oenococcus bouix
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Marielle BOUIX AgroParisTech-INRA Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Process d’élaboration des vins Raisins Pressurage Moût Fermentation Alcoolique: FA Saccharomyces cerevisiae Sucre Ethanol (11-14%)+CO2 pH = 3,2 à 3,5. T° = 18°C Temps de fermentation: 10 à 30 jours Oenococcus oeni Fermentation Malolactique: FML Acide malique Acide lactique + CO2 Vin Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Les conditions de la FML Vin: Ethanol: 11 à 14%, pauvre en nutriments, pH: 3,2 Ensemencement avec des souches lyophilisées (starters) ou inoculum liquide (souches réactivées en vin ou vin dilué) Croissance difficile, faible ( maximum 107/ml) Démarrage aléatoire => phase de latence de qq. jours à plusieurs semaines! Þ Importance d’avoir des traceurs judicieux des bactéries pour optimiser les ensemencements: Nombre et Etat Physiologique Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1ère objectif: Nombre Avoir un moyen de comptage « en temps réel » pour suivre la croissance - Culture en milieu gelosé: 10 jours d’incubation => trop long pour faire un suivi en temps réel - Cytométrie en flux avec marqueur de viabilité = méthode rapide, faisabilité? 2ème objectif: Etat physiologique Comprendre pourquoi démarrage aléatoire? => maîtrise Déterminer un descripteur d’activité de la bactérie associé à la durée de la phase de latence de la FML Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Objectif 1: Dénombrement: CMF(cFDA)/Boites O. oeni MC1 - FT80 pH3,2 - cFDA Cells/ml 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 Time of culture (h) cFDA stained cells CFU Ecarts en phase de démarrage et phase stationnaire: les cellules apparaissent cultivables non viables ! Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Dénombrement CMF(syto9/IP)/Boites O. oeni Le comptage d’O. oeni est réalisé par CMF avec le kit BacLight en 15min Excellente corrélation avec la méthode de référence (10 jours) Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1ère objectif: Nombre Avoir un moyen de comptage « en temps réel » pour suivre la croissance - Cytométrie en flux: avec marqueur Syto9/IP avec marqueur cFDA 2ème objectif: Etat physiologique Comprendre pourquoi démarrage aléatoire? => maîtrise Déterminer un descripteur d’activité de la bactérie associé à la durée de la phase de latence de la FML Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Mécanisme de la Fermentation MaloLactique Fpm = DY – 2,3 RT/F . D pH DY: potentiel transmembranaire DpH L-malate + H+ DY + ATPase ATP ADP pHe < pHi - H+ H+ L-malate - - Enzyme malolactique L-lactate +CO2 Lactate + nH+ CO2 + (H+) Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Peut-on évaluer la Force proton motrice ? La CMF permet de mesurer: • DY: DiBac: Les cellules dépolarisées sont fluorescentes, + elles sont fluorescentes, + elles sont dépolarisées • pHi: CFDA SE ou CDCF: intensité de fluorescence = f(pH) • ATP: Mesure indirecte par la vitalité cellulaire évaluée par l’excrétion de fluorescéine après marquage DIF15= IF0 – IF15 .100 IF0 Corrélée CE = ATP + ½ ADP ATP + ADP + AMP Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Photos d’O. oeni après marquage DiBac(4) Phase de latence Phase exponentielle Fin de FML Plus les cellules sont polarisées, moins elles sont fluorescentes => les cellules se polarisent en phase exponentielle et se dépolarisent en fin de phase de stationnaire Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Pourquoi les cellules cultivables apparaissent non fluorescentes après double marquage cFDA/IP ? Lag grow th phas e E xpon en tial grow th phase S tatio nary grow th ph ase MC1 2A cFDA estérases cF cFDA Activité estérasique ? cF: fluorescence f(pH), pHi des cellules ? Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 55 44 33 22 1 1 0 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 DIF15 66 0 50 0 50 100 150 100 150 Time of culture (h) 200 250 200 250 Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 % depolarized cells Malic acid (g/L), intracellular pH Malic acid g/L DY, pHi et vitalité au cours de la FML Cinétique des phénomènes au cours de la FML H+ DpH ADP pHe<= pHi L-malate + H+ - DY + ATPase ATP H+ L-malate - - Enzyme malolactique L-lactate +CO2 Lactate + nH+ CO2 + (H+) Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Fonctionnement cellulaire et descripteurs d’activité - La consommation d’acide malique génère un DY et un DpH - le DpH permet le fonctionnement de l’ATPase pour produire de l’ATP - la charge énergétique et la vitalité sont maximum quand le DpH et la polarisation sont maximum Puisque l’activité cellulaire est maximum quand le DpH est maximum (pHimax), IFDibac min, et DIF15 max Utilisation comme descripteurs d’activité / moment optimal du transfert de l’inoculum dans le vin ? Vérification en fermentation en vin Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Protocole : Ensemencements de vins à partir d’un même inoculum à différents stades de la FML Vin en cours de FML Ac.malique pHi 3,08 2,94 2,63 4,2 4,3 4,5 g.L-1 0,78 0(+1j) 0(+6j) 5,8 5,3 3,2 Vin à 5g.L-1 Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Cinétique de FML en fonction de la concentration en acide malique et du pHi de l’inoculum Time (h) 800 700 MLF time 600 latency time 500 400 300 200 100 0 3,08 2,94 2,63 0,78 0 (+1d) 0 (+3d) 0 (+6d) 4,2 4,3 4,5 5,8 5,3 3,5 3,2 Malic acid g/L pHi Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 CONCLUSION - Quand l’’activité cellulaire d’O. oeni est maximum, le démarrage de la FML est rapide (phase de latence courte), - l’activité est maximum quand le DY, DpH (pHi max) et vitalité (vitesse d’excrétion) sont maximum -DY, pHi et vitalité sont rapidement mesurables par CMF => On peut optimiser le moment du transfert de l’inoc « actif » dans le vin par la mesure du pHi, du DY et (ou) de la vitalité par CMF Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Merci de votre attention Remerciements: Moet et Chandon, Lallemand SA - Rapid enumeration of Oenococcus oeni during malolactic fermentation by flow cytometry Journal of Applied Microbiology – 2012. 114, p.1075-1081. - Rapid assessment of Oenococcus oeni activity by measuring intracellular pH and membrane potential by flow cytometry, and its application to the more effective control of malolactic fermentation International Journal of Food Microbiology - 2015. 193, p.139-146 Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015
