Résultat recherche SAF - Syndrome Angelman France

1
Projet de recherche
Mise au point d’une puce à ADN dédiée de la région 15q11-12 pour identifier
les délétions intragéniques et du centre de l’empreinte afin d’améliorer le
diagnostic moléculaire et le conseil génétique dans le syndrome d’Angelman
Travail réalisé par Nathalie Kuziner sous la direction du pr Anne Moncla dans le laboratoire
de Génétique Chromosomique du département de génétique médicale CHU Timone Enfants
–Marseille
Rapport

2
Introduction
Les syndromes de Prader-Willi (PWS) et d’Angelman (AS) sont liés à des anomalies
génétiques et épigénétiques d’une même région chromosomique, la région 15q11-q12
qui est soumise à l’empreinte génomique parentale.
Il a été démontré que les gènes soumis à empreinte parentale présentent une
méthylation différentielle des deux allèles parentaux.
La région 15q11-q12
La région critique du syndrome de Prader-Willi est la plus proche du centromère.
Plusieurs gènes d’expression exclusivement paternelle ont été identifiés dans cet
intervalle :
 MKRN3
 MAGEL2 et NDN
 SNURF-SNRPN
 snoRNA: Small nucleolar RNAs. Ce sont des ARNs introniques. Ils se trouvent
dans l’unité de transcription SNURF-SNRPN.
Le gène UBE3A (E6-A6 ubiquitin protein ligase, *601623) est soumis à empreinte
paternelle (expression uniquement à partir de l’allèle maternel).
Ce gène a 16 exons dont 9 codants (exons 8 à 16). La protéine a une activité ubiquitine
ligase. Un défaut dans la voie de dégradation par le protéasome des protéines
ubiquitinilées semble conduire à un phénotype AS.

3
L’empreinte d’UBE3A est tissu-spécifique, elle est restreinte à certaines cellules dans le
cerveau. On note la présence d’un anti-sens d’UBE3A, UBE3A-AS, exprimé par allèle
paternel dans le cerveau, qui va contrôler l’empreinte tissu-spécifique du gène UBE3A.
Le centre de l’empreinte est localisé au niveau du locus SNURF-SNRPN. C’est un
élément régulateur bipartite qui contrôle l’effacement et le ré-établissement de
l’empreinte parentale dans les lignées germinales.
Le centre de l’empreinte pour le syndrome de Prader-Willi (PWS-IC) est défini par PWS-
SRO (smallest region of deletion overlaps, région minimale critique) qui s’étend sur 4,3
kb et comprend le promoteur et l’exon 1 du locus SNURF-SNRPN.
Le centre de l’empreinte pour le syndrome d’Angelman (AS-IC) est défini par AS-SRO
qui s’étend sur 880pb et se situe à environ 35 kb en amont de l’exon 1 du locus SNURF-
SNRPN. AS-IC contient un des exons alternatifs (U5) de SNRPN qui doit probablement
jouer un rôle dans l’empreinte maternelle.
Les causes du syndrome d’Angelman (AS)
- une microdélétion 15q11-q12 (5Mb) maternelle dans 70% des cas
- une disomie uniparentale paternelle dans 10% des cas
- une mutation du gène UBE3A dans 5% des cas

4
La stratégie de diagnostic utilisée en routine est la suivante :
- analyse du profil de méthylation par Southern blot
- étude des microsatellites : ceci permet de vérifier l’origine parentale des allèles. Cette
analyse confirme la présence d’une délétion ou d’une disomie monoparentale.
- pour les patients ne présentant pas d’anomalie de la méthylation, la recherche de
mutation au niveau du gène UBE3A est effectuée par DHPLC ou séquencage direct.
Ceci permet donc de porter un diagnostic précis chez 90% des patients et de donner un
conseil génétique approprié.
Cependant, dans 10% des cas on peut trouver :
- Soit une anomalie de la méthylation sans délétion ni disomie uniparentale. Il peut
s’agir alors d’une délétion du centre de l’empreinte.
- Soit un profil de méthylation normal chez un patient présentant un phénotype de
syndrome d’Angelman typique. Il pourrait s’agir d’une délétion intragénique du
centre de l’empreinte.
Ces deux anomalies (délétion intragénique ou délétion du centre de l’empreinte) peuvent
être héritées de la mère. Il existe alors un risque de récurrence élevé (50% pour les
grossesses suivantes) et un risque pour les apparentés.
Objectifs de l’étude
Mise au point d’une puce à ADN haute résolution de la région 15q11-q12 permettant
d’identifier à la fois les délétions intra géniques d’UBE3A et les délétions du centre de
l’empreinte

5
Matériel et Méthodes
Patients
2 groupes de patients issus du centre de référence des syndromes malformatifs et
anomalies du développement PACA. Le laboratoire du département de génétique
médicale est laboratoire de référence pour l’analyse moléculaire du gène UBE3A.
 Groupe 1
AS typique sans anomalie du profil de méthylation, ni mutation UBE3A : 5 familles
 Groupe 2
AS avec anomalie isolée de la méthylation sans délétion ni disomie uniparentale : 8
patients
Mise au point d’une puce à ADN spécifique de la région 15q11-q12
CGH : Comparative Genomic Hybridization ou puces à ADN
Le principe de cette technique est de mesurer les déséquilibres génomiques, c'est-à-dire
les délétions ou les duplications. Elle est basée sur le principe de l’hybridation
moléculaire comparative sur une puce à ADN. La puce est une lame de verre sur
laquelle se trouvent des séquences d’ADN génomique connues représentatives du
génome humain, différents types de séquences peuvent être déposées.
L’ADN du patient et l’ADN d’un témoin de même sexe marqués à 2 fluorochromes
différents sont hybridés sur une puce.
Selon le protocole expérimental établi au sein du laboratoire, les ADN des patients
seront toujours marqués avec le fluorochrome cyanine 5 (bleu) et les ADN des témoins
avec le fluorochrome cyanine 3 (rose). La cyanine 5 fluoresce en rouge et la cyanine 3
fluoresce en vert.