamination externe via le sol ou l‟urine, surtout s‟il s‟agit de micro-organismes fragiles. Les selles doivent être placées dans un pot stérile scellé et étanche, conservées et conditionnées sous couvert du froid, soit entre +2°C et +8°C (pour éviter la prolifération des espèces commensales) et envoyées au laboratoire d‟analyses dans les 24 à 48 heures. 74 Les écouvillons rectaux En raison de la faible quantité de matériel fécal, ils sont à éviter pour les coprocultures en raison de risque d‟accroissement des faux négatifs (Jones, 2006). Lorsque ce sont des bactéries anaérobies ou microaérophiles qui sont recherchées, les écouvillons sont introduits dans le rectum et frottés contre la muqueuse en imprimant un mouvement de rotation, puis retirés. Ils sont ensuite placés dans un milieu de transport bactérien adapté à l‟agent suspecté, déjà associé à un tube stérile. Si des conditions moins exigeantes sont nécessaires, il est possible d‟écouvillonner la surface d‟une selle fraîche, en incluant toute portion de mucus, exsudat ou sang visible. Concernant le laboratoire Idexx Alfort, ce dernier fournit toujours l'écouvillon avec son milieu de transport, le tout dans un sachet hermétique stérile. Un prélèvement de selles rigoureux est important pour l‟isolement du germe entéropathogène suspecté. Sont résumées ci-dessous les critères nécessaires à respecter pour une bonne réalisation du prélèvement de selles : 1) Les selles doivent être les plus fraîches possibles car il faut tenir compte des microorganismes les plus fragiles. 2) Il convient d‟éviter toute contamination externe (sol, urine,…). 3) Une quantité de 2 à 3 grammes pour les selles fraîches est recommandée et placée dans pot stérile scellé et étanche, conservée et conditionnée sous couvert du froid (+2°C et +8°C). 5) Plusieurs prélèvements peuvent être nécessaires et idéalement, trois cultures dans le stade le plus précoce de la maladie. 6) Concernant les écouvillons, ils portent une charge fécale donc bactérienne inférieure. Ils sont à placer directement dans un milieu de transport présent dans un tube stérile. 75 2. Modalités de transport : milieux de transport et réfrigération Même si en pratique, les laboratoires d‟analyses vétérinaires n‟exigent pas de milieu de transport pour les selles fraîches, il est quand même conseillé pour ce type de prélèvement. En effet, les bactéries sont sensibles aux variations de température, de pH, de pression en oxygène et sont détruites dans un environnement qui ne leur est pas favorable et doivent donc être conservées dans des milieux adaptés. Les écouvillons rectaux sont systématiquement envoyés avec un milieu de transport bactérien classique dans un tube ou un sachet hermétique de transport, stériles. Campylobacter spp. Les Campylobacter spp. sont des germes micro-aérophiles difficiles à isoler. Ils sont sensibles aux conditions environnementales : la déshydratation, l‟oxygène atmosphérique, la lumière et les températures élevées. Les échantillons (même les selles fraîches), envoyés au laboratoire pour leur recherche devraient être idéalement placés dans un milieu de transport s‟ils ne peuvent pas être expédiés rapidement après leur récolte, soit dans les 24 à 48 heures (Tams, 2003 ; Guilford and Strombeck, 1996, a ; Willard and Marks, 2006). Les milieux de transport protègent contre la dessiccation, la lumière et les effets toxiques de l‟oxygène. Pour une culture optimale, s‟ils ne sont pas frais, les échantillons doivent être réfrigérés (+4°C), surtout si le délai entre le prélèvement et son traitement est trop long. Les campylobactéries peuvent cependant rester viables dans des échantillons réfrigérés pendant une période allant de 3 à 7 jours. Les températures trop élevées ou trop basses ainsi que les fluctuations de températures doivent être évitées. Les écouvillons rectaux doivent être placés dans un milieu de transport anaérobie avant la réfrigération (Willard and Marks, 2006). Un milieu de transport Amies avec du charbon peut également prévenir la destruction des microorganismes durant le transport (McDonough and Simpson, 1996). Un autre milieu appelé Para-Pack C&S (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, OH) peut être utilisé pour les campylobactéries (Broussard, 2003). Il s‟agit d‟un milieu Cary-Blair modifié qui utilise un soluté isotonique non nutritif, tamponné pour assurer la conservation des pathogènes entériques pendant 96 heures. En ce qui concerne les selles fraîches, les milieux Cary Blair, Stuart modifié ou camp-thioglycolate conviennent. Salmonella spp. Pour éviter de détruire les salmonelles présentes dans l‟échantillon et diminuer le risque de faux-négatifs lors du transport au laboratoire, il est recommandé de placer les selles fraîches dans un milieu de transport comme par exemple le milieu Amies avec du charbon (Greene, 2006 ; McDonough and Simpson, 1996). Il permet la conservation d‟une large gamme de bactéries, même les plus sensibles, pendant 48 heures et convient bien aux bactéries du genre Salmonella. Si aucun milieu de transport n‟est utilisé, la chute du pH détruira la majorité des bactéries. Des milieux Cary-Blair peuvent également être utilisés. Les échantillons sont envoyés sous couvert du froid. Comme les campylobactéries, les salmonelles restent viables dans des échantillons réfrigérés pendant 3 à 7 jours. 76 Escherichia coli En ce qui concerne Escherichia coli, un milieu de transport Stuart, qui est similaire à Amies et Carry-Blair, peut être utilisé pour les selles fraîches et les écouvillons rectaux. Les échantillons sont en général conservés réfrigérés avant l‟envoi au laboratoire et sont envoyés sous couvert du froid. Clostridium spp. Les échantillons fécaux pour recherche de Clostridium spp. devraient être placés dans un milieu de transport anaérobie Cary-Blair (McDonough and Simpson, 1996). Selon certains auteurs, la réfrigération ne serait pas conseillée et pourrait mener à des résultats non fiables (McDonough and Simpson, 1996 ; Leib, 2008, a). En revanche, pour la recherche de toxines, si les selles ne sont pas fraîches, celles-ci devraient être conservées à +4°C car les toxines se dénaturent à température ambiante (22°C). Les formes végétatives de Clostridium spp. perdent rapidement leur viabilité si le prélèvement est conservé dans une atmosphère normale et donnent naissance à des spores. Si le prélèvement est placé dans un milieu de transport pour bactéries anaérobies, la forme végétative peut survivre 30 jours à +4°C. Ainsi, pour éviter les réponses faussement négatives, il est préférable d‟envoyer tout prélèvement dans un milieu de transport anaérobie à +4°C. Pour résumer, voici quelques principes qui sont recommandés pour le transport et la conservation des échantillons : 1) Les échantillons devraient être envoyés au laboratoire sous couvert du froid (+4°C) dans les 24 à 48 heures après leur collecte. 2) Les milieux de transport pour les selles fraîches sont fortement recommandés : Cary Blair, Amies ou Stuart,… 3) Il faut éviter les écarts de température, l‟exposition à la lumière et à l‟oxygène atmosphérique des prélèvements. Dans la pratique courante, le laboratoire Idexx Alfort reçoit des échantillons avec ou sans milieu de transport dans les mêmes proportions. Comme on ne peut pas préjuger des bactéries que l‟on va retrouver lors de la coproculture, il propose un milieu de transport qui convient pour toutes les bactéries qui peuvent être recherchées (aérobies et anaérobies). Il s‟agit du milieu Amies. De plus, les échantillons de selles sont également envoyés la plupart du temps à température ambiante. En revanche, ils sont conservés au réfrigérateur en attendant l‟envoi au laboratoire. 77 3. Délais d’acheminement et de traitement des prélèvements Les délais d‟acheminement et de traitement de prélèvement ne sont pas les mêmes selon la bactérie suspectée car certaines sont plus fragiles que d‟autres selon leur métabolisme. Si des milieux de transport ne sont pas utilisés pour les échantillons de selles fraîches, les délais de transport et de traitement devront être, dans tous les cas, les plus courts possibles pour minimiser le risque de faux négatifs. a) Bactéries nécessitant un court délai de transport : Campylobacter et Clostridium spp. Les échantillons de selles fraîches soumis au laboratoire pour recherche de Campylobacter spp. doivent être expédiés le plus rapidement possible c‟est-à-dire au plus tard dans les 24 heures après la collecte et sous réserve du froid. Les campylobactéries sont des microorganismes sensibles à l‟oxygène et la dessiccation (Koene et al., 2004). Si le prélèvement ne peut être envoyé rapidement, un milieu de transport est préconisé lors de l‟envoi (Guilford and Strombeck, 1996, a). Selon une étude (Koene et al., 2004), un délai maximal de quatre heures entre l‟envoi et le traitement de selles fraîches sous couvert du froid au laboratoire est préconisé pour pouvoir détecter le plus possible les co-infections (infections simultanées à différentes espèces de Campylobacter) chez un même animal. Passé ce délai, certaines espèces de campylobactéries sont détruites et souvent une seule espèce peut être isolée. Cependant la viabilité de l‟échantillon (durée de survie des campylobactéries dans le matériel fécal) dépend largement de l‟espèce de Campylobacter. En effet, certains échantillons étaient encore positifs à la coproculture trois jours après le prélèvement de selles (Koene et al., 2004). Même si Campylobacter jejuni et coli peuvent survivre au minimum trois jours dans les selles à température ambiante et pendant une semaine si les selles sont réfrigérées, les meilleurs taux d‟isolement sont obtenus lorsque le délai de traitement est le plus court possible (Fox, 2006 ; Leib, 2008, a). Clostridium difficile peut rester viable quatre jours dans les selles à température ambiante (Riley et al., 1991). Cependant, une étude concernant une suspicion de diarrhée associée à Clostridium difficile chez deux chats n‟a pas permis de mettre en évidence la bactérie par coproculture. Il a été supposé que le délai entre la récolte et l‟envoi de l‟échantillon, étant de 24 à 48 heures, aurait été trop long (possible faux-négatifs) (Weese et al., 2001). En revanche les toxines A et B de Clostridium difficile ont été retrouvées dans les selles par la méthode ELISA. Les deux chats avaient également reçu un traitement antibiotique avant le prélèvement de l‟échantillon. Ce dernier aurait pu inhiber la croissance de la bactérie sans affecter la toxine. Ainsi, l‟isolement des clostridies par mise en culture de selles peut être négatif mais la détection de toxines clostridiennes, positive, car les clostridies ne survivent pas longtemps dans les selles gardées en milieu aérobie alors que la toxine est plus résistante (sous réserve d‟une conservation de l‟échantillon sous couvert du froid). Si le délai de traitement des échantillons est important le risque de faux négatifs s‟en retrouve augmenté (Weese et al., 2001). On sait que chez les chevaux, un délai de 24 à 72 heures avant l‟envoi de selles au laboratoire diminue fortement les chances de retrouver la bactérie par mise en culture. 78 Le temps de génération de Clostridium perfringens étant très court (10 minutes), les échantillons doivent être envoyés le plus rapidement possible au laboratoire. Si le délai entre la récolte et le traitement au laboratoire est trop long, le risque de faux positifs augmente car un faible nombre de bactéries présentes initialement dans les selles (Clostridium perfringens étant une bactérie commensale du gros intestin) pourront se multiplier de manière excessive (McDonough and Simpson, 1996). b) Bactéries ne nécessitant pas un délai de transport particulier : Escherichia coli et Salmonella spp. Les salmonelles et les différentes Escherichia coli inductrices de diarrhées ne font pas l‟objet de considérations particulières concernant le délai de transport et de traitement des échantillons. Dans la mesure du possible, il conviendra toujours d‟envoyer les échantillons au laboratoire le plus rapidement après leur récolte. Le laboratoire Idexx Alfort insiste sur le fait qu‟il est toutefois difficile de préciser exactement le délai maximal de conservation des échantillons et donc le temps dont dispose le praticien pour les envoyer au laboratoire. Il considère qu‟une fois que le prélèvement se trouve dans son milieu de transport, il doit être envoyé dans les 24 heures. Ainsi, les selles sont souvent considérées, à tort, comme des prélèvements peu fragiles. Leurs conditions de recueil et de transport ne doivent pas être négligées. Si l‟on souhaite que la coproculture puisse apporter des indications pertinentes d‟un point de vue diagnostique, les conditions de prélèvements et de transport doivent être strictes. 4. La formulation de la demande de l’examen accompagnant le prélèvement de selles : exemple du laboratoire Idexx Alfort Les procédures adéquates (modalité de transport, délai d‟acheminement,…) pour l‟envoi d‟un échantillon de selles et les techniques de mise en culture varient selon la bactérie entéropathogène suspectée. Ainsi, il est très important pour le clinicien de se renseigner sur les méthodes de récolte d‟un échantillon de selles et sur les protocoles d‟envoi pour que son échantillon soit le plus pertinent possible. Il doit aussi notifier au laboratoire quelles sont les bactéries suspectées et lesquelles doivent être recherchées en particulier. En effet, certains germes nécessitent une demande spécifique pour leur recherche, qui ne s‟effectue pas lors d‟une bactériologie de routine. Le laboratoire pourra utiliser les techniques les plus appropriées pour mettre en évidence les agents pathogènes suspectés. La procédure du laboratoire Idexx Alfort est la suivante. Les prélèvements de selles (selles fraîches datant de 24 à 48 heures maximum ou écouvillons rectaux) sont envoyés par Chronopost (envoi en 24 heures) ou sont pris en charge par un coursier (arrivée au laboratoire dès le lendemain). L‟envoi s‟effectue à température ambiante. Les prélèvements sont toutefois conservés au réfrigérateur en attendant l‟arrivée du coursier Une fois arrivés au laboratoire, un délai de 24 à 48 heures peut être observé avant l‟ensemencement des milieux. Les résultats finaux sont envoyés au praticien par la poste et par email. 79 Le laboratoire Idexx Alfort procède selon une approche « symptomatique ». En effet, il propose des « profils diarrhée » comprenant un bilan biochimique associé à une coproculture, permettant une exploration plus complète. Cela permet d‟inciter les praticiens à demander plus de coproculture que si l‟examen était proposé seul. Par ailleurs, cette approche permet d‟avoir une image plus globale de la situation et permet d‟explorer l‟association de différentes maladies (parasitisme intestinal ayant entraîné un déséquilibre de la microflore endogène bactérienne par exemple). Les prélèvements doivent être datés lors de leur envoi et accompagnés des éléments d‟anamnèse, des traitements éventuels réalisés et des hypothèses diagnostiques pour orienter les recherches. Une fois arrivés au laboratoire, les prélèvements sont traités selon un processus spécifique à chaque pathogène recherché. B. Mise en culture des prélèvements 1. L’enrichissement des prélèvements Les mises en cultures nécessitent, pour certaines bactéries, un protocole d‟enrichissement préalable, ce qui est le cas de Salmonella spp. Des milieux sélectifs d‟enrichissement à base de sélénite (définition 1), de tétrathionate (définition 2) ou des milieux Gram – (définition 3) sont recommandés (Greene, 2006 ; Willard and Marks, 2006 ; Marks and Kather, 2003). Ces milieux liquides ou solides permettent grâce à une substance à action sélective d‟obtenir en 24 heures un plus grand nombre de salmonelles par rapport à un ensemencement direct des selles. Cet aspect souligne particulièrement la nécessité de faire part au laboratoire des bactéries suspectées par le clinicien lors de l‟envoi d‟échantillons fécaux. Les milieux d‟enrichissement permettent d‟inhiber la croissance des bactéries autres que Salmonella spp., notamment les coliformes et la plupart des bactéries intestinales et laissent les salmonelles se multiplier, augmentant ainsi les chances d‟isolement (Greene, 2006). Le milieu d‟enrichissement liquide Rappaport-Vassiliadis (définition 4), tel qu‟illustré sur la figure 16, peut aussi être utilisé et serait plus performant que les milieux à base de sélénite ou tétrathionate (Waltman, 2000). Le laboratoire Idexx Alfort utilise le milieu d‟enrichissement au sélénite. 80 Figure 15 : Milieu Rappaport : Aspect du milieu avant ensemencement (gauche) et après ensemencement (droite) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) Ces milieux d‟enrichissement sont incubés à des températures de 41 à 42°C pendant 48 heures (Waltman, 2000). Des aliquotes sont ensuite inoculés sur des milieux de culture sélectifs solides. Les autres bactéries entéropathogènes (Campylobacter spp., Clostridium spp., Escherichia coli) ne nécessitent pas de phase préalable d‟enrichissement. Les enrichissements n‟améliorent pas le succès d‟isolement des campylobactéries à partir des selles par rapport à une inoculation directe d‟un milieu sélectif (Koene et al., 2004 ; Fox, 2006). 2. Ensemencement : les milieux de culture sélectifs et non sélectifs a) Salmonella spp. L‟enrichissement avant l‟ensemencement des milieux sélectifs permet d‟augmenter le nombre de salmonelles dans l‟échantillon à un niveau détectable sur le milieu de culture. Plusieurs milieux de culture sélectifs solides ont été développés pour l‟isolement des salmonelles. Ils contiennent une substance inhibitrice vis-à-vis des bactéries autres que les salmonelles. Ils contiennent également des substances permettant de différencier aisément macroscopiquement les colonies de Salmonella spp. des autres bactéries (capacité ou non à fermenter les sucres…) (Waltam, 2000). Les milieux de culture sont donc choisis à la fois pour leur capacité à favoriser la croissance des salmonelles mais aussi sur leur capacité à permettre la différenciation macroscopique des colonies de salmonelles de celles des autres bactéries (production d‟H2S, fermentation de sucres…). Il est recommandé de combiner deux milieux avec des propriétés sélectives et de différenciation différentes pour optimiser les résultats. Les milieux sélectifs conseillés sont les géloses vert brillant (définition 5), MacConkey (définition 6), illustré sur la figure 17, ou xylose lysine désoxycholate (XLD) (définition 7) (Greene, 2006 ; Willard and Marks, 2006 ; Marks and Kather, 2003). Les milieux sont ensuite incubés pendant 18 à 24 heures à 35°-37°C, 37°C étant la température de croissance optimale pour Salmonella spp.. Après isolement, les colonies sont ensuite identifiées d‟après leur aspect macroscopique, une coloration de Gram, la motilité et des réactions biochimiques et sérologiques. Les autres milieux utilisés sont les milieux SS 81 (Salmonella Shigella) (définition 8), Hektoen (définition 9) ou XLT4 (Xylose Lysine Tergitol 4). Le laboratoire Idexx Alfort utilise les milieux MacConkey et CHROMagar Salmonella, un milieu chromogène à forte sensibilité pour l‟isolement des salmonelles (inhibition des bactéries Gram + et des levures). Les colonies de salmonelles apparaissent mauves sur ce milieu. Figure 16 : Milieu McConkey : aspect du milieu avant ensemencement (gauche) et après ensemencement (droite, colonies lactose +) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) b) Campylobacter spp. L‟isolement des Campylobacter à partir d‟échantillons fécaux est réalisé par ensemencement direct sur milieux sélectifs ou par méthode de filtration sur milieux gélosés non sélectifs. Les milieux sélectifs contenant des agents antibactériens donnent de meilleurs résultats que les milieux sélectifs classiques (Marks and Kather, 2003). Les milieux sélectifs pour Campylobacter peuvent être divisés en deux grandes catégories : les milieux contenant du sang et les milieux contenant du charbon. La sélectivité dépend ensuite des antibiotiques choisis. Les céphalosporines sont en général utilisées (la céfopérazone) en combinaison avec d‟autres antibiotiques. La différence qui existe entre tous les milieux disponibles est leur capacité à inhiber la flore contaminante. Tous les agents sélectifs permettent la croissance de Campylobacter jejuni et coli. La plupart des autres espèces de Campylobacter (upsliensis, helveticus, lari…) peuvent aussi croître sur la plupart des milieux. Voici quelques exemples de milieux solides sélectifs contenant du sang : Gélose de Preston (définition10) Gélose de Skirrow (définition 11) Gélose de Butzler (milieu utilisé chez Idexx Alfort) (définition 12) Et quelques exemples de milieux solides contenant du charbon : mCCDA (milieu gélosé modifié au charbon à la céfopérazone et au désoxycholate) (définition 13) Gélose Karmali (milieu sélectif au charbon) (définition 14) Gélose CAT agar (céfopérazone, amphotéricine et teicoplanine) (définition 15) 82 Les géloses Karmali et CAT agar sont les milieux recommandés pour les espèces Campylobacter upsaliensis et Campylobacter helveticus (Koene et al., 2004). Une étude a comparé cinq méthodes de culture différentes et évalué leurs performances respectives vis-à-vis de l‟isolement des campylobactéries (Acke et al., 2009). C‟est le milieu gélosé modifié au charbon, à la céfopérazone et au désoxycholate (mCCDA) avec un supplément de céfopérazone, amphotéricine et teicoplanine (CAT) qui serait le milieu de choix pour l‟isolement de la plupart des espèces de campylobactéries présentes chez les animaux domestiques et les humains. Les milieux inoculés sont ensuite incubés en atmosphère microaérophile à une température de 42°C pour Campylobacter jejuni et coli ou 37°C pour isoler les autres espèces de campylobatéries (Marks and Kather, 2003). Des atmosphères microaérophiles avec 5 à 10% d‟oxygène, 5 à 10% de dioxyde de carbone (et 5 à 9% d‟hydrogène si possible) sont nécessaires pour une croissance optimale. Plusieurs méthodes sont disponibles pour reproduire une atmosphère microaérophile (évacuations répétées du gaz dans la jarre suivi d‟un remplacement de l‟atmosphère par des gaz en bouteille ou trousses de production de gaz commercialisées). La durée d‟incubation est variable. Elle peut aller de 2 à 6 jours selon les protocoles des différentes études épidémiologiques. Une durée d‟incubation de 48 heures est recommandée pour le diagnostic de routine. Un repiquage des colonies suspectes est ensuite réalisé sur une gélose au sang de mouton à 5% (Marks and Kather, 2003). La méthode de filtration semble beaucoup moins sensible (Koene et al., 2004). Elle évite l‟utilisation de milieux sélectifs et peut parfois être utile pour certaines espèces de campylobactéries plus sensibles aux antibiotiques. Une suspension de fèces est préparée puis déposée sur une membrane avec des pores (0,45 à 0,65 µm) préalablement placée sur une gélose au sang non sélective. Une incubation de 30 à 45 minutes à 37°C en milieu aérobie permet la migration des bactéries à travers les pores du filtre. Celui-ci est ensuite retiré, le fluide qui l‟a traversé est étalé et la boîte est incubée en atmosphère microaérophile à 37°C ou 42°C. c) Clostridium spp. L‟isolement des clostridies nécessite des milieux sélectifs (grâce à l‟action d‟antibiotiques) lorsque l‟on s‟adresse à un prélèvement polymicrobien, comme le contenu intestinal, les fèces… . En effet, leur croissance serait masquée par les autres bactéries de la flore fécale. Pour Clostridium difficile, le milieu CCFA (Cyclosérine Céfoxitine Fructose Agar) (définition 16) et ses dérivés sont les plus utilisés. Les antibiotiques inhibent la plupart des germes de la flore intestinale. Les fèces sont ensemencées en milieu anaérobie et les boîtes sont incubées à 37°C en anaérobiose pendant 48 heures. Le fait d‟utiliser des milieux préalablement incubés en anaérobiose permet d‟augmenter la sensibilité. Mais d‟une manière générale, une anaérobiose rapide augmente les chances d‟isolement. Les conditions d‟anaérobiose peuvent être réunies lors de l‟utilisation d‟une jarre ou d‟un sac en plastique fermé hermétiquement ou encore par l‟emploi de chambres anaérobies. 83 D‟autres procédés servent à augmenter la sensibilité comme ceux qui favorisent la germination des spores (techniques d‟enrichissement car elles favorisent le passage de l‟état de spore à l‟état végétatif). Deux techniques sont couramment utilisées : - L‟incorporation de taurocholate de sodium dans le milieu (1g/L) Un traitement préalable des selles à l‟éthanol (technique du choc alcoolique) : 1 ml de fèces est mélangé à 1ml d‟alcool éthylique absolu et incubé à température ambiante pendant une heure. Pour Clostridium perfringens, les milieux utilisés sont, par exemple, les géloses au jaune d‟œuf (milieu de McClung) (définition 17), visible sur la figure 18, TSC (Tryptone Sulfite Cyclosérine) (définition 18),…. L‟ensemencement et l‟incubation se font également en anaérobiose. L‟incubation se fait à la température de 37°C pendant 48 heures. Les antibiotiques utilisés dans les milieux permettent de diminuer la flore contaminante. Figure 17 : Gélose au jaune d’œuf : aspect du milieu avant ensemencement (gauche) et après ensemencement (gauche, lécithinase +) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) d) Escherichia coli Appartenant à la famille des entérobactéries comme les salmonelles, elles se développent aussi sur les milieux SS et Hektoen, illustrés par la figure 19. Les géloses MacConkey ou Drigalski sont recommandées également pour un isolement à partir de selles. L‟incubation se fait à 37°C pendant 24 heures. Des repiquages de colonies lactoses positives peuvent être réalisés (Marks and kather, 2003). La substitution du lactose par le sorbitol dans la gélose MacConkey (SMAC) est souvent utilisée pour optimiser l‟isolement des souches d‟Escherichia coli productrices de vérotoxines O157 :H7 car ces souches ne fermentent pas le sorbitol. Escherichia coli faisant partie de la flore commensale intestinale, son isolement à partir des selles ne permet pas de faire la différenciation entre des souches pathogènes et des souches non pathogènes. 84 Figure 18 : Gélose Hektoen : aspect après ensemencement (E.coli, colonies vertes) (http://www2.ac-lyon.fr/enseign/biotech/microbio/milieux.html) 3. Identification des micro-organismes isolés Une fois isolées les bactéries sont identifiées par leur aspect macroscopique sur le milieu ensemencé, leurs caractères biochimiques (kits, tests culturaux spécifiques), des réactions sérologiques (agglutination…) et des colorations. C. Les examens complémentaires à la coproculture 1. La cytologie fécale La cytologie fécale est un examen qui précède la coproculture. Elle peut en effet donner des indications à la réalisation d‟une coproculture et être utile dans le diagnostic des diarrhées infectieuses chez des patients présentant des signes de diarrhée du côlon (Matz and Guilford, 2003 ; Guilford and Strombeck, 1996, c). La présence de cellules inflammatoires, de micro-organismes facilement reconnaissables (tels que les Campylobacter spp.) et de spores (Clostridium) sont évalués par cet examen simple et peu onéreux (Tams, 2003 ; Guilford and Strombeck, 1996, c). La qualité de cet examen dépend de la méthode de récolte de l‟échantillon et de la préparation de la lame. Seule une très petite quantité de selles fraîches est nécessaire, en effet l‟étalement des selles sur la lame doit laisser une fine couche de matériel fécal. Si le frottis est trop épais la coloration ne sera pas optimale (Broussard, 2003). Les selles sont étalées à la manière d‟un frottis sanguin. On peut aussi prélever les selles à l‟aide d‟un coton tige que l‟on aura introduit dans le rectum puis que l‟on fera rouler sur la lame. La lame est ensuite séchée à l‟air libre (un sèche-cheveux peut aussi être utilisé au besoin pour accélérer le séchage) pour préserver la morphologie cellulaire. Les colorations utilisées sont des colorations rapides (Diff-Quick®) ou de Wright-Giemsa (Broussard, 2003). Les morphologies cellulaires et les bactéries sont le mieux appréciées au plus fort grossissement avec immersion. D‟autres 85 colorations peuvent être utilisées selon la suspicion du clinicien. Si une diarrhée d‟origine bactérienne est fortement suspectée une coloration de Gram sera préférée (Broussard, 2003). La cytologie fécale est un examen simple qui peut être effectué directement par le vétérinaire praticien. Si les lames sont envoyées au laboratoire certaines précautions doivent être respectées (Broussard, 2003) : 1. Envoi d‟au moins deux lames préparées mais non colorées 2. Si des colorations spéciales sont requises, envoi de deux lames supplémentaires par coloration spéciale demandée 3. Lames séchées à l‟air ambiant et fixées au méthanol 4. Identification des lames (date et identification du patient) 5. Signalement de l‟animal, signes cliniques, anamnèse, suspicions éventuelles accompagnant les lames Un grand nombre de polynucléaires neutrophiles visualisés sur le frottis de selles peut plaider pour une entérite ou une colite bactérienne (Broussard, 2003 ; Matz and Guilford, 2003 ; Guilford and Strombeck, 1996, e) et est souvent synonyme d‟une atteinte de l‟intégrité de la muqueuse de l‟épithélium intestinal (Greene, 2006). Dans ce cas, une coproculture est indiquée, surtout si la diarrhée est hémorragique. Si des leucocytes fécaux sont présents massivement au frottis lors d‟une diarrhée, une infection digestive aiguë par des salmonelles peut être suspectée (McDonough and Simpsons, 1996 ; Carter and Quinn, 2000 ; Grenne, 2006) ou d‟autres formes de diarrhée avec atteinte de l‟intégrité de la barrière intestinale. La figure 20 représente un frottis fécal avec des leucocytes. Une absence de leucocytes fécaux plaide plutôt en faveur d‟une diarrhée virale ou non spécifique (Greene, 2006). Cependant, il n‟existe aucune corrélation entre la présence de leucocytes fécaux et les résultats de la coproculture ou des tests permettant la détection de toxines bactériennes. 86 Figure 19 : Leucocytes à la cytologie fécale avec une coloration de Diff-Quik® (Broussard, 2003) Les bactéries aisément visualisées et reconnaissables, lors de cytologie fécale, sont les Campylobacter spp. Des bactéries spiralées (ou en « aile de mouette ») visualisées sur des frottis colorés réalisés à partir de selles fraîches peuvent mener à une suspicion de campylobactériose (Willard and Marks, 2006 ; McDonough and Simpson, 1996 ; Tams, 2003 ; Marks and Kather, 2003 ; Ettinger and Feldman, 2005, a). Un grand nombre de bactéries mobiles à morphologie spiralée ou en forme de « S », associé à un nombre important de leucocytes fécaux est en faveur d‟une infection digestive à Campylobacter spp. et permet ainsi d‟orienter la coproculture. Leur apparence typique permet de les identifier rapidement, cependant une confusion peut exister avec les bactéries du genre Anaerobiospirillum spp. et Helicobacter spp. qui possèdent la même morphologie (ces bactéries sont aussi appelées Campylobacter-like organisms : CLOs) (Willard and Marks, 2006 ; Broussard, 2003 ; Marks and Kather, 2003). Un frottis fécal contenant des campylobactéries est illustré avec la figure 21. Une cytologie fécale seule ne permet en aucun cas d‟établir un diagnostic de diarrhée associée à Campylobacter spp. en raison de cette possible confusion et par le fait que les chiens et chats domestiques cliniquement sains hébergent des campylobactéries dans leurs selles. Du fait de la faible spécificité de cet examen, il doit toujours être suivi d‟une coproculture. 87 Figure 20 : Cytologie fécale et bactéries Campylobacter-like (Broussard, 2003) Enfin, les endospores de Clostridium perfringens, illustrées sur la figure 22, peuvent être identifiées lors de cytologie fécale (morphologie de type « épingle à nourrice »). Leur observation est une indication à la réalisation d‟une coproculture (Guilford and Strombeck, 1996, c). Etant donné que la sporulation est corégulée avec la production d‟entérotoxine, l‟énumération de spores fécales de Clostridium perfringens (≥ 3 spores par champs à fort grossissement) dans un frottis fécal avait été suggérée comme outil diagnostique lors de diarrhée associée aux souches entérotoxinogènes de Clostridium perfringens. Cependant, plusieurs études n‟ont rapporté aucune association entre l‟énumération de spores dans les selles et la présence de la diarrhée ou entre l‟énumération de spores et la détection de l‟entérotoxine de Clostridium perfringens dans les selles. (Marks et al., 2002 ; Weese et al., 2001 ; Marks et al., 1999). Ainsi, la présence de spores n‟indique pas qu‟il y a eu sécrétion de toxines à l‟origine de la diarrhée. Par ailleurs, la sporulation des souches entérotoxinogènes est continue à la fois chez les chiens diarrhéiques et non diarrhéiques (Marks et al., 2002). L‟énumération de spores de Clostridium perfringens dans les selles n‟a donc aucune valeur diagnostique si elle est effectuée isolément de tout autre examen. 88 Figure 21 : Frottis fécal coloré (coloration de Wright modifiée) provenant d’un chat cliniquement sain et présentant de nombreuses endospores de Clostridium perfringens. Grossissement×1000 (Cook, 2008) Pour résumer, les indications potentielles de réalisation d‟une coproculture aux vues des résultats d‟une cytologie fécale sont : un nombre important de leucocytes fécaux sur des selles hémorragiques, la présence de spores de Clostridium perfringens et la présence de bactéries spiralées. Mais il faut toujours garder à l‟esprit que la cytologie fécale ne peut pas être interprétée seule et indépendamment de la coproculture en raison des limites évoquées précédemment. Une coproculture réalisée seule est difficilement interprétable en raison de la nature commensale des bactéries recherchées, mais aussi parce que ces dernières sont présentes chez des animaux cliniquement sains. Par conséquent, il peut s‟avérer nécessaire d‟envisager d‟autres examens complémentaires plus poussés afin d‟apporter plus d‟éléments en faveur d‟un diagnostic de diarrhée bactérienne. Des tests moléculaires ou immunologiques sont ainsi disponibles et réalisables en complément de la coproculture dans le cadre du diagnostic des diarrhées d‟origine bactérienne. Certains sont effectués une fois que l‟on a obtenu, à l‟aide de la coproculture, une souche bactérienne pure. 89 2. L’immunodétection des toxines Les souches entérotoxinogènes de Clostridium perfringens et Clostridium difficile produisent des toxines responsables de l‟apparition de la diarrhée par un mécanisme d‟hypersécrétion. Elles peuvent être détectées dans les selles des chiens et chats atteints de diarrhée et ainsi, couplées à la coproculture, renforcer la suspicion de diarrhée causée par ces germes. Les tests immunologiques peuvent se faire soit sur les selles, soit sur les souches bactériennes isolées par la coproculture. Toutes les souches de clostridies ne sont pas toxinogènes, il est alors essentiel de déterminer si celles isolées à la coproculture le sont ou non. a) L‟entérotoxine A de Clostridium perfringens C‟est uniquement l‟entérotoxine A qui est recherchée dans les selles lors de suspicion de diarrhée associée à Clostridium perfringens car c‟est la principale toxine produite par les souches entérotoxinogènes présentes chez les carnivores domestiques. En recherchant les toxines on évalue ainsi le potentiel toxinogène des souches de Clostridium perfringens isolées à la coproculture. L‟entérotoxine de type A peut être détectée par la méthode ELISA ou la méthode d‟agglutination passive. Les deux méthodes ont une sensibilité équivalente mais la méthode ELISA est la plus spécifique (Marks et al., 1999, Weese et al., 2001, b). Le nombre de faux positifs s‟en retrouve donc diminué avec l‟utilisation de cette dernière méthode. En effet, trois études avaient trouvé une association significative entre la détection de l‟entérotoxine A dans les selles et la présence de la diarrhée chez le chien en utilisant la méthode ELISA (Weese et al., 2001, b ; Kruth et al., 1989 ; Marks et al., 2002), alors qu‟une autre étude en utilisant la méthode d‟agglutination passive n‟avait trouvé aucune association entre ces deux paramètres (Marks et al. 1999). Comme le nombre de faux positifs était trop important avec l‟agglutination passive, les pourcentages de détection de la toxine chez les chiens atteints de diarrhée et cliniquement sains étaient globalement les mêmes. Les associations significatives trouvées entre la détection de l‟entérotoxine et la diarrhée dans ces études suggèrent un rôle causal possible de l‟entérotoxine dans l‟apparition de la diarrhée. L‟une des études précédemment citées a établi le diagnostic de diarrhée associée à une souche entérotoxinogène de Clostridium perfringens par la détection de la toxine dans les selles au cours des épisodes diarrhéiques associée à une croissance pure et massive de Clostridium perfringens isolée des selles (Weese et al., 2001, a). Un diagnostic définitif de diarrhée due à Clostridium perfringens devrait ainsi inclure la détection de l‟entérotoxine A dans les selles. L‟entérotoxine A est cependant occasionnellement retrouvée chez des chiens ne souffrant pas de diarrhée (chez 5% des chiens sans diarrhée pour l‟étude de Weese et al., 2001,b, 7% pour l‟étude de Kuth et al., 1989 et 14 % dans l‟étude de Marks et al., 2002) donnant ainsi un caractère non systématique à l‟association de la présence de la toxine dans les selles à celle d‟une diarrhée. Etant donné que le test ELISA est un test purement qualitatif, il est toutefois possible que les chiens sans diarrhée mais dont les selles contiennent l‟entérotoxine aient une quantité d‟entérotoxine trop faible pour pouvoir entraîner une diarrhée (Marks et al., 2002). 90 Un des avantages majeurs de la méthode ELISA est le temps nécessaire à sa réalisation : 3 heures contre une nuit d‟incubation pour l‟agglutination passive. L‟isolement de souches de Clostridium pefringens à partir de selles peut difficilement être interprété seul et n‟est pas un bon indicateur d‟une association existante entre la présence de la bactérie et la diarrhée (Weese et al., 2001). En effet, dans l‟étude de Weese, Clostridium perfringens a été isolé à partir des selles de 83% des chiens diarrhéiques qui avaient un résultat négatif pour la détection de l‟entérotoxine avec ELISA et chez 71% des chiens ne présentant pas de diarrhée avec un résultat négatif pour l‟ELISA. La coproculture seule n‟est donc pas fiable pour établir un diagnostic de diarrhée associée à Clostridium perfringens. Elle serait cependant utile pour exclure Clostridium perfringens comme cause de la diarrhée puisque la bactérie a été isolée chez 96% des chiens qui présentaient aussi un résultat positif à l‟ELISA. Les performances des kits ELISA pour la détection de l‟entérotoxine A dans les selles n‟ont pas été évaluées chez les animaux domestiques, malgré son utilisation courante chez plusieurs espèces animales (Marks et al., 2002 ; Marks and Kather, 2003). Les valeurs de sensibilité et de spécificité ont été évaluées pour les humains uniquement. Les résultats du test ELISA doivent donc être interprétés avec précaution. L‟utilisation du test ELISA chez les animaux domestiques est cependant considérée comme valide car l‟entérotoxine de type A n‟est pas spécifique d‟une espèce donnée et serait antigéniquement similaire entre l‟homme et le chien ou le chat (Twedt, 1997). Les faux positifs avec la méthode ELISA peuvent être expliqués par une liaison non spécifique des protéines fécales avec l‟anticorps utilisé dans le test. Quant aux faux négatifs, ils peuvent s‟expliquer par l‟altération de l‟entérotoxine par des protéases fécales avant le traitement de l‟échantillon au laboratoire, par un niveau d‟expression de l‟entérotoxine est trop faible pour pouvoir le détecter par la méthode ELISA ou encore par un effet de dilution causé par la diarrhée elle-même. Il est également possible que bien que la souche soit toxinogène, celle-ci ne sporule pas dans des conditions in vitro, rendant la détection de la toxine impossible. b) Les toxines de Clostridium difficile Clostridium difficile produit deux toxines : A (entérotoxine) et B (cytotoxine). Il existe plusieurs kits ELISA pour la détection de la toxine A seule ou pour la détection des deux toxines à la fois. Il est préférable d‟utiliser des kits ELISA qui détectent les deux types de toxines car il existe des souches productrices d‟une seule toxine (Marks and Kather, 2003). Aucun des kits ELISA disponibles en médecine vétérinaire n‟ont été validés dans l‟espèce canine ou féline. Une fois encore, les résultats doivent être interprétés avec précaution étant donné les larges valeurs de sensibilité et de spécificité chez les humains (33 à 95 % et 66 à 100 % respectivement) (Marks and Kather, 2003). Bien que la sensibilité du test ELISA soit bonne chez l‟homme et qu‟il soit utilisé couramment dans l‟espèce équine, son emploi devrait être validé sur les selles canines et félines pour être certain de s‟affranchir de variations interspécifiques. Le test de référence pour la recherche de la cytotoxine B est un test de cytotoxicité sur culture cellulaire mais il est trop onéreux, trop long (48 heures pour la confirmation d‟un résultat négatif) et nécessite une main d‟œuvre qualifiée. Une étude a 91 montré que la sensibilité du test ELISA effectué directement sur les selles de chien avait une faible sensibilité (7 à 33%) alors que la sensibilité du même test est augmentée (93%) lorsqu‟il est effectué sur les souches isolées par la coproculture (Chouicha and Marks, 2006). Les résultats de cette étude suggèrent donc que les tests ELISA disponibles en médecine vétérinaire ne sont pas adéquats pour le diagnostic des diarrhées associées à Clostridium difficile dans l‟espèce canine lorsqu‟ils sont utilisés directement sur les selles. Leur utilisation devrait se faire avec les isolats bactériens issus de la coproculture. En revanche, chez l‟homme, les tests ELISA réalisés sur les selles sont utilisés dans le diagnostic des diarrhées associées à Clostridium difficile avec une bonne sensibilité. Aucune explication réelle n‟a cependant pu être avancée pour expliquer cette différence. Le nombre important de faux négatifs lorsqu‟on utilise le test ELISA (en raison d‟une faible sensibilité) sur les selles canines est expliqué par trois facteurs importants (Chouicha and Marks, 2006) : la présence de certains inhibiteurs fécaux, la présence de protéases fécales dégradant les toxines et la présence de la toxine à des niveaux inférieurs au seuil de détection du test. Le nombre de faux positifs associé également au test ELISA sur les selles canines peut être expliqué par une liaison non spécifique de certaines protéines présentes dans les selles aux anticorps utilisés dans le test. Des études antérieures avaient cependant montré l‟existence d‟une association significative, chez le chien, entre la détection de la toxine A dans les selles et la présence de la diarrhée (Marks et al., 2002) et entre la détection des deux toxines (A et B) et la diarrhée (Weese et al., 2001, b). Les tests ELISA utilisés dans ces deux études avaient été effectués directement sur les selles. Dans l‟étude de Weese et al., 21% des chiens atteint de diarrhée étaient positifs pour le test ELISA pour les toxines A et B alors que 7% des chiens sains l‟étaient. Ceci illustre bien qu‟une mauvaise interprétation, en raison du nombre élevé de faux positifs, peut mener à des surestimations de la prévalence de Clostridium difficile en raison d‟une mauvaise spécificité d‟un test. En effet, dans ces études l‟association à la maladie est basée uniquement sur la détection des toxines dans les selles. La fréquence d‟‟isolement de Clostridium difficile dans les selles de chiens chez lesquels les toxines avaient été détectées était très faible. Ainsi, soit la coproculture était « faussement négative » (destruction du germe anaérobie conservé dans des conditions aérobies), soit le test ELISA était « faussement positif ». Ces études ont attribués leurs résultats à la dégradation du germe dans les selles (problème inhérent du délai d‟acheminement des échantillons au laboratoire associé à une mauvaise conservation) et considéraient que le test ELISA avait une très bonne sensibilité. Aucune association significative n‟est non plus rapportée entre l‟isolement de Clostridium difficile à partir des selles et la présence de la diarrhée chez le chien (Weese et al., 2001, b ; Marks et al., 2002). La coproculture seule n‟est pas fiable pour associer de manière causale la bactérie à la diarrhée en raison de l‟existence de souches non toxinogènes et d‟un portage asymptomatique de souches toxinogènes. Elle devrait ainsi être accompagnée d‟une recherche des toxines, non pas sur les selles mais sur les souches pures, isolées par la coproculture. 92 Chez le chat il existe une seule étude basée sur la détection des deux toxines dans les selles associée à la présence de la diarrhée (Weese et al., 2001, c). La coproculture était négative mais le test ELISA positif pour les deux toxines chez un chat souffrant de diarrhée aiguë. Le diagnostic de diarrhée due à Clostridium difficile a été basé sur la détection des toxines dans les selles. Dans cette étude, on peut se poser la question d‟un résultat faussement négatif de la coproculture (dégradation de la bactérie pendant l‟envoi de l‟échantillon de selles ou effet de l‟antibiothérapie réalisée antérieurement) ou un résultat faussement positif du test ELISA réalisé sur les selles du chat. c) Les toxines des Escherichia vérotoxinogènes (ECVT) Coli entérotoxinogènes (ECET) et Les toxines thermolabiles et thermostables des ECET peuvent être recherchées via leur effet cytopathogène sur les cellules (utilisation de cultures cellulaires) ou par un test ELISA (Marks and Kather, 2003). Les vérotoxines des ECVT (ou shiga-toxines STX1 et STX2) sont recherchées par évaluation de la cytotoxicité sur une lignée cellulaire particulière : les cellules Vero (cellules rénales de singe vert) (Smith et al., 1998 ; Abaas et al., 1989). Les toxines sont recherchées directement sur les souches isolées via la coproculture. Dans une étude menée chez les chats, les isolats d’Escherichia coli produisaient des vérotoxines à des titres plus élevés chez les chats souffrant de diarrhée par rapport aux souches isolées chez des chats sains (Abaas et al., 1989). Une étude menée chez des Greyhounds a également révélé une corrélation entre la présence des vérotoxines (STX1 et STX2) dans les selles et la présence de diarrhée (Staats et al., 2003). Les recherches de toxines des différents pathotypes d‟Escherichia coli ne se font pas de manière routinière dans les laboratoires d‟analyses vétérinaires mais plutôt dans le cadre d‟études épidémiologiques. En effet, les tests en culture cellulaire sont laborieux (entretien des lignées cellulaires), dispendieux et ne sont réalisables que pour des toxines ayant un effet cytotoxique. 3. Rôle de la Réaction de Polymérisation en chaîne (PCR) dans l’identification des germes entéropathogènes et des gènes codant pour des facteurs de virulence Des méthodes génomiques peuvent être utilisées pour détecter les gènes codant pour les toxines bactériennes mais aussi pour d‟autres gènes directement en lien avec le pouvoir pathogène de la bactérie. Les méthodes moléculaires permettent ainsi d‟identifier l‟agent pathogène directement dans l‟échantillon, de distinguer des souches toxinogènes de celles qui ne le sont pas et de distinguer des facteurs de virulence spécifiques à certains agents. a) Gènes codant pour des toxines bactériennes La PCR va permettre d‟identifier les souches bactériennes ayant la capacité de synthétiser la toxine, par la recherche du gène codant pour cette toxine. Elle est complémentaire des méthodes immuno-enzymatiques permettant la détection de la toxine elle-même, traduisant la production effective de la toxine. 93 i. Clostridium perfringens Le gène codant pour l‟entérotoxine de type A de Clostridium perfringens (cpe) peut être détecté par PCR directement sur les échantillons fécaux ou sur les isolats. Le fait de détecter uniquement le gène prouve que la souche est bien entérotoxinogène mais pas nécessairement que le gène est exprimé. Une étude a montré une association significative entre la détection du gène cpe par PCR et la présence de la diarrhée chez le chien (Marks et al., 2002). L‟association la plus significative était trouvée entre l‟utilisation concomitante des tests ELISA et PCR et la présence de la diarrhée (les deux tests étaient positifs pour 4% des chiens cliniquement sains contre 28% des chiens atteints de diarrhée). Des faux négatifs avec la méthode PCR peuvent cependant survenir et être dus à un nombre trop faible de souches entérotoxinogènes, non détectables. L‟approche diagnostique optimale pour une diarrhée associée à Clostridium perfringens serait de combiner la PCR et le test ELISA directement sur les isolats obtenus à la coproculture (Marks and Kather, 2003). ii. Clostridium difficile En ce qui concerne Clostridium difficile, la détection moléculaire des souches toxinogènes (détection des gènes codant pour les toxines A et B) après la coproculture n‟aurait pas d‟intérêt diagnostique chez le chien. En effet, il n‟y a pas de différence significative dans la fréquence d‟isolement des souches toxinogènes chez les chiens sains et ceux atteint de diarrhée (Marks and Kather, 2003 ; Marks et al., 2002). Chez l‟homme, la sensibilité de la PCR pour détecter le gène codant pour la toxine est de 96 à 100% sur les selles. Elle est comparable à celle du test de référence qu‟est la détection de l‟activité cytotoxique de la toxine B sur culture cellulaire. La sensibilité de la PCR sur les selles chez l‟homme rend ainsi la culture du germe facultative. Chez le chien, une étude a montré que la PCR effectuée directement sur les isolats de Clostridium difficile était une méthode diagnostique peu fiable si elle est utilisée seule (Marks et al., 2002). En effet, aucune association significative n‟a été trouvée entre la présence de la diarrhée et la détection par PCR des souches toxinogènes chez le chien (Marks et al., 2002). De plus, la corrélation entre la détection des souches toxinogènes sur les isolats (après coproculture) et la détection de toxines dans les selles était très faible avec un seul chien positif sur 12 pour les deux tests. Les possibles raisons peuvent être une faible expression des toxines ou une faible détection par les deux kits Elisa utilisés dans cette étude. Ces derniers avaient des sensibilités de 54 et 33,3%. Les faux-négatifs peuvent également expliquer ce résultat. Bien que la plupart des laboratoires vétérinaires ne proposent pas la PCR pour la recherche des gènes codant pour les toxines A et B de Clostridium difficile, cette méthode mériterait d‟être approfondie étant donné le nombre élevé de faux positifs et de faux-négatifs relatifs à l‟utilisation de tests ELISA pour l‟immuno-détection des toxines. Certains auteurs encouragent l‟utilisation conjointe de la PCR (détection des gènes codant pour les toxines A et B) et des tests ELISA (détection des toxines A et B) dans l‟investigation d‟une suspicion de diarrhée associée à Clostridium difficile (Marks and Kather, 2003). 94 Chez le chat, la PCR peut aussi être utilisée pour détecter les gènes codant pour les toxines A et B, lors d‟infection à Clostridium difficile. iii. Escherichia coli entérotoxinogènes et vérotoxinogènes De nombreux gènes impliqués dans la virulence des souches peuvent être recherchés. Nous nous intéresserons dans ce paragraphe aux gènes codant pour les toxines des ECET (toxines thermolabiles -LT- et thermostables -STa et STb-) et des ECVT (shiga-toxines ou vérotoxines 1 et 2). Une étude a comparé les fréquences d‟isolement des souches d‟Escherichia coli porteuses des gènes codant pour les shiga-toxines et les entérotoxines (technique PCR et hybridation d‟ADN) entre des chiens souffrant de diarrhée et des chiens sains (Staats et al., 2003). Une association significative entre la présence du gène stx1 (codant pour la shigatoxine STX1) et la présence de la diarrhée a été démontrée. Le gène stx2 (codant pour la shiga-toxine STX2) est présent dans des proportions similaires entre les chiens souffrant de diarrhée et les chiens sains. Les gènes codant pour les toxines (shiga-toxines et entérotoxines) sont cependant retrouvés chez des animaux avec ou sans diarrhée, montrant que les chiens peuvent être porteurs asymptomatiques de souches productrices d‟entérotoxines ou de shigatoxines. Une seconde étude a trouvé, à l‟inverse de la première, une association significative entre la présence du gène codant pour STX2 et l‟entérotoxine thermostable et la présence de la diarrhée chez les chiens (Hammermueller et al., 1995). Le gène codant pour STX1, quant à lui, était présent à des fréquences similaires autant dans les matières fécales provenant d‟animaux souffrant de diarrhée (8,9%) que celles d‟animaux sains (12,3%). Dans la majorité des études, le gène codant pour l‟entérotoxine thermolabile (elt) est détecté à une très faible fréquence ou ne l‟est pas du tout (Staats et al., 2003 ; Hammermueller et al., 1995 ; Wateson et al., 1988). Ceci s‟explique par le fait que les souches productrices d‟entérotoxines thermolabiles ne sont quasiment pas retrouvées chez les chiens sains (Beutin, 1999). Les souches ECET canines expriment la plupart du temps le gène codant pour l‟entérotoxine thermostable STa (gène estA). Les souches ECVT semblent être plus souvent associées à la diarrhée chez le chien que les souches ECET. Une étude, uniquement chez des chiens sains, a détecté la présence de souches ECET (détection du gène estA codant pour l‟entérotoxine thermostable STa) mais aucune souche ECVT (Holland et al., 1999). Les gènes codant pour les shiga-toxines et les entérotoxines ne sont cependant pas recherchés dans les selles d‟animaux en pratique vétérinaire courante, ceci est effectué uniquement dans un contexte de recherche. Les laboratoires vétérinaires ne proposent pas d‟emblée la PCR pour la recherche des gènes virulents d‟Escherichia coli dans leurs prestations. 95 b) Gènes impliqués dans la pathogénie de la diarrhée : cas des ECEP Les souches entéropathogènes d‟Escherichia coli provoquent des lésions d‟attachement-effacement sur la muqueuse intestinale. La PCR est une méthode plus sensible que l‟histopathologie pour identifier ces souches pathogènes. Les gènes impliqués dans ce mécanisme et pouvant être recherchés sont : - Le gène eaeA codant pour une intimine permettant l‟adhésion de la bactérie à l‟épithélium intestinal Le gène bfpA codant pour une protéine fimbriale permettant également l‟adhésion de la bactérie De nombreux gènes situés sur l‟îlot de pathogénicité (plasmide) contenant les gènes nécessaires à l‟établissement des lésions d‟attachementeffacement De nombreuses études épidémiologiques utilisent la PCR comme moyen de caractérisation des souches entéropathogènes après avoir isolé les bactéries à la coproculture (Morato et al., 2009 ; Nakazato et al., 2004 ; Goffaux et al., 2000 ; Holland et al., 1999 ; Drolet et al., 1994). La recherche des gènes permet de classer les Escherichia coli parmi les différents pathotypes « inducteurs de diarrhée » : entéro-hémorragiques (possession des gènes d‟attachement/effacement et des gènes codant pour les shiga-toxines), entérotoxinogènes (gènes codant pour les toxines thermostable et thermolabile), entéro-pathogènes (uniquement les gènes impliqués dans les lésions d‟attachement/effacement). Etant donné qu‟Escherichia coli est un germe commensal et que la coproculture ne permet pas de différencier les souches pathogènes des non pathogènes, les méthodes moléculaires restent le seul moyen de les identifier. Cependant, les gènes « virulents » ne sont pas recherchés en pratique, en médecine vétérinaire. c) Détection de Salmonella spp. et Campylobacter spp. par PCR Salmonella spp. La méthode PCR est utilisée pour détecter des salmonelles dans les selles canines (Greene, 2006). C‟est une méthode plus rapide que la coproculture qui peut être réalisée en deux heures. Une étude a montré que la PCR associée à l‟hybridation d‟ADN est plus sensible que la culture de selles dans la détection de Salmonella Typhimurium à partir d‟écouvillons rectaux (Stone et al., 1995). La PCR serait également plus sensible si elle est réalisée dans les trois jours post-infection. La sensibilité du test peut être augmentée en l‟utilisant non pas sur les selles ou les écouvillons rectaux, mais sur les bouillons d‟enrichissement augmentant le nombre de micro-organismes présents dans l‟échantillon (Stone et al., 1995). Les deux limites de la PCR utilisée comme outil diagnostique des diarrhées salmonelliques sont les réactions faussement positives et les réactions faussement négatives. Les faux positifs peuvent survenir lors de contamination de l‟échantillon par de l‟ADN de l‟air ambiant. Les faux négatifs 96 peuvent être dus à des substances présentes naturellement dans les échantillons fécaux inhibant le processus de polymérisation en chaîne (Stone et al., 1995). Campylobacter spp. Dans le cadre des campylobactéries la PCR est utilisée pour identifier plus précisément les espèces une fois qu‟elles ont été isolées par la coproculture. La PCR associée à l‟analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction est considérée comme un outil diagnostique utile dans l‟identification des espèces de Campylobacter spp. thermophiles (Marks and Kather, 2003). Elle serait plus fiable que les méthodes phénotypiques classiques pour l‟identification des espèces de Campylobacter spp., qui mèneraient à des caractérisations imprécises, selon une étude menée chez des animaux domestiques et sauvages (Engvall et al., 2002). Les méthodes moléculaires utilisées pour identifier les espèces et pour leur génotypage (Amplified Fragment Length Polymorphism, Restriction Fragment Length Polymorphism, techniques d‟hybridation d‟ADN, électrophorèse en champs pulsé…) sont employées dans le cadre des recherches épidémiologiques et non réalisables en pratique dans les laboratoires vétérinaires car trop coûteuses et trop longues. Elles sont particulièrement utiles pour caractériser les espèces lors de co-infection par différentes espèces de Campylobacter (Koene et al., 2009 ; Koene et al., 2004) ou par Campylobacter et Helicobacter spp. (Shen et al., 2001). Les méthodes moléculaires consistent aussi à étudier les relations et les diversités génétiques entre les différentes souches d‟une même espèce afin d‟étudier les dynamiques de transmission inter et intra-espèces (Wieland et al., 2005 ; Moser et al., 2001). Malgré la forte sensibilité et la forte spécificité des techniques moléculaires, celles-ci ne remplaceront pas les cultures conventionnelles. En effet, la PCR va pouvoir identifier la présence de l‟ADN de tel ou tel agent recherché dans l‟échantillon mais ne pourra pas déterminer s‟il est impliqué dans un processus infectieux actif. De plus, la PCR ne donne aucune indication quant à la viabilité du microorganisme car elle détecte aussi bien l‟ADN de microorganisme mort ou vivant. Une coproculture démontre clairement la viabilité d‟un agent par sa capacité à croître dans un milieu. Elle permet aussi la réalisation a posteriori d‟un antibiogramme, contrairement à la PCR. C‟est pourquoi la coproculture reste toutefois indispensable face au développement des nouvelles techniques moléculaires. La grande force de la PCR reste la possibilité de pouvoir détecter un agent présent en très faible quantité dans l‟échantillon. Elle augmente ainsi le pouvoir de détection des agents recherchés. 97 4. Le sérotypage des espèces bactériennes isolées Le sérotypage (ou sérogroupage) met en évidence les antigènes structuraux bactériens par des immuns sérums pour le diagnostic de sérovars ou sérogroupes. Les caractéristiques antigéniques vont permettre de différencier les souches au sein d‟une même espèce. Pour les salmonelles et les Escherichia coli on recherche les antigènes flagellaires (H) et somatiques (O) par des tests d‟agglutination sur lame. Les souches de Clostridium difficile sont également sérotypées par des tests d‟agglutination sur lame. Les méthodes de sérotypage des Campylobacter spp. et Clostridium perfringens sont variées et complexes. Les méthodes de sérotypages sont longues, difficiles et coûteuses. Elles ne sont réalisées que dans des laboratoires de recherche et non pas dans le cadre du diagnostic de laboratoire des diarrhées d‟origine bactérienne. Elles sont employées uniquement dans le cadre d‟enquêtes épidémiologiques pour caractériser les dynamiques de transmission des souches. 5. Les examens complémentaires proposés par le laboratoire Idexx Alfort Des tests moléculaires sont disponibles en routine dans certains laboratoires d‟analyses vétérinaires. Ainsi, Idexx Alfort propose des PCR sur selles canines ou félines pour détecter le gène codant pour l‟entérotoxine A de Clostridium perfringens ainsi que l‟ADN de Salmonella spp.. Ils sont proposés en complément de la coproculture. Cinq grammes de selles sont recommandés, envoyés dans un récipient stérile, sous couvert du froid. Des tests ELISA pour la détection de l‟entérotoxine A de Clostridium perfringens sont aussi disponibles. Les méthodes moléculaires et immunologiques ne sont pas proposées en routine pour les Campylobacter spp., les différents pathotypes d‟Escherichia coli et Clostridium difficile. D. Le compte-rendu du laboratoire Les échantillons qui ont été correctement prélevés, conditionnés et transportés au laboratoire d‟analyses vétérinaire peuvent contenir de précieux renseignements concernant la cause de la diarrhée. Cependant, l‟isolement et l‟identification d‟une bactérie dans les selles d‟un animal ne témoigne pas nécessairement de son caractère pathogène. Les résultats de la coproculture fournis par le laboratoire ne doivent pas être interprétés indépendamment du contexte clinique. Il est essentiel de les confronter aux signes cliniques mais aussi au site de collecte du prélèvement (selles récoltées sur le sol, directement à partir du côlon…), au mode de prélèvement et au mode de transport au laboratoire (Jones, 2006). Le laboratoire d‟analyse vétérinaire peut fournir plusieurs réponses au clinicien. Les éléments importants à prendre en compte sont la quantité et la pureté de croissance de la souche (Guilford and Strombeck, 1996, c). Le but est de rechercher parmi une flore commensale très abondante, soit des bactéries habituellement absentes et réputées pour leur pouvoir pathogène, soit une espèce bactérienne habituellement présente mais anormalement prédominante. Les cultures quantitatives ne sont pas réalisées et n‟ont aucune application clinique (Guilford and Strombeck, 1996, c). 98 Voici les résultats que peut fournir le laboratoire suite à la réalisation de la coproculture : 1. Flore physiologique perturbée (Person, 1982) L‟appréciation globale du déséquilibre de la flore microbienne intestinale peut se faire à l‟examen direct après coloration de Gram. Cet examen doit être interprété en fonction de l‟espèce animale, de son âge, de l‟alimentation, des commémoratifs… La perturbation de la flore physiologique peut se faire par l‟appréciation semi-quantitative du nombre de bactéries ou par la présence de certaines bactéries normalement absentes. Nombre anormal L‟examen direct n‟est pas une numération mais on peut considérer que la lecture d‟une coloration standard effectuée par un personnel compétent donne une bonne appréciation semiquantitative des populations bactériennes. Ainsi on peut observer une prolifération importante des populations bactériennes dans leur ensemble ou de certaines d‟entre elles seulement, conséquence d‟une rupture de l‟équilibre de la flore endogène intestinale. Présence de bactéries prédominant anormalement L‟examen direct après coloration peut montrer soit une prédominance marquée d‟une groupe bactérien (bacilles Gram +, Gram -, cocci Gram +, bactéries sporulées…), soit la présence d‟éléments normalement peu représentés (levures…) dont la visualisation à la coloration de Gram est anormale ou encore non représentés normalement. L‟appréciation globale du déséquilibre de la flore endogène par l‟examen direct reste un examen simple permettant d‟avoir une vue globale de la flore, mais limité, car peu précis. Elle peut être suffisante pour affirmer un déséquilibre à corriger mais n‟apporte pas la preuve de l‟étiologie bactérienne d‟une entérite ou d‟une colite. 2. Absence de croissance Le fait de ne pouvoir isoler aucune bactérie peut être interprété comme un résultat faussement négatif et résulter de nombreux facteurs incluant le mode de prélèvement de l‟échantillon, le mode de transport, un milieu de transport inapproprié, un délai de transport trop long, une antibiothérapie avant le prélèvement… Cela peut aussi résulter d‟un traitement inapproprié des prélèvements au laboratoire lorsqu‟il s‟agit de micro-organismes difficiles à cultiver et nécessitant des techniques particulières (anaérobies stricts, bactéries microaérophiles). Si les germes sont observés sur un frottis de selles (comme Campylobacter spp. par exemple) mais qu‟ils ne sont ensuite pas isolés, le mode de transport et la méthode de mise en culture devraient être réévalués (Jones, 2006). Le laboratoire Idexx Alfort indique qu‟il est très rare d‟avoir des coprocultures non interprétables dans le sens où aucune croissance bactérienne n‟est détectée. Cela arriverait dans moins de 1% des cas (sans qu‟aucune explication fiable ne soit obtenue). 99 3. Absence de germe pathogène spécifique (Jones, 2006) Il est plus pertinent de savoir que le laboratoire a orienté ses recherches sur tel ou tel germe entéropathogène mais qu‟il a été incapable de les isoler plutôt que de recevoir un rapport de résultats indiquant les micro-organismes présents à la culture. Ainsi, un rapport de résultats d‟une coproculture indiquant qu‟aucune salmonelle ou campylobactérie n‟a été retrouvée est plus utile qu‟un rapport énumérant plusieurs espèces de la flore endogène microbienne intestinale. En effet, cela indique que des techniques particulières ont été mises en œuvre par le laboratoire pour rechercher et identifier ces pathogènes dans l‟échantillon. 4. Culture bactérienne pure Le laboratoire doit indiquer si la croissance est légère, modérée ou importante. La quantification de la croissance bactérienne permet d‟aider à donner ou non une signification aux résultats (Jones, 2006). L‟interprétation des résultats de la coproculture peut également être facilitée si le laboratoire fournit une estimation globale du nombre de bactéries pathogènes par rapport à la flore endogène (Guilford and Strombeck, 1996, c et e). La croissance importante et pure d‟un germe pathogène connu ou d‟un membre de la flore endogène est significative (Guilford and Strombeck, 1996, e), d‟autant plus que le résultat du laboratoire est en adéquation avec les signes cliniques (par exemple, diarrhée profuse hémorragique et culture pure d‟un grand nombre de Clostridium perfringens). Il ne faut pas non plus oublier qu‟une forte croissance peut aussi être la conséquence d‟un transport de l‟échantillon inadéquat ou d‟un écouvillonnage trop vigoureux (Jones, 2006). Une croissance légère d‟un germe potentiellement pathogène au sein d‟une flore mixte obtenue après une méthode d‟enrichissement plaide en faveur de la flore physiologique ou d‟une inhibition par un traitement antibiotique avant le prélèvement (Jones, 2006). Ce type de résultat est souvent difficile à interpréter. Un isolement de quatre (et plus) micro-organismes aérobies est aussi en faveur d‟une flore physiologique. De tels résultats n‟ont pas de signification univoque. Si la croissance est importante et pure on procède à l‟isolement et l‟identification du germe, potentiellement responsable des symptômes. 5. Deux ou trois cultures bactériennes pures On peut considérer que l‟isolement de maximum trois germes en culture pure peut être un résultat significatif et interprétable dans un contexte clinique. 6. Antibiogramme La coproculture permet, après isolement et identification d‟un germe, la réalisation d‟un antibiogramme pour adapter le traitement spécifique de la diarrhée. Ce dernier est réalisé en pratique lorsque, à la coproculture, une population bactérienne prédominante a été isolée et qu‟elle semble dans le contexte clinique pouvoir être mise en lien avec les symptômes motifs de la demande. 100 Après avoir caractérisé la coproculture du point de vue du laboratoire, nous allons intégrer cet examen dans le contexte clinique, afin de déterminer ses intérêts et ses limites dans le cadre de la recherche de l‟étiologie infectieuse d‟une diarrhée canine ou féline. Même si l‟isolement et l‟identification des germes entéropathogènes sont longs (plusieurs étapes séquentielles se déroulant sur 3 à 4 jours), la coproculture peut présenter un intérêt pour le clinicien. Nous allons voir comment l‟utiliser. 101 102 Partie 3 : Place et intérêt de la coproculture face à une diarrhée 103 104 L‟examen bactériologique des selles a pour but idéal de permettre la mise en évidence de la ou des bactérie(s) pathogène(s) responsables de la diarrhée au sein d‟une flore complexe en sachant qu‟il existe un nombre limité de germes entéropathogènes stricts. Le diagnostic d‟une diarrhée d‟origine bactérienne ne peut se baser uniquement sur l‟isolement de germes entéropathogènes lors d‟une coproculture. En effet, l‟isolement doit être associé à des signes cliniques compatibles chez l‟animal se trouvant dans un contexte clinique évocateur. Ainsi, la signification du résultat doit être évaluée à la lumière du contexte clinique : symptômes, âge de l‟animal, statut immunitaire et conditions environnementales, que nous préciserons dans cette partie. Dans cette dernière, nous préciserons également à quel moment la coproculture doit intervenir dans le cadre de la démarche diagnostique du praticien face à une diarrhée. A. Quand demander une coproculture ? 1. Les indications de réalisation de la coproculture Les indications de la coproculture sont triples : - La recherche de la cause infectieuse d‟une diarrhée Le dépistage des porteurs sains Les enquêtes épidémiologiques L‟indication de recherche d‟une cause infectieuse d‟une diarrhée est la plus fréquente, nous allons nous intéresser plus particulièrement à cet aspect. Une coproculture doit être réalisée lors de contextes évocateurs de diarrhée d‟origine bactérienne. Nous allons les évoquer dans cette partie afin de caractériser plus précisément les indications de réalisation de la coproculture ainsi que le moment de sa mise en œuvre. a) La coproculture sur un cas isolé de diarrhée Si une diarrhée d‟origine bactérienne est suspectée chez des chiens ou des chats de particuliers et ne vivant pas en effectif, une culture de selles devrait toujours être envisagée, à condition de respecter rigoureusement les conditions de prélèvements, d‟envoi et de conditionnement des échantillons. Bien que la culture de selles nécessite plusieurs étapes se déroulant séquentiellement sur 3 à 4 jours, incluant un enrichissement, l‟inoculation d‟un milieu, une incubation puis plusieurs étapes d‟identification, elle peut être utile et riche de renseignements dans certaines occasions (Guilford and Strombeck, 1996, c). En se basant sur l‟anamnèse des éléments peuvent être utiles pour la décision d‟entreprendre une coproculture (Guilford and Strombeck, 1996, c) : - Diarrhée après exposition à des produits alimentaires susceptibles d‟être contaminés (viande crue) Diarrhée après un séjour dans un chenil ou une chatterie Diarrhée après un passage dans une exposition canine ou féline 105 - Diarrhée après contact avec un autre animal présentant les signes digestifs Diarrhée survenant sur plus d‟un animal au sein d‟un même foyer Diarrhée survenant à la fois chez l‟animal et chez le propriétaire (zoonose) La coproculture est particulièrement indiquée lorsqu‟un ou plusieurs de ces éléments sont présents. Les signes cliniques associés à une entérite ou une colite bactérienne peuvent être très variables selon les individus et la bactérie impliquée. Une diarrhée bactérienne devrait être suspectée chez les chiens ou les chats qui montrent un épisode aigu de diarrhée hémorragique du gros intestin (Guilford and Strombeck, 1996, c), parmi d‟autres hypothèses (origine virale et parasitaire). Une diarrhée associée à une hémochésie et de l‟hyperthermie sont aussi des indications à réaliser une coproculture pour Salmonella spp., et Campylobacter spp. (McDonough and Simpson, 1996), après avoir exclu, en premier lieu, l‟hypothèse d‟une parvovirose. Les résultats de laboratoire mettant en évidence un foyer infectieux (leucocytose, leucopénie,…) renforcent la suspicion et confortent la décision de réalisation d‟une coproculture (en gardant toutefois en tête l‟hypothèse d‟une parvovirose face à de tels résultats). Cependant, des signes cliniques d‟une atteinte digestive aiguë associés à des modifications de la numération blanche ne sont jamais spécifiques d‟une origine bactérienne. Il convient de replacer la coproculture parmi d‟autres examens complémentaires sur les selles tout aussi indispensables lors de suspicion d‟une cause infectieuse. Dans ce contexte clinique, il faut écarter des causes parasitaires avec une coproscopie (helminthes, coccidies, Giardia duodenalis), une parvovirose avec un test ELISA détectant les antigènes fécaux du virus. La réalisation d‟autres examens varie selon le statut clinique de l‟animal et la chronicité des symptômes (échographie abdominale, dosage de la lipase pancréatique canine ou féline, dans le cas d‟atteinte aiguë associée à une douleur abdominale et/ou des vomissements ; dosage des folates, TLI et de la cobalamine, endoscopie associée à des biopsies intestinales,…). La cytologie fécale peut également donner des renseignements précieux incitant à la réalisation d‟une coproculture (Guilford and Strombeck, 1996, c). Un nombre important de polynucléaires neutrophiles sur un frottis fécal, lors de diarrhée hémorragique plaide en faveur d‟une origine bactérienne impliquant un germe invasif (en particulier une salmonellose digestive). La visualisation de spores en forme « d‟épingle à nourrice » oriente vers une recherche de Clostridium perfringens lors de la coproculture. La présence de bactéries en forme d‟ « aile de mouette » au frottis fécal oriente vers une suspicion de campylobactériose. Si des biopsies coliques révèlent à l‟histologie une infiltration neutrophilique, des érosions et/ou des ulcérations de l‟épithélium intestinal, une colite bactérienne est également envisageable. Si les images histologiques montrent une inflammation de type pseudomembraneuse, une culture de selles recherchant Clostridium difficile ainsi qu‟une recherche des toxines associées peuvent être pertinentes (Guilford and Strombeck, 1996, c). Les cultures de selles sont également indiquées dans le cadre de suspicion de zoonoses. En effet, la majorité des agents bactériens cités ici ont un potentiel zoonotique 106 (Salmonella spp., Campylobacter spp. et Escherichia coli). Si un épisode de diarrhée survient chez un animal domestique dont l‟entourage comprend des personnes immunodéprimées ou des personnes à risques (jeunes, personnes âgées) une culture de selles est recommandée pour identifier s‟il existe un risque de santé publique, en particulier vis-à-vis de la salmonellose (Guilford and Strombeck, 1996, c). Les diarrhées de type nosocomiales sont également un contexte dans lequel la coproculture devrait être réalisée (Guilford and Strombeck, 1996, c). Les agents à rechercher dans ce contexte sont les salmonelles et Clostridium difficile. b) La coproculture lors de pathologies d‟élevage Le contexte de diarrhée survenant dans un élevage ou toute autre collectivité animale (refuge, chenil ou chatterie) modifie l‟approche diagnostique du vétérinaire. Sur un animal isolé, les examens pratiqués ont pour but, en partie, de renseigner sur la gravité de la maladie et sur ses complications éventuelles. Dans le cas d‟un groupe, on cherchera à exclure ou confirmer le plus rapidement l‟existence d‟une maladie infectieuse contagieuse. Dans la plupart des cas, si un seul animal est concerné par la diarrhée, l‟indication d‟une coproculture est discutable, à moins d‟une mauvaise réponse à l‟antibiothérapie ou s‟il existe un risque de santé publique. En revanche, lorsque plusieurs animaux sont atteints, une coproculture peut être davantage recommandée dans le but de rechercher une éventuelle cause bactérienne contagieuse. Par ailleurs, l‟identification de la cause dans un contexte d‟élevage est importante afin de permettre au professionnel de mettre en place à terme des mesures de prophylaxie (sanitaire et médicale) en parallèle d‟un traitement spécifique. En collectivité, les caractéristiques des selles et les répercussions systémiques des troubles digestifs sont peu spécifiques de l‟agent pathogène en cause (diarrhée aiguë, mortalité chez les plus jeunes, retards de croissance…). Souvent, l‟expression clinique dépend de la combinaison de multiples facteurs. Le diagnostic étiologique des diarrhées survenant dans un tel contexte est difficile. L‟utilisation d‟outils diagnostiques à bon escient (ciblage des recherches, connaissance de la sensibilité et de la spécificité des tests) permet d‟orienter le vétérinaire dans la recherche de la cause de la diarrhée au sein d‟une collectivité. Il est recommandé de réaliser des coprocultures sur plusieurs animaux dans les stades précoces de la maladie, lors de diarrhée d‟allure épidémique. Le laboratoire doit bien sûr être informé de la bactérie suspectée par le vétérinaire lors de l‟envoi des échantillons. Les bactéries les plus à risques d‟être à l‟origine d‟une épidémie dans un effectif de chiens sont Campylobacter spp. et Salmonella spp.. Une étude épidémiologique évaluant l‟association entre les agents pathogènes intestinaux et la présence de diarrhée dans une population canine d‟un refuge a révélé que la bactérie la plus fréquemment impliquée était Campylobacter jejuni (Sokolow et al., 2005). Aucune salmonelle n‟a en revanche été isolée à la coproculture. Des diarrhées dues à Campylobacter spp. ou Salmonella spp. doivent être suspectées si la collectivité est nourrie à base d‟aliments non industriels (carcasses de poulet décongelées par exemple) ou s‟il y a eu plusieurs avortements dans l‟élevage (notamment pour Salmonella 107 spp.) ou encore s‟il existe des troubles digestifs chez l‟éleveur ou dans sa famille. Les causes bactériennes étant plutôt secondaires il convient d‟éliminer en premier lieu les causes parasitaires, virales et alimentaires, qui sont plus représentées dans un contexte de collectivité. La surveillance d‟une infection par des mises en culture de selles peut être un excellent moyen d‟évaluer les bonnes pratiques d‟hygiène au sein d‟un chenil car la contamination se fait par exposition aux selles infectées. De plus, étant donné le potentiel zoonotique (notamment Campylobacter spp., Salmonella spp.), il peut être intéressant de pratiquer des coprocultures sur des chiens provenant de chenils ou refuges (atteints de diarrhée ou non) avant une adoption. Les pressions infectieuses étant plus importantes dans les chenils, chatteries ou refuges, tout évènement provoquant une altération de l‟homéostasie intestinale (stress, changement de diète, maladies intercurrentes, parasitisme…) pourra entraîner une épidémie de diarrhée infectieuse. c) La coproculture lors de diarrhée aiguë ou chronique Lors de diarrhée aiguë, la coproculture peut avoir un délai de réponse supérieur à la résolution des symptômes, rendant sa réalisation peu utile pour le traitement de l‟animal atteint. Elle présente cependant un intérêt si elle est effectuée à visée épidémiologique et s‟il existe un risque de santé publique (risques zoonotiques). Par exemple, même si les diarrhées associées à Campylobacter spp. sont généralement spontanément résolutives, le potentiel zoonotique élevé de cette bactérie nécessite la réalisation d‟une coproculture et l‟instauration d‟une antibiothérapie spécifique (Willard and Marks, 2006). Lors de diarrhée chronique la coproculture doit être réalisée avant la mise en place d‟un traitement et en particulier d‟une antibiothérapie. La coproculture est considérée, à tort comme un examen de seconde intention. Elle devrait être réalisée bien au contraire en première intention : un traitement antibiotique juste avant la coproculture rendra impossible une bonne interprétation des résultats. Cependant les diarrhées chroniques bactériennes sont beaucoup plus rares que les diarrhées aiguës d‟origine infectieuse. Selon le laboratoire Idexx Alfort, la principale motivation des vétérinaires qui leur demandent des coprocultures est la recherche d‟une cause bactérienne face à une diarrhée chronique qui ne rétrocède pas au traitement symptomatique, avec élimination au préalable des causes extra-digestives. La coproculture est donc encore considérée comme un examen complémentaire de seconde intention. 108 2. À quel moment demander une coproculture ? L‟interprétation des résultats de la coproculture doit tenir compte du moment de la réalisation de l‟examen. La réalisation et l‟interprétation de cet examen doit toujours prendre en compte le stade de la maladie, la date d‟apparition des symptômes et le mode d‟apparition aigu ou chronique. a) Stade de la maladie Les selles doivent, en général, être soumises dans les phases initiales de la maladie, c‟est-à-dire très tôt après le début de la diarrhée, car au fur et à mesure que la maladie progresse, le nombre de germes pathogènes décline dans les selles et leur isolement devient plus difficile (Guilford and Strombeck, 1996, c). Il est conseillé de récolter trois échantillons consécutifs dans le stade aigu de la maladie, soit les trois premiers jours. b) Maladie aiguë ou chronique Lors de diarrhée aiguë, la plupart des affections digestives sont de durée limitée et le praticien amorce souvent d‟emblée un traitement symptomatique qui favorise la résolution des symptômes (diète hydrique, usage d‟un régulateur du transit et d‟un pansement gastrointestinal). L'émission dans les selles de certaines bactéries agents de diarrhées aiguës peut être très brève et souvent les coprocultures sont réalisées trop tard. Selon l‟état général de l‟animal ou après un échec du traitement initié, des examens complémentaires dont la coproculture peuvent être nécessaires afin d‟identifier la maladie causale. Les diarrhées chroniques bactériennes sont beaucoup moins fréquentes que les diarrhées aiguës bactériennes. Les coprocultures doivent être répétées, dans ces cas précis, car les animaux peuvent être excréteurs intermittents. Dans les cas de diarrhée chronique intermittente à Clostridium perfringens, les selles doivent être prélevées quand la diarrhée est présente car l‟entérotoxine n‟est excrétée que lors des phases symptomatiques (Leib, 2008, a). Concernant Salmonella spp., les animaux peuvent être des porteurs sains après une infection et les coprocultures peuvent être positives de manière intermittente pendant une période pouvant aller jusqu‟à six semaines. Il est donc important de réaliser au moins trois cultures pour confirmer un résultat négatif. c) Traitements antibiotiques Si une antibiothérapie a été instaurée avant l‟envoi de selles pour une coproculture il faut respecter un délai de minimum une semaine d‟arrêt des antibiotiques avant l‟envoi de l‟échantillon au laboratoire. La réalisation d‟une antibiothérapie avant la coproculture représente une des limites essentielles de cet examen chez le chien et le chat. A tort, il est considéré comme un examen de seconde intention alors qu‟il devrait être envisagé en première intention dès que le contexte clinique s‟y prête. 109 B. Intégration des résultats de la coproculture fournis par le laboratoire dans un contexte clinique donné : application à chaque germe entéropathogène Les bactéries entéropathogènes considérées dans cette étude sont présentes à la fois chez des chiens et chats sains (animaux porteurs asymptomatiques ou micro-organismes de la flore endogène intestinale) et chez des chats et chiens atteints de diarrhée. Leur isolement lors de coproculture doit alors être interprété avec le contexte clinique pour ne pas leur attribuer abusivement la cause de la diarrhée. Les bactéries peuvent devenir pathogènes et être responsables des troubles digestifs observés lorsque plusieurs facteurs de risques sont présents. L‟identification de ces facteurs de risques pouvant amener à une suspicion d‟entérocolite bactérienne et l‟intégration des résultats de la coproculture dans le contexte clinique permettra d‟attribuer ou non de manière pertinente la cause de la diarrhée à la bactérie isolée, c‟est-à-dire de donner une signification pathologique à la bactérie isolée. Pour conclure à la virulence d‟une souche, il faut donc s‟entourer d‟un certain nombre de garanties, à savoir : - Que le malade présente certains symptômes de l‟infection dont on cherche la preuve - Que les échantillons biologiques ont été correctement prélevés et transmis au laboratoire (avec une précaution particulière pour les bactéries anaérobies en évitant l‟exposition des prélèvements à l‟air) - Que les échantillons biologiques renferment une espèce bactérienne considérée toujours pathogène (ce qui est une éventualité assez rare) - Ou lorsque l‟on y trouve des espèces pathogènes opportunistes, penser que leur présence n‟est significative que : o Si les germes sont recherchés dans un contexte clinique ou épidémiologique évocateur o Si ces germes sont très abondants à l‟examen microscopique du produit fraîchement prélevé et non contaminé o Si ces germes sont très abondants à l‟isolement, sans usage de milieux sélectifs et sans utilisation de méthodes d‟enrichissement o S‟ils sont découverts dans un habitat qui n‟est pas le leur o Si ces bactéries sont retrouvées plusieurs fois chez le même malade o Et, a fortiori, lorsque plusieurs de ces conditions sont réunies Nous allons donc préciser les facteurs de risques propres à chaque bactérie et les contextes cliniques permettant de suspecter leur implication dans la diarrhée. Ces éléments plaideront en faveur d‟une réalisation d‟une coproculture. Les résultats devront être interprétés en tenant compte de ces derniers. 110 1. Clostridium spp. Les caractéristiques cliniques menant à une suspicion de diarrhée due à Clostridium spp. sont (Guilford and Strombeck, 1996, a ; Willard and Marks, 2006) : - Episode aigu de diarrhée hémorragique (avec une atteinte colique préférentielle) ou diarrhée du côlon chronique intermittente chez le chien ou le chat, Patients hospitalisés : épidémies de diarrhées nosocomiales (stress d‟une hospitalisation et d‟une chirurgie) Evènements menant à un déséquilibre de la flore commensale : antibiothérapie, changement brutal de régime alimentaire, maladies intestinales concomitantes (parasitisme, parvovirose,…), … favorisant secondairement une sporulation massive des formes végétatives commensales et une libération de toxines. Il existe une entité particulière chez le chien : l‟entérite hémorragique aiguë associée à la fois à Clostridium perfringens et à Clostridium difficile (Leib, 2008, a). Elle atteint les chiens de tout âge, mais en particulier les jeunes adultes (2-4 ans). Les petites races et les races miniatures semblent prédisposées. On suspecte un trouble de la perméabilité intestinale aggravé par la présence des toxines clostridiennes, mais la cause véritable demeure encore inconnue. Une diarrhée hémorragique aiguë, profuse et d‟odeur fétide est compatible avec ce syndrome, associée à une hémoconcentration. Des vomissements et de l‟anorexie peuvent aussi être observés. L‟animal entre en quelques heures en état de choc hypovolémique, qui peut conduire à la mort si la déshydratation n‟est pas combattue. A l‟autopsie, une entérite hémorragique nécrosante est observée associée à une lymphadénomégalie mésentérique. Le diagnostic différentiel doit évoquer d‟emblée une parvovirose. De plus, les chiens atteints de parvovirose présentent fréquemment une prolifération secondaire de clostridies dans leur tube digestif. L‟âge n‟apparaît pas être un facteur de risque chez le chien et le chat contrairement aux campylobactérioses et aux salmonelloses digestives. Le diagnostic d‟une diarrhée à Clostridium perfringens doit reposer sur l‟association des critères suivants (McDonough and Simpson, 1996): - Diarrhée aiguë hémorragique de l‟intestin grêle ou du côlon ou diarrhée chronique intermittente du côlon Spores de Clostridium perfringens retrouvées à la cytologie fécale Culture massive de Clostridium perfringens à partir des selles Entérotoxines retrouvées dans les selles Pour Clostridium difficile il repose uniquement sur les signes cliniques associés à la culture de la bactérie à partir des selles et la détection des toxines A et B. La coproculture possède un intérêt diagnostique plus grand par rapport à Clostridium perfringens, étant donné que les taux d‟isolement sont plus faibles chez les animaux cliniquement sains (de 0 à 40% pour Clostridium difficile contre plus de 80% pour Clostridium perfringens). De plus, un résultat négatif rend moins probable une infection à Clostridium difficile. 111 2. Campylobacter spp. Les facteurs de risques d‟une campylobactériose sont (Ettinger and Feldman, 2005, a) : - - - le jeune âge (animaux de moins d‟un an). Une association significative entre l‟isolement de Campylobacter lors de culture des selles et la présence de la diarrhée est présente uniquement chez les jeunes chiens (Burnens et al., 1992), la présence d‟infections intestinales concomitantes (parvovirose, giardiose, salmonellose, pouvant jouer un rôle synergique et aggraver les signes cliniques) (Willard and Marks, 2006), une antibiothérapie préalable, de mauvaises conditions d‟hygiène environnementale un séjour en chenil ou chatterie (source de stress et pression infectieuse plus grande) Les caractéristiques cliniques sont une diarrhée du côlon, aiguë, muco-hémorragique associée à un abattement, une anorexie et des vomissements. Le diagnostic repose sur la conjonction des éléments suivants : les signes cliniques, la présence des facteurs de risques cités précédemment, la présence de leucocytes fécaux et de bactéries en « aile de mouette » à la cytologie fécale, l‟isolement de Campylobacter spp. à partir des selles. 3. Salmonella spp. Certains facteurs de risques sont similaires à ceux des campylobactéries (McDonough and Simpson, 1996 ; Greene et al., 2008, b) : - Le jeune âge Un séjour en chenil ou chatterie récent Diète à base de viande crue, chasse (oiseaux sauvages…) Une hospitalisation (diarrhées nosocomiales) Tout stress associé à un changement de diète, un voyage, une hospitalisation, des maladies digestives intercurrentes, un traitement immunosuppresseur, une infection par des rétrovirus (chats),… La diarrhée est de type aigu, hémorragique associée à de l‟hyperthermie, une anorexie, une douleur abdominale et des vomissements. Le diagnostic d‟une salmonellose digestive repose sur la présence de symptômes évocateurs (diarrhée aiguë accompagnée d‟une leucocytose ou d‟une leucopénie et d‟une hyperthermie) associés aux facteurs de risques précédemment cités et à un isolement de Salmonella spp. à partir des selles (et éventuellement la présence d‟un grand nombre de leucocytes fécaux à la cytologie). Cependant les chiens et les chats peuvent être porteurs chroniques asymptomatiques. Ainsi, dans les cas de diarrhée chronique avec un résultat de 112 coproculture positif pour Salmonella spp., la signification à donner à la présence de salmonelles est difficile car le vétérinaire doit déterminer si la salmonelle isolée est responsable de la diarrhée ou si la diarrhée survient chez un animal porteur asymptomatique (McDonough and Simpson, 1996). 4. Escherichia coli Les éléments en faveur de la réalisation d‟une coproculture pour recherche d‟Escherichia coli sont : une diarrhée aiguë aqueuse ou hémorragique, un grand nombre de leucocytes fécaux à la cytologie. Le jeune âge représente aussi un facteur de risque vis-à-vis d‟une infection à d‟Escherichia coli. Le tableau clinique prédominant dû à une infection par des Escherichia coli productrices de toxines est une diarrhée aiguë profuse aqueuse ou hémorragique, de l‟intestin grêle. Les ECVT induisent généralement des colites hémorragiques. Cependant, le diagnostic clinique d‟une colibacillose digestive est quasiment impossible. Peu de facteurs de risques ont été identifiés dans le cadre des diarrhées dues à Escherichia coli. Seul l‟âge serait un facteur de risque pour les souches ECET et les ECEP (Marks and Kather, 2003 ; Leib, 2008, b). Les séjours en chenils ou chatterie seraient aussi un facteur de risque (Guilford and Strombeck, 1996). La coproculture ne présente pas un grand intérêt diagnostique étant donné qu‟elle ne différencie pas les souches pathogènes des germes commensaux. Son intérêt réside seulement dans l‟apport d‟isolats pour l‟application de techniques moléculaires (PCR, hybridation d‟ADN, sérotypages…) qui mettent en évidence les facteurs de virulence (toxines, facteurs d‟adhésion, gènes codants pour ces éléments). Actuellement ces techniques ne peuvent être effectuées que dans des centres très spécialisés. La détection d‟un grand nombre de bacilles à Gram négatif dans les selles à l‟examen direct ainsi qu‟une culture pure d‟E.coli à partir des selles chez un animal présentant une diarrhée aqueuse profuse ou hémorragique ne permet qu‟une suspicion d‟entérite colibacillaire. Le diagnostic définitif nécessite obligatoirement le recours aux techniques moléculaires, non disponibles et réalisables en pratique quotidienne. Ainsi, dans certaines circonstances, la coproculture ciblée pour la recherche de germes entéropathogènes spécifiques, revêt un intérêt diagnostique. L‟antibiogramme qui la suit, selon les résultats, pourra permettre une antibiothérapie adéquate et ciblée. 113 C. Guide pratique pour le diagnostic des diarrhées bactériennes chez le chien et le chat 1. Clostridium perfringens La coproculture réalisée seule n‟a pas de grand intérêt diagnostique car il s‟agit d‟une bactérie commensale du gros intestin et qui est retrouvée chez plus de 80% des chiens cliniquement sains. La symptomatologie va d‟une entérite hémorragique très grave à une diarrhée bénigne spontanément résolutive du côlon ou de l‟intestin grêle. Le seul dénombrement des endospores sur un frottis fécal n‟est pas fiable pour établir un diagnostic (aucune association entre le nombre d‟endospores et la détection de l‟entérotoxine et entre le nombre d‟endospore et la diarrhée n‟a pu être établie). La détection de l‟entérotoxine dans les selles par ELISA doit obligatoirement accompagner la coproculture pour détecter les souches entérotoxinogènes. L‟entérotoxine est labile : la soumission de l‟échantillon de selles doit se faire le plus rapidement possible (risque de faux négatifs). Des précautions doivent être prises dans l‟interprétation du test ELISA qui n‟a pas été validé dans l‟espèce canine (seulement dans l‟espèce humaine). L‟approche diagnostique optimale pour une diarrhée due à Clostridium perfringens est l‟association de l‟ELISA (détection de la toxine) et de la PCR (détection des gènes codant pour l‟entérotoxine). L‟utilisation de la PCR seule est insuffisante pour un diagnostic car 30% des souches « PCR-positives » sont « ELISA-négatives » (non production de la toxine). 2. Clostridium difficile La coproculture peut avoir un intérêt diagnostique car les fréquences d‟isolement chez les animaux sains sont faibles (0 à 40%). Une culture négative permet d‟exclure une infection à Clostridium difficile. La symptomatologie va d‟une entérite hémorragique très grave à une diarrhée bénigne spontanément résolutive du côlon ou de l‟intestin grêle. La détection des toxines A et B dans les selles par ELISA doit obligatoirement accompagner la coproculture pour détecter les souches toxinogènes. L‟interprétation des tests ELISA peut parfois être difficile étant donné le nombre élevé de faux positifs (tests non validés dans les espèces canines et félines). Le recours à la PCR pour la détection des gènes codant pour les toxines, contrairement à Clostridium perfringens, n‟améliore pas les performances diagnostiques. 114 3. Campylobacter spp. Le diagnostic repose sur la conjonction des signes cliniques, de l‟anamnèse, de la coproculture et de la réalisation d‟une cytologie fécale L‟isolement de Campylobacter spp. sur des milieux spécifiques, chez des chiens et chats souffrant de diarrhée, doit tenir compte du fait qu‟il est aussi isolé très fréquemment chez des animaux cliniquement sains. Les symptômes sont, très souvent, représentés par une colite hémorragique. La bactérie est très fréquente chez les jeunes chiens et chats (<1 an), vivant dans des milieux à risques (chenils ou chatteries) et est, dans cette tranche d‟âge, associée de manière significative à la diarrhée. La cytologie fécale n‟est pas spécifique car d‟autres bactéries possèdent la même morphologie que Campylobacter spp. (Helicobacter spp.,…). Elle doit toujours être suivie d‟une coproculture. Le recours à la PCR permet de différencier les différentes espèces de campylobactéries et permet d‟améliorer les connaissances sur sa transmission et son pouvoir pathogène. La PCR seule, chez des chiens et chats souffrant de diarrhée ne permet pas de confirmer un diagnostic de diarrhée associée à Campylobacter spp.. 4. Salmonella spp. Les fréquences d‟isolement des salmonelles sont plus importantes chez les animaux domestiques consommant de la viande crue (60%). Les jeunes animaux sont les plus sensibles. Chez l‟adulte sain, une salmonellose digestive clinique est plus rare. Le diagnostic est basé sur les signes cliniques, l‟anamnèse, les résultats de laboratoires (hématologie), la présence de leucocytes fécaux et l‟isolement de la bactérie à partir des selles sur des milieux de culture spécifiques. Le recours à la PCR est de plus en plus courant dans les laboratoires vétérinaires. 115 5. Escherichia coli La coproculture seule est inutile car elle ne différencie pas les souches pathogènes des souches non pathogènes et car Escherichia coli fait partie de la flore commensale. Les ECET et les ECEP apparaissent être associées à la diarrhée chez les jeunes animaux uniquement. La coproculture permet uniquement de fournir des isolats pour l‟application de méthodes moléculaires pour la recherche de facteurs de pathogénicité. La détection des toxines (thermostables, thermolabiles et vérotoxines) ainsi que la détection des gènes codant pour les toxines ou pour d‟autres facteurs de virulence sont indispensable, mais non réalisables en pratique. La PCR est la méthode la plus efficace pour identifier les souches pathogènes d‟Escherichia coli. CONCLUSION : Il existe ainsi plusieurs limites à la coproculture. Premièrement, certaines bactéries sont fragiles et difficiles à mettre en culture. Les conditions de transport, le conditionnement des échantillons doivent être soignés. Deuxièmement, le temps incompressible de la culture qui diffère les résultats et son coût (en contexte d‟élevage) représentent d‟autres limites. Par ailleurs, si un germe est isolé, est-il la cause ou la conséquence de la diarrhée ? A-t-il un caractère pathogène ? Ce sont des questions que le praticien doit toujours se poser face aux résultats. Enfin, la coproculture ne peut être considérée comme seul examen d‟exploration des diarrhées bactériennes (sauf dans le cas de Salmonella et Campylobacter spp. où elle peut être se suffire à elle-même). La coproculture est très souvent associée aux méthodes moléculaires et immunologiques. La réalisation d‟une coproculture est indiquée dans le cas d‟une diarrhée survenant après un séjour en chenil, chatterie ou après des fréquentations d‟exposition canine ou féline. Elle est également indiquée après un épisode aigu de diarrhée hémorragique, mais toujours après avoir écarté d‟autres hypothèses plus probables telles qu‟une parvovirose. En revanche, lors de diarrhée chronique, les causes bactériennes étant moins fréquentes, elle serait dans ce cas moins indiquée. Si la diarrhée chronique demeure toutefois résistante à tout traitement et lorsque les causes extra-digestives ont été éliminées, la coproculture peut être indiquée. Lorsque plus d‟un animal est touché au sein d‟un même foyer ou lorsqu‟il existe un risque de santé publique une coproculture est également indiquée. Enfin, une recherche orientée spécifiquement vers des germes particuliers (Salmonella spp., Campylobacter spp., Clostridium spp., Escherichia coli), représente une indication de coproculture. 116 CONCLUSION La diarrhée est un motif de consultation fréquent en médecine vétérinaire. Les causes de diarrhée sont nombreuses, aussi bien extra-digestives que digestives. Les causes infectieuses de diarrhée, particulièrement bactériennes, peuvent être difficiles à diagnostiquer et font rarement l‟objet d‟une recherche spécifique. C‟est pourquoi il m‟a paru intéressant d‟étudier la coproculture comme outil diagnostique des diarrhées bactériennes canines et félines et de préciser ses intérêts et ses limites. La culture de selles est la méthode la plus commune pour identifier un germe entéropathogène. Il est toutefois difficile de prouver qu‟un germe entéropathogène isolé en coproculture est la cause primitive d‟une diarrhée chez le chien et le chat. C‟est la raison pour laquelle cet examen ne devrait pas être réalisé seul. Les méthodes moléculaires d‟identification des facteurs de virulence et les méthodes immunologiques visant à typer les souches et rechercher des toxines permettent d‟explorer plus finement le lien de causalité entre la présence d‟une bactérie et la diarrhée. De notre travail, il ressort un point essentiel : la frontière est mince entre une souche entéropathogène et une souche commensale. Toutes les bactéries présentées dans notre travail sont très souvent présentes chez le chien et le chat cliniquement sains. Escherichia coli et Clostridium spp. font par exemple partie de la flore commensale intestinale. Pourtant, elles peuvent se révéler pathogènes lorsque l‟équilibre fragile et dynamique du tractus digestif est altéré. C‟est ce dernier qui module la virulence de nombreuses espèces bactériennes et influence le passage du statut de porteur sain à celui de malade. Ainsi, retrouver des bactéries dans des selles dans un contexte d‟entérite amène à s‟interroger sur le rôle exact de celles-ci dans la genèse de la maladie. Ce travail a permis de définir les contextes dans lesquels une coproculture est indiquée (diarrhée contagieuse dans un effectif, diarrhée aiguë hémorragique avec répercussions sur l‟état général non due à un parvovirus, diarrhée chronique rebelle à tout traitement, suspicion de zoonose et recherche ciblée de certains germes dans des situations particulières). Il a également expliqué comment interpréter cet examen en le replaçant dans un contexte clinique donné. Il a enfin permis de préciser les exigences pour la récolte, le conditionnement et le transport des échantillons de selles afin d‟optimiser les performances diagnostiques de l‟examen. L'étude bactériologique des selles est techniquement délicate. Le non respect des conditions opératoires peut conduire à des résultats faussement négatifs ou positifs. Une limite de la coproculture est qu‟elle ne permet d‟identifier que des bactéries intraluminales. La colite histiocytaire, encore récemment considérée comme une affection inflammatoire idiopathique, est en fait due à une colonisation de la muqueuse par des souches adhérentes et invasives d‟Escherichia coli. Ces souches ne peuvent pas être mises en évidence par coproculture. La découverte de leur implication a été permise grâce à une méthode moléculaire, l‟hybridation fluorescente in situ et la mise en culture de biopsies coliques. Les souches d‟E. coli impliquées sont génétiquement proches de celles incriminées dans la maladie de Crohn chez l‟homme. Certaines maladies actuellement classées comme 117 inflammatoires idiopathiques pourraient en réalité être d‟origine bactérienne. Le rôle des bactéries associées à la muqueuse intestinale dans les entéropathies chroniques reste encore à définir. 118 LISTE DES DEFINITIONS Définition 1 : Milieu d‟enrichissement au sélénite : gélose à base de sélénite cystéine pour l‟enrichissement de Salmonella spp. enrichie avec de l‟eau peptonée tamponnée (EPT). Composition : tryptone, lactose, Na2HPO4, hydrogénosélénite de sodium (4 g) et L-Cystine. Définition 2 : Milieu d‟enrichissement au tétrathionate : bouillon d‟enrichissement de Salmonella spp.. Composition : tryptone-peptone de soja-bile de bœuf-vert brillant-chlorure de sodiumthiosulfate-tétrathionate-sodium-potassium-iodure-carbonate de calcium. Quatre-vingt deux grammes de poudre de base est dissoute par ébullition, on y ajoute 20 ml d‟une solution iodoiodurée (dissolution de l‟iode dans l‟iodure) et 9,5 ml de solution de vert brillant à 1 gramme par dm3. Les sels biliaires et le vert brillant inhibent principalement le développement des bactéries Gram +. Définition 3 : Milieu d‟enrichissement Gram - : composé de citrate de sodium et de désoxycholate de sodium comme agents sélectifs. Le milieu est moins spécifique pour Salmonella spp. et peut convenir pour les Shigella. Définition4 : Milieu d‟enrichissement de Rappaport-Vassiliadis : milieu liquide dont les substances le rendent très sélectif, permettant un enrichissement en salmonelles. Composition : tryptone, NaCl, MgCl2 anhydre et vert de malachite. Définition 5 : Gélose vert brillant : milieu hautement sélectif recommandé pour l‟isolement de Salmonella spp. directement à partir des selles mais aussi à partir de bouillons d‟enrichissement. L‟agent sélectif est le vert brillant et les agents permettant la différenciation des colonies sont le lactose et le saccharose dont l‟utilisation est révélé par l‟indicateur coloré : le rouge phénol. Les colonies de salmonelles sont rouges entourées d‟un halo rouge vif (lactose -). Les colonies lactoses + et/ou saccharoses + sont jaunes. Définition 6 : Gélose MacConkey : milieu sélectif pour l‟isolement des bacilles Gram – (Salmonella, Shigella et quelques coliformes) dans les eaux, produits alimentaires, produits pharmaceutiques et biologiques. Le milieu contient des inhibiteurs de la flore Gram + : les sels biliaires et le cristal violet. Le caractère recherché est la fermentation du lactose révélé par le virage de l‟indicateur coloré du milieu : le rouge neutre. Les colonies lactose + sont rouges entourées d‟un halo opaque rouge. Les colonies lactose – (la plupart des salmonelles) sont jaunes à incolores. 119 Définition 7 : Gélose XLD (Xylose Lysine Désoxycholate) : milieu sélectif utilisé pour l‟isolement des entérobactéries pathogènes (Shigella et Salmonella spp.). L‟agent sélectif est de le désoxycholate de sodium (inhibition de la flore contaminante Gram +) et les agents de différenciation sont le xylose, le lactose, le saccharose, la lysine et un système de détection de production d‟H2S. Les salmonelles sont xylose + mais lactose - et saccharose -, décarboxylent la lysine (possession de lysine décarboxylase) et produisent ou non de l‟H2S. Les colonies apparaissent rouges avec un centre noir (LDC + et H2S +) ou rouges (LDC + et H2S -). Les colonies lactose + et saccharose + sont jaunes. Définition 8 : Gélose SS (Salmonella Shigella) : milieu sélectif permettant l‟isolement d‟entérobactéries pathogènes. Il est très utilisé pour la recherche de salmonelles dans les denrées alimentaires ou dans les selles. Le milieu contient trois inhibiteurs : sels biliaires, vert brillant et citrate de sodium. Ils empêchent la pousse de toute bactérie Gram + et rendent difficile la croissance des autres bactéries Gram – autres que Salmonella et Shigella. Les éléments permettant la différenciation des salmonelles sont la fermentation du lactose et le thiosulfate pouvant donner du H2S. Les salmonelles donnent des colonies incolores (lactose -) à centre noir (H2S +). Un inconvénient majeur de ce milieu est la présence de faux-positifs (colonies de Proteus spp.). Définition 9 : Gélose Hektoen : milieu d‟isolement des salmonelles et des shigelles. L‟identification d‟entérobactéries pathogènes repose sur la non utilisation des glucides présents dans le milieu (la salicine, le saccharose et le lactose) et la production d‟H2S à partir du thiosulfate. Les colonies de salmonelles apparaissent bleu-vert à centre noir. Un inconvénient majeur de ce milieu est la présence de faux-positifs (colonies de Proteus spp.). Définition 10 : Gélose de Preston : milieu sélectif pour isolement de Campylobacter spp. C‟est une gélose nutritive composée de : 5% de sang de cheval lysé, 10 mg/L de triméthoprime, 5000 UI/L de polymyxine B, 10 mg/L de rifampicine et 100 mg /L d‟actidione. Définition 11 : Gélose de Skirrow : milieu sélectif pour isolement de Campylobacter spp. C‟est une gélose composée de : 7% de sang de cheval lysé, 5 mg/L de triméthoprime, 2500 UI/L de polymyxine B et de 10 mg/L de vancomycine. Définition 12 : Gélose de Butzler : milieu sélectif pour isolement de Campylobacter spp. Gélose au thioglycolate contenant 10 % de sang de mouton, 15 mg/L de céfalotine, 10 000 UI/L de colistine, 25 000 UI/L de bacitracine et 50 mg/l d‟actidione. 120 Définition 13 : Gélose mCCDA (modified Cefoperazone Charcoal Deoxycholate Agar): milieu sélectif pour isolement de Campylobacter spp. Gélose nutritive contenant de l‟hydrolysat de caséine, 4 g/L de charbon, 0,25 g/L de FeSO4.7H2O, 0,25 g/L de pyruvate de sodium, 32 mg/L de céfopérazone, 1000 mg/L de désoxycholate de sodium et 10 mg/L d‟amphotéricine B. Définition 14 : Gélose Karmali : milieu sélectif pour isolement de Campylobacter spp. Gélose Columbia contenant 4 g/L de charbon, 0,32 g/L d‟hématine, 0,1 g/L de pyruvate de sodium et 32 mg/L de céfopérazone. Définition 15 : Gélose CAT (Céfopérazone Amphotéricine Teicoplanine) : milieu sélectif pour isolement de Campylobacter spp. Gélose nutritive contenant de l‟hydrolysat de caséine, 4 g/L de charbon, 8 mg/L de céfopérazone, 4 mg/L de teicoplanine, 1000 mg/L de désoxycholate de sodium et 10 mg d‟amphotéricine B. Définition 16 : Milieu CCFA (Cyclosérine Céfoxitine Fructose Agar) : milieu sélectif utilisé pour l‟isolement de Clostridium difficile. Il peut être à base de jaune d‟œuf (colonies jaunes) ou à base de sang de cheval (colonies grises). La formulation originale est à base de : protéose peptone (40 g), agar (25 g), fructose (6 g), Na2HPO4 (5 g), NaCl (2 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4 7H2O (0.1 g), solution d‟antibiotiques (10ml) (cyclosérine, céfoxitine), émulsion de jaune d‟œuf (10 ml), solution de rouge neutre (3 ml), solution d‟hémine (1 ml). Définition 17 : Gélose au jaune d‟œuf (McClung) : milieu permettant d‟explorer l‟activité lypolytique des bactéries. Clostridium perfringens possède une lécithinase qui lors de son action (hydrolyse de la lécithine du jaune d‟œuf) libère de la choline soluble et un diglycéride peu soluble qui précipite dans le milieu provoquant un halo autour de la culture. Définition 18 : Milieu TSC (Tryptone Sulfite Cyclosérine) : milieu utilisé pour l‟isolement sélectif et le dénombrement de Clostridium perfringens dans les produits alimentaires, les eaux, les fèces. Ce milieu est également recommandé pour le dénombrement des anaérobies sulfitoréductrices dans les denrées d‟origine animale. Les micro-organismes sulfito-réducteurs réduisent le sulfite de sodium en sulfure, provoquant avec le citrate ferrique un précipité noir de sulfure de fer autour des colonies. 121 BIBLIOGRAPHIE ABAAS S., FRANKLIN A., KÜHN I., ØRSKOV F., ØRSKOV I. (1989) Cytotoxin activity on Vero cells among Escherichia coli strains associated with diarrhea in cats Am. J. vet. Res., 50, (8), 1294-1296 ACKE E., WHYTE P., JONES B.R., McGILL K., COLLINS J.D., FANNING S. (2006) Prevalence of thermophilic Campylobacter species in cats and dogs in two animals shelters in Ireland Vet. Rec., 158, 51-54 BAGCIGIL A.F., IKIZ S., DOKUZEYLUL B., BASARAN B. (2007) Fecal shedding of Salmonella spp. in dogs J. Vet. Med. Sci., 69, (7), 775-777 BAKER J., BARTON M.D., LANSER J. (1999) Campylobacter species in cats and dogs in South Australia Aust. Vet. J., 77, (10), 662-666 BARROW P.A., JONES M.A., THOMSON N. (2010) 14 – Salmonella In: CARLTON L.G., PRESCOTT J.F., SONGER L.G., THOEN C.O. (eds.). 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Il s‟attache également à aider tout praticien dans l‟interprétation des résultats transmis par le laboratoire. Premièrement, le choix de réaliser une coproculture se fait selon des contextes épidémio-cliniques propres à chaque germe suspecté mais aussi lorsque l‟on se trouve dans un contexte plus général tel que : diarrhée contagieuse dans un effectif, diarrhée aiguë hémorragique avec répercussions sur l‟état général non due à un parvovirus, diarrhée chronique rebelle à tout traitement, suspicion de zoonose ou diarrhée nosocomiale. Deuxièmement, le prélèvement de selles doit être le plus minutieux possible, être conditionné dans un milieu de transport adapté et envoyé au laboratoire dans les 24 à 48 heures sous couvert du froid. Enfin, le résultat fourni par le laboratoire doit toujours être interprété à la lueur du contexte clinique dans lequel se trouve l‟animal. Par ailleurs, la coproculture doit le plus souvent être complétée par d‟autres examens, notamment immuno-enzymatiques (recherche de toxines pour Clostridium spp. et E.coli) et moléculaires (recherche des gènes « facteurs de virulence » pour E.coli, des gènes codant pour les toxines, ou du matériel génétique bactérien (Salmonella spp. et Campylobacter spp.)).Cela permettra de caractériser davantage le caractère virulent des bactéries isolées. MOTS CLES : - Coproculture - Antibiotiques - Bactéries - Diarrhée - Diagnostic bactériologique JURY : Président : Monsieur le Professeur Dominique PEYRAMOND 1er Assesseur : Madame le Docteur Marine HUGONNARD 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Angeli KODJO DATE DE SOUTENANCE : 4 juillet 2011 ADRESSE DE L’AUTEUR : 57 Rue du Président François Mitterrand 91160 LONGJUMEAU 136
