Identification d’un nouveau gène par cartographie par homozygotie et analyses Acronyme du Projet: BardetBiedl / Programme: Maladies Rares / 2006 BIOLOGIE & SANTÉ 2011 , un nouveau gène impliqué dans le syndrome de BardetBiedl augmentant le spectre phénotypique des ciliopathies Stoetzel C1, Bei X3, Schaefer E1, Zaloszyc A1, Perdomo Y2, Aliferis K2, Toutain A4, Gérard M5, Perrin L5, Fischbach M6, Mandel JL7, Hildebrandt F9, Katsanis N3, Marion V1 , Dollfus H1,2 Laboratoire de Génétique Médicale EA 3949, Equipe AvenirInserm, Faculté de Médecine de Strasbourg, Université De Strasbourg, Strasbourg, France (2) Centre de Référence pour les Affections Rares en Génétique Ophtalmologique (CARGO), Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Strasbourg, France (3) Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA (4) Service de Génétique, Hôpitaux Universitaires de Tours, Tours, France (5) Département de génétique, APHPCHU Robert Debré, Paris, France (6) Service de Pédiatrie 1, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Strasbourg, France (7) Laboratoire de Diagnostic Génétique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Strasbourg, France and Chaire de Génétique Humaine, Illkirch, France 9Departments of Pediatrics and of Human Genetics,University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. (1) 1. Identification d’une mutation intronique profonde (c.740+356 C>T) dans le gène pour la famille I.2 A. Ségrégation familiale Gel d’agarose 4 patients atteints I.2.21 I.2.25 I.2.22 c.740+356C>T Perte ESE c.740+356C>T Perte ESE B. Validation de la mutation 4 contrôles sains RT PCR quantitative I.2.24 I.2.23 c.740+356C>T Perte ESE 100 bp Ladder Le syndrome de BardetBiedl (BBS) (OMIM 209900) est une maladie autosomique récessive caractérisée cliniquement par l’association variable d’une rétinopathie pigmentaire, d’une obésité, d’une polydactylie, d’anomalies rénales, d’un hypogonadisme et de troubles des apprentissages. Ce syndrome est hétérogène sur le plan génétique puisqu’à ce jour, 15 gènes BBS ( à ) ont été identifiés. Nous rapportons ici l’identification du gène comme étant le 16ème locus associé au syndrome de Bardet Biedl. A ce jour, environ 75% des familles BBS sont caractérisées sur le plan moléculaire. L’identification de nouveaux gènes BBS pour les 25% des familles restantes est rendue difficile par la petite taille des échantillons et/ou l’absence de consanguinité. Une étude par puce SNP (Affymetrix 6.0) nous a permis d’identifier, dans une grande famille consanguine d’origine tzigane, une petite zone d’homozygotie sur le chromosome 1 (240242.38Mb) partagée par les individus atteints et contenant 5 gènes candidats ( ). Le séquençage de l’ADN génomique de ces différents gènes n’a pas révélé de mutation. Par contre, l’étude de l’ARN extrait de cellules de fibroblastes a identifié, chez 4 individus atteints, une mutation intronique profonde (c.740+356C> T) à l’état homozygote prédite pour causer la perte d’un site ESE (exonic splice enhancer). Des études en RTPCR quantitative et en Western blot ont permis de valider la pathogénicité de la mutation. Deux autres familles BBS consanguines du laboratoire présentaient elles aussi une zone d’homozygotie comprenant . Le séquençage du gène a détecté deux nouvelles mutations: p.K227X/K227X pour la première famille et p.R374X/R374X pour la seconde. L'analyse parallèle d'une autre cohorte de patient BBS a identifié deux autres familles mutées dans à l’état hétérozygote composite: p.Y232X/R247fsX250 et p.T482fsX493/D543fsX566. I.2.21 c.740+356C>T Perte ESE c.740+356C>T Perte ESE RTPCR exons 7 à 8 de : un fragment unique (179 nt) chez les contrôles sains plusieurs fragments amplifiés chez les 4 patients atteints Western Blot SDCCAG8 83 kDa βTubulin 50 kDa Famille AR37 Famille 1063 AR37 02 3 AR37 07 p.T482fsX493/p.D543fsX566 p.Y232X/p.R247fsX250 c. 696T>G/c.740+1delG p.R374X p.R374X/R374X c.1120C>T c.1120C>T/c.1120C>T p.K227X p.K227X p.K227X/K227X c.679A>T c.679A>T c.679A>T/c.679A>T AR37 05 c. 1444delA/c.1627_1630delGATA 3. Mutations décrites dans le gène (Otto et al., 2010 et cette étude) dans le Syndrome de BardetBiedl et le Syndrome de SeniorLöken c.740+356C>T (ESE loss) p.D543AfsX23 c.1627_1630delGATA p.Y232X c.696G>T BBS Mutations BBS p.K227X c.679A>T (Otto et al., 2010 et cette étude) p.T482SfsX11 c.1444delA p.R374X c.1120C>T ATG 1 SLS Mutations TGA 2 3 SLS (Otto et al., 2010) 4 5 6 Del exon 57 7 8 9 10 11 12 c.1068+1G>A (Splice) p.E447GfsX16 c.1039_1040insG Otto et al, Nat Genet. 2010 Oct;42(10):84050. Epub 2010 Sep 12. p.E474SfsX19 c.1420delG 13 14 15 16 p.L599X c.1796T>G p.C649SfsX8 c.1946_1949delGTGT 3 2,5 2 I.2.24 I.2.23 I.2.22 I.2.21 0,5 0 Contrôle I.2.21 I.2.22 I.2.23 I.2.24 La quantification de la protéine SDCCAG8 chez les patients atteints par rapport à un témoin sain confirme son extrême réduction en corrélation avec l’analyse faite en RTPCR. 17 18 Syndrome BardetBiedl Phénotype SDCCAG8 Syndrome Alström Syndrome MORM Syndrome Senior Löken ++ ++ ++ ++ Rétinopathie pigmentaire ++ ++ ++ ++ ++ ++ Insuffisance rénale rare ++ + Polydactylie ++ Hypogonadisme ++ + + ++ Troubles des apprentissages ++ ++ + ++ Surdité de transmission + + ++ Surdité de perception rare Diabète rare ++ + Cardiomyopathie ++: critère majeur c.740+1delG (Splice) 4 3,5 Anomalies rénales Obésité II.22.22 4,5 1,5 Analyse en immunoblot de protéines extraites d’une culture de fibroblastes chez un contrôle sain et chez 4 patients atteints. Critères cliniques II.22.21 Contrôle 1 Control Famille II.30 I.2.24 4. Phénotype des familles mutées au sein du spectre des ciliopathies avec obésité 2. Mutations identifiées dans pour quatre autres familles Famille II.22 I.2.23 SDCCAG8/βTubulin Lorem ipsum dolor sit amet Photos des patients I.2.25 et I.2.22 atteint de BBS avec une obésité, une rétinopathie pigmentaire, une atteinte rénale, un retard mental mais pas de polydactylie. I.2.22 RTPCR exons 8 à 9 chez 4 patients atteints: extrème réduction (<5%) du transcrit normal par rapport au témoin ++ +:critère mineur Discussion: Nous avons démontré dans cette étude que est un nouveau gène impliqué dans le syndrome de BardetBiedl. En effet, les patients mutés présentent des signes cliniques majeurs de BBS: rétinopathie pigmentaire, obésité, insuffisance rénale, troubles des apprentissages et hypogonadisme. De façon intéressante, l’atteinte rénale dans le phénotype SDCCAG8 est précoce et sévère, tous les patients ont développé une insuffisance rénale terminale entre l’âge de 5 et 31 ans. De plus, aucun des patients n’a de polydactylie, critère non obligatoire mais fréquemment retrouvé dans le syndrome de BardetBiedl. Enfin, les patients de la cohorte française ont une atteinte ORL et respiratoire qui se caractérise par des infections à répétition entrainant une surdité de transmission. Ces 3 signes cliniques représentent la première corrélation génotypephénotype forte dans le syndrome de BardetBiedl. Le séquençage du gène devrait donc être réalisé chez des patients présentant ces signes cliniques après séquençage des mutations les plus fréquentes dans , et . Parallèlement à ce travail, des mutations dans (NPHP10) ont été identifiées par une autre équipe grâce à une approche de capture d’exons chez des patients présentant un syndrome de SeniorLöken (Otto ., 2010). SDCCAG8 serait donc impliqué dans le phénotype d’au moins 2 ciliopathies: SLS et BBS. Conclusion: Des mutations dans sont retrouvées dans un petit nombre de familles BBS (environ 1%) mais sont responsables d’un phénotype particuliers orientant le conseil génétique et permettant de déchiffrer l’implication biologique des gènes BBS dans les multiples manifestations cliniques (Schaefer et al., souspresse, Mai 2011). CONTACT : [email protected]strasbg.fr [email protected] 88