L Les voies de signalisation activées dans le mélanome et les principes actuels

DOSSIER THÉMATIQUE
Oncodermatologie
Les voies de signalisation
activées dans le mélanome
et les principes actuels
du génotypage
Signalling pathways activated in melanoma
and the current principles of genotyping
N. Dumaz*, S. Mourah**
* Inserm U976 ; UMR-S 976, UFR de
médecine Paris-Diderot, Paris.
** Laboratoire de pharmacogénomique, hôpital Saint-Louis, Paris ;
Inserm U940, Paris ; UMR-S 940,
université Paris-Diderot, Paris.
L
e mélanome cutané, tumeur issue des mélanocytes, est devenu un problème majeur de santé
publique dans de nombreux pays. À un stade
précoce, le mélanome sous une forme localisée
est curable par exérèse chirurgicale. Néanmoins, à
un stade avancé, le mélanome est de très mauvais
FC
α-MSH
R
T
K
R
T
K
RAS
AC
MC1R
ATP
AMPc
PTEN
PI3K
BRAF
PKA
AKT
MEK
CREB
mTOR
ERK
MITF
Prolifération/différenciation/survie
AC : Adenylyl Cyclase ; AMPc : AMP cyclique ; CREB : cAMP Responsive Element Binding Protein ;
ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase ; FC : facteur de croissance ; MEK : Mitogen-activated ERK Kinase ;
MITF : MIcrophtalmia-associated Transcription Factor ; MSH : Melanocyte Stimulating Hormone ;
mTOR : mammalian Target Of Rapamycin ; PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase ; PKA : Protein Kinase A ;
PTEN : Phosphatase and TENsin homolog located on chromosome 10 ; RAS : RAt Sarcoma ;
RTK : récepteur à activité tyrosine kinase.
Figure 1. les trois voies de signalisation majeures impliquées dans le développement des
mélanomes. La voie PI3K (gauche), la voie MAPK (centre) et la voie de l’AMPc (droite).
Les protéines indiquées en orange sont codées par des gènes fréquemment mutés ou
amplifiés dans les mélanomes cutanés.
536 | La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011
pronostic, car les formes métastatiques sont résistantes aux chimiothérapies. Par conséquent, l’identification des cibles moléculaires pour le diagnostic
et le traitement des patients au stade métastatique
est d’une importance particulière et a été récemment l’objet d’intenses recherches. De nombreuses
altérations génétiques ont été décrites ces dernières
années dans le mélanome cutané, permettant de
mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Au moins 3 voies de transduction
du signal sont impliquées dans la mélanogenèse : la
voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases),
celle de la PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) et
celle de l’AMPc (AMP cyclique) [figure 1]. Leurs
implications dans le développement des mélanomes,
leur intérêt thérapeutique et les principes du génotypage sont détaillés ci-dessous.
La voie MAPK
La voie MAPK est activée en aval de la plupart des
récepteurs des facteurs de croissance (FC). C’est une
cascade essentielle de signaux de transduction qui
contrôle la survie, la croissance et la différenciation
cellulaire, mais aussi la transformation tumorale (1).
L’activation de la voie MAPK est initiée par les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). Ces derniers
sont des protéines transmembranaires formées d’un
domaine amino-terminal qui lie le ligand extracellulaire et d’un domaine carboxy-terminal qui possède
une activité tyrosine kinase. La liaison du ligand à son
RTK induit l’activation du récepteur, qui se traduit
Points forts
» Le mélanome est un cancer de la peau dont l’incidence augmente de façon constante. La découverte récente
d’altérations génétiques fréquentes et récurrentes dans les mélanomes cutanés permet une classification
moléculaire de ces tumeurs en sous-groupes distincts, ouvrant ainsi la voie à la thérapie ciblée.
» Plusieurs voies de signalisation telles que MAPK, PI3K, AMPc et cycline D1/CDK4 sont impliquées dans la
progression de cette maladie et sont affectées par certaines mutations oncogéniques. Dans chaque voie, plusieurs
cibles thérapeutiques potentielles ont été identifiées, et des inhibiteurs spécifiques sont en développement.
» Certains inhibiteurs, comme ceux ciblant c-KIT ou BRAF, ont montré une certaine efficacité dans des essais
cliniques et devraient rapidement être utilisés en clinique. Malheureusement, certains sous-groupes de
mélanomes, comme ceux présentant des mutations de RAS, n’ont pas encore de traitement ciblé approprié.
» Nous commençons tout juste à comprendre comment les différentes voies de signalisation activées dans
les mélanomes interagissent entre elles, mais il est clair qu’il va être nécessaire de combiner plusieurs inhibiteurs pour obtenir une efficacité thérapeutique à long terme.
par l’autophosphorylation de résidus tyrosine dans
le domaine intracellulaire. Ces tyrosines phosphorylées servent de sites de liaison pour des protéines
adaptatrices responsables de l’activation de plusieurs
molécules et donc de plusieurs voies de signalisation (figure 1, p. 536) [2]. Dans les mélanocytes,
la voie MAPK est activée par différents facteurs de
croissance et stimule la prolifération cellulaire (3).
La situation est différente dans le mélanome, où la
voie MAPK est activée de façon constitutive dans
la majorité des tumeurs grâce à l’acquisition d’une
mutation dans l’une des protéines de la voie MAPK,
comme détaillé ci-dessous.
tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), ayant
une mutation de domaine juxta-membranaire de
c-KIT, répondent à un inhibiteur de c-KIT (7), suggérant que les mélanomes porteurs d’une mutation
de c-KIT pourraient être traités par un tel inhibiteur.
En effet, les formes mutées de c-KIT sont capables
de transformer des mélanocytes en culture, et ces
cellules transformées sont très sensibles à l’imatinib, un inhibiteur de c-KIT qui inhibe leur prolifération (8). Plusieurs inhibiteurs de c-KIT sont en
cours de développement clinique pour différentes
tumeurs, dont le mélanome (tableau I).
Tableau I. Inhibiteurs de kinases en développement clinique.
Le récepteur c-KIT
Cibles
c-KIT est le récepteur du SCF (Stem Cell Factor),
qui joue un rôle central dans le développement de
multiples lignées cellulaires, dont les mélanocytes.
Ainsi, les mutations qui inactivent le récepteur sont
associées aux taches blanches dépigmentées que l’on
retrouve dans le piébaldisme chez l’homme et chez
la souris “Dominant White Spotting” (4). La liaison
du SCF à c-KIT induit l’activation du récepteur et
l’autophosphorylation des résidus tyrosine spécifiques dans la partie intracellulaire du récepteur. Ces
acides aminés phosphorylés sont des sites d’accueil
pour différentes protéines, qui à leur tour contrôlent
plusieurs voies de signalisation intracellulaire, dont
les voies MAPK et PI3K. Jusqu’à récemment, les
données publiées suggéraient que c-KIT agissait
comme un gène suppresseur de tumeur dans le
mélanome, puisque son expression est réduite ou
perdue lors de la progression tumorale du mélanome vers les stades invasifs et métastatiques (5).
Cependant, il a récemment été démontré que
certains mélanomes surexpriment c-KIT, y compris
dans des lésions métastatiques, et des mutations
activatrices de c-KIT ont récemment été identifiées
dans moins de 3 % des mélanomes (6). Bien que
globalement rares, les mutations de c-KIT sont plus
fréquentes dans les mélanomes muqueux, acraux
et les mélanomes survenant sur peau avec élastose
solaire (Chronic Sun Damage ou CSD melanoma). Ces
mutations affectent le domaine juxta-membranaire
du récepteur. Ces résultats sont importants sur le
plan thérapeutique, puisque les tumeurs de type
c-KIT
Imatinib, nilotinib, sunitinib, dasatinib
RAF
PLX4032/vémurafenib, GSK2118436,
XL281/BMS-908662, Raf265/Chir-265, SB-590885
MEK
PD0325901, AZD6244, AZD3844, AZD8330,
RDEA119, GDC-0973/XL518, GSK1120212,
RO4987655
AKT
GSK2141795, MK2206, GSK690693,
perifosine/KRX-0401, VQD-002, TCN-PM/VD-0002
mTOR
Rapamycine/sirolimus, Rad001/évérolimus,
CCI-779/temsirolimus, MK8669/ridaforolimus,
BEZ235*, XL765/SAR245409*, GSK2126458*,
BGT226*, AZD8055, OSI-027, SF1126*
PI3K
GDC0941, BEZ235*, BKM120,
XL147/SAR245408, XL765/SAR245409*,
GSK2126458*, PX-866, SF1126*, BGT226*
CDK4
PD0332991, LY2835219, LEE011, P1446A-05
Inhibiteurs en développement clinique
* Inhibent à la fois mTOR et PI3K.
La petite GTPase RAS
Les protéines RAS sont des petites GTPase qui
forment le lien essentiel entre le RTK et l’activation
de la voie MAPK. La protéine RAS agit comme un
interrupteur moléculaire : elle est “on” lorsqu’elle est
liée au GTP (guanine triphosphate) et “off” quand elle
est liée au GDP (guanine diphosphate). Après activation d’un RTK, le complexe protéique Shc/Grb2/SOS
s’y fixe et stimule le remplacement du GDP par le
GTP sur RAS, l’activant ainsi (9). Les réponses cellulaires à l’activation de RAS sont variées du fait que
Mots-clés
Mélanome
Voies de signalisation
Inhibiteurs
Thérapie
Génotypage
Highlights
» Melanoma is a deadly skin
cancer, the incidence of which
has been increasing worldwide. The recent discovery of
frequent and recurrent genetic
alterations in cutaneous melanoma allows a molecular classification of these tumours into
distinct subgroups, opening the
road to oncogene-targeted
therapy.
» Several signalling pathways
are involved in the progression
of this disease, with oncogenic
mutations affecting the MAPK,
the PI3K, the cAMP and the
cyclin D1/ CDK4 pathways. In
each pathway, several potential
therapeutic targets have been
identified, and specific inhibitors are under development.
» Some drugs, such as those
targeting c-KIT or BRAF, are
showing promising clinical
activity and are quickly moving
into the clinics. However, some
melanoma subgroups, such as
those with RAS mutations,
are still without appropriate
therapy.
» We are just beginning to
understand the interplays
between the different signalling pathways, but it is clear
that we will need to develop
appropriate combination
therapy strategies to achieve
long-term clinical efficacy.
Keywords
Melanoma
Signalling pathways
Inhibitors
Therapy
Genotyping
La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011 |
537
DOSSIER THÉMATIQUE
Oncodermatologie
Les voies de signalisation activées dans le mélanome
et les principes actuels du génotypage
la protéine RAS associée au GTP peut lier plusieurs
protéines effectrices, telles que les protéines RAF,
PI3K, RalGDS et phospho lipase Cε (10). Il y a
3 protéines RAS très similaires, HRAS, KRAS et NRAS,
et les mutations des acides aminés 12, 13 ou 61 de
l’une des 3 protéines RAS les convertissent en oncogènes. Ces mutations inhibant l’activité GTPase des
protéines RAS, celles-ci, liées en permanence au GTP,
sont donc actives de façon constitutive. Environ 20 %
des mélanomes présentent une mutation d’un gène
RAS et, dans la plupart des cas, cette mutation est
située au niveau du codon 61 de NRAS (Q61R ou
Q61K) [11]. Les protéines RAS ont plusieurs effecteurs qui peuvent contribuer aux propriétés oncogéniques de la forme mutée RAS (figure 1, p. 536). La
présence de mutations de RAS ou de RTK en amont
de RAS suggère que la protéine RAS pourrait être
une bonne cible thérapeutique pour le traitement
du mélanome. Les seuls agents développés à ce jour
qui affectent l’activité de RAS sont les inhibiteurs
de farnésyl transférase (FTI). Ces agents inhibent
la modification post-traductionnelle des protéines
RAS, empêchant de fait leur localisation membranaire, qui est nécessaire à leur activité (12). Un grand
nombre de FTI très efficaces ont été identifiés (13),
mais la farnésylation n’étant pas un processus propre
aux seules protéines RAS, l’utilisation de ces inhibiteurs est limitée par leur manque de spécificité.
Les protéines RAS pouvant donc difficilement être
ciblées par des inhibiteurs spécifiques, les recherches
actuelles s’orientent plutôt vers des cibles impliquées
dans les voies de signalisation activées en aval de
RAS comme RAF, MEK, PI3K, AKT ou mTOR, qui sont
impliquées dans les voies MAPK et PI3K. Au sein
d’une même voie de signalisation, les mutations sont
mutuellement exclusives : c’est le cas, par exemple,
des mutations de c-KIT, NRAS et BRAF, qui toutes 3
activent la voie MAPK et ne sont quasiment jamais
retrouvées de façon concomitante dans les mélanomes (6, 11).
Les kinases de la famille RAF
Les protéines RAF sont des sérine/thréonine kinases
qui jouent un rôle pivot dans la voie MAPK. La famille
des kinases RAF est composée de 3 membres :
ARAF, BRAF et CRAF (également appelé Raf-1), qui
partagent une architecture commune et qui sont
soumis à une régulation complexe (14). Les protéines
RAF sont recrutées à la membrane plasmique par
liaison directe aux protéines RAS actives et sont activées en plusieurs étapes. Les protéines RAF phospho-
538 | La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011
rylent et activent une protéine kinase appelée MAPK/
ERK kinase (MEK), qui à son tour active une troisième
protéine kinase appelée ERK. ERK est elle-même
une protéine kinase qui phosphoryle de nombreuses
cibles, notamment des facteurs de transcription,
régulant ainsi l’expression de nombreux gènes
(figure 1, p. 536). Le gène BRAF, qui est impliqué
dans la voie MAPK, est muté dans 50 à 70 % des
mélanomes cutanés (15). La mutation la plus
commune se trouve dans le domaine kinase de
BRAF, avec une substitution de la valine en glutamate au codon 600 (V600E) représentant 80 %
des mutations observées (16). La protéine mutante
BRAFV600E active la voie MAPK de façon constitutive,
stimulant la prolifération et la survie cellulaires, qui
sont essentielles à la croissance tumorale (17, 18).
La protéine mutante BRAFV600E contribue également
à la néoangiogenèse en provoquant l’expression et
la sécrétion autocrine du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) [19]. La présence fréquente de
mutations de BRAF dans le mélanome fait de cette
protéine une cible attrayante dans cette pathologie.
Plusieurs inhibiteurs de RAF ont été développés.
Ils sont de 2 sortes : d’une part, des inhibiteurs de
classe I, qui agissent spécifiquement sur la protéine
mutante BRAFV600E ; d’autre part, des inhibiteurs
de classe II, qui inhibent toutes les protéines RAF.
Les inhibiteurs de classe I incluent le vémurafénib,
XL281 et GSK2118436, qui sont des inhibiteurs spécifiques de la protéine mutée BRAFV600E et qui ont
montré leur efficacité dans des modèles précliniques
(tableau I, p. 537) [20]. Leur activité clinique est en
cours d’étude, et les résultats des essais cliniques
sont présentés dans l’article “Résultats et perspectives des thérapies ciblées” (p. 572). Le premier
inhibiteur de RAF de classe II a avoir été testé en
clinique fut le sorafénib. Cet inhibiteur a démontré
une certaine efficacité dans des modèles précliniques
de mélanomes (18), mais les résultats cliniques ont
été décevants en raison de la capacité du sorafénib
à inhiber un large spectre de kinases, augmentant
ainsi sa toxicité (21, 22). Cependant, d’autres inhibiteurs ciblant toutes les kinases RAF sont en cours
de développement clinique et ne devraient pas être
négligés, en particulier pour cibler les mélanomes
mutés sur RAS dans lesquels la protéine CRAF joue
un rôle prédominant (23). Par ailleurs, MEK étant le
seul substrat décrit de BRAF, c’est une cible thérapeutique intéressante pour les mélanomes mutés
sur BRAF. Dans des modèles précliniques, les inhibiteurs de MEK induisent une réduction significative
de la croissance du mélanome (24). Néanmoins,
ces inhibiteurs n’ont pas, jusqu’à présent, montré
DOSSIER THÉMATIQUE
une efficacité significative sur les mélanomes dans
les essais cliniques, leur toxicité limitant la dose
maximale utilisable (24). Une nouvelle génération
d’inhibiteurs de MEK est en développement clinique
(tableau I, p. 537). Si leur toxicité est limitée, ces
inhibiteurs pourraient être utiles pour traiter des
patients ayant acquis la résistance aux inhibiteurs
de BRAF (25).
La voie PI3K
La PI3K est à la fois un effecteur de RAS et un
effecteur direct des RTK. Une fois activée, la PI3K
convertit le PIP2 (phosphatidylinositol 4,5 phosphate) en PIP3 (phosphatidylinositol 3,4,5 phosphate), qui, en fixant les protéines ayant un domaine
PH (Pleckstrin Homology), régule leur localisation
et leur activité (figure 1, p. 536) [26]. Les protéines
AKT (AKT1, AKT2 et AKT3), appelées aussi protéines
kinase B, contiennent un tel domaine PH et sont les
effecteurs les plus connus de PI3K. Les protéines
AKT ont de nombreuses cibles, et en particulier
plusieurs protéines associées à l’apoptose, comme
la caspase 9 et BAD (27). Ainsi, lorsqu’elle est activée,
la voie PI3K/AKT protège les cellules de l’apoptose. Il
n’est donc pas étonnant de retrouver une activation
constitutive de cette voie de signalisation dans de
nombreux cancers, dont les mélanomes. La voie PI3K
est régulée négativement par la lipide phosphatase
PTEN (Phosphatase and TENsin homolog located on
chromosome 10) qui déphosphoryle PIP3, inhibant
ainsi l’activation des protéines AKT par PI3K (28).
Des délétions partielles ou totales du gène PTEN
ont été décrites dans 30 à 50 % des mélanomes,
et des mutations ponctuelles dans 10 % d’entre
eux (29, 30). Par ailleurs, l’activation constitutive
de la protéine AKT3, l’isoforme prédominante AKT
dans le mélanome, a été récemment retrouvée
dans plus de 60 % des mélanomes (31), soulignant
l’importance de l’activation de la voie PI3K dans leur
développement. In situ, l’expression des protéines
AKT phosphorylées et donc actives est importante
dans les mélanomes invasifs et les métastases, et est
inversement corrélée à la survie des patients (32).
Plusieurs systèmes modèles ont montré que l’inhibition de la voie PI3K/AKT agissait sur la croissance des
cellules de mélanome en culture et in vivo, démontrant que cette voie était une cible thérapeutique
intéressante pour le traitement du mélanome (31).
L’inhibition pharmacologique des composants de
la voie PI3K vise les protéines PI3K, AKT mais aussi
mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), une cible
des protéines AKT, impliquée dans la régulation de
la traduction des protéines et le cycle cellulaire
(tableau I, p. 537) [33].
Il est important de noter que les mutations du
gène BRAF, en particulier la mutation V600E, sont
également observées dans les nævus bénins, ce qui
suggère que la mutation de BRAF n’est pas suffisante pour transformer les mélanocytes (34). Ainsi,
plusieurs altérations génétiques sont nécessaires au
développement des mélanomes. Dans un modèle
de souris transgénique, la mutation V600E de BRAF
coopère avec la perte de PTEN pour induire des
mélanomes (35). Par ailleurs, les mutations de BRAF
sont fréquemment associées à la perte de PTEN dans
les mélanomes humains. Ces données suggèrent
que la voie MAPK et la voie PI3K coopèrent lors du
développement des mélanomes et qu’il sera nécessaire de cibler de façon concomitante ces 2 voies de
signalisation pour traiter les mélanomes de façon
durable. En effet, plusieurs publications montrent
que cibler à la fois la voie MAPK et la voie PI3K est
plus efficace pour inhiber la prolifération des mélanomes que cibler seulement l’une des 2 voies (36).
Des essais cliniques allant dans ce sens sont en cours.
La voie de l’AMPc et MITF
La voie de l’AMPc est stimulée par des hormones
mélanotropes produites par les kératinocytes comme
l’α-MSH (alpha-Melanocyte Stimulating Hormone), qui
se lie au récepteur MC1R (Melanocortin 1 Receptor)
et stimule la production d’AMPc. L’AMPc active la
protéine kinase A (PKA), qui phosphoryle et active
le facteur de transcription CREB (cAMP Responsive
Element Binding Protein), qui à son tour, stimule l’expression de la protéine MITF (figure 1, p. 536) [37]. La
protéine MITF est un facteur de transcription situé au
centre de multiples voies de signalisation contrôlant
la différenciation, la morphologie, la prolifération et
la survie des différentes cellules de la lignée mélanocytaire : les mélanoblastes, les mélanocytes et les
mélanomes (38). Il a récemment été montré que le
gène MITF était amplifié dans environ 20 % des mélanomes, mais pas dans les nævus (39). L’amplification
de MITF est corrélée à une diminution de la survie
globale des patients. L’expression ectopique de MITF
coopère avec la protéine mutante BRAFV600E pour
transformer des mélanocytes humains, démontrant
que MITF peut agir comme un oncogène dans le mélanome (39). L’inhibition de l’expression de MITF induit
l’apoptose des lignées de mélanomes dans lesquelles
le gène MITF est amplifié, mais aussi des lignées dans
La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011 |
539
DOSSIER THÉMATIQUE
Oncodermatologie
Les voies de signalisation activées dans le mélanome
et les principes actuels du génotypage
lesquelles il ne l’est pas (39, 40). La protéine MITF est
donc une cible potentielle dans le mélanome, mais
moduler son activité in vivo semble encore difficile.
La voie p16/CDK4
Le clinicien prescripteur
du génotypage remplit la fiche
dédiée téléchargeable sur le
site Internet de la plate-forme
de génétique moléculaire
de son secteur
Cette demande est transmise
au médecin anatomopathologiste
qui détient le prélèvement
tumoral
Le médecin anatomopathologiste
envoie cette fiche accompagnée
de la tumeur au laboratoire
réalisant le génotypage
Le laboratoire réalise le test
et envoie les résultats
au clinicien prescripteur
et anatomopathologiste
qui lui a adressé le prélèvement
Figure 2. La demande
de génotypage dans les
mélanomes, réalisée en
3 étapes, selon les modalités établies par l’INCa.
La protéine p16 (CDKN2A) régule le cycle cellulaire
à travers son interaction avec la kinase CDK4. En
effet, alors que la protéine kinase CDK4 s’associe à
la cycline D1 pour stimuler la progression du cycle
cellulaire, la protéine p16, en se liant à CDK4,
inhibe le cycle cellulaire. Les mutations germinales
du gène p16 prédisposent au développement du
mélanome, et des mutations ou délétions somatiques de p16 sont des événements fréquents dans le
mélanome (41). Des mutations activatrices de CDK4
ont été décrites dans le mélanome familial ainsi que
dans des cas sporadiques de mélanome (42). Enfin,
l’amplification des gènes codant pour la cycline D1
ou CDK4 a été observée dans un sous-ensemble de
mélanomes (43). Ces données démontrent que l’activité du complexe CDK4/cycline D1 est un élément
important dans la transformation des mélanocytes,
et par là même que CDK4 est une cible thérapeutique
dans le mélanome. Des inhibiteurs spécifiques de
CDK4/CDK6 qui sont en développement préclinique
et clinique pourraient avoir un intérêt thérapeutique
dans certains mélanomes (tableau I, p. 537).
Génotypages
dans les mélanomes : outils
d’orientation thérapeutique
Développement
de la médecine personnalisée
et de la pharmacogénomique
en oncologie
La caractérisation moléculaire de la tumeur devient
un critère déterminant dans le choix de la stratégie
thérapeutique, qui ne repose plus seulement sur
le type et le stade de la maladie. Elle permet un
accès optimal aux thérapies ciblées : un traitement
n’est prescrit qu’aux seuls patients susceptibles
d’en bénéficier, et un traitement inutile, toxique et
coûteux est épargné aux autres. En agissant sur des
altérations moléculaires spécifiques, les thérapies
ciblées constituent ainsi des traitements personnalisés. Cette approche innovante est particulièrement
axée sur l’identification de biomarqueurs prédictifs
de la réponse et du suivi aux thérapies ciblées.
540 | La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011
Depuis 2001, plusieurs thérapies ciblées ont reçu une
autorisation de mise sur le marché (AMM) restreinte
à un groupe de pathologies présentant des altérations moléculaires spécifiques, parmi lesquelles : les
cancers du sein avec amplification du gène HER2
dans 15 à 20 % des cas, les cancers du poumon avec
la présence de mutations d’EGFR dans près de 12 %
des cas, et les cancers colorectaux métastatiques
avec la présence de mutations du gène KRAS dans
environ 40 % des cas.
Dans le mélanome, il s’agit de rechercher les mutations des gènes BRAF et de c-KIT chez les patients
atteints d’un mélanome métastatique. En effet,
le mélanome métastatique est une affection de
pronostic redoutable (médiane de survie : 6,2 mois).
La chimiothérapie de référence, la dacarbazine,
permet d’obtenir des taux de réponse de 7,5 %
de courte durée. L’ipilimumab, anticorps monoclonal anti-CTLA4, augmente la survie de patients
prétraités de 30 %.
L’avènement des thérapies ciblées dans le mélanome en est à ses débuts. Environ 50 % des mélanomes métastatiques présentent des mutations
activatrices sur le gène BRAF. La plus fréquente
(74 % des cas) est celle localisée sur le codon 600
(BRAFV600E). Plus de la moitié des patients porteurs
de cette mutation sont répondeurs aux inhibiteurs
de BRAF actuellement évalués dans le cadre d’essais
cliniques (20). L’inhibiteur vémurafénib, dont les
résultats obtenus en phase II sont disponibles et
qui est évalué actuellement en phase III, a obtenu
l’AMM en août 2011. Le génotypage BRAF conditionnera ces traitements. En effet, c’est précisément
cette population de patients qui est identifiée par
génotypage et qui pourra bénéficier d’un traitement
par ces inhibiteurs.
Par ailleurs, un sous-groupe de mélanomes est caractérisé par une grande fréquence des mutations et
amplifications de c-KIT (15 %, contre moins de 1 %
pour l’ensemble des mélanomes) [6]. Ce sous-groupe
est représenté par les mélanomes acraux, muqueux
ou les mélanomes de Dubreuilh. La recherche de
ces mutations, centralisée à l’hôpital Saint-Louis
(Paris) dans le cadre d’inclusions dans le programme
hospitalier de recherche clinique (PHRC) “étude du
nilotinib dans les mélanomes porteurs de mutations
de c-KIT”, est également réalisée suite à des données
de réunions de concertation pluridisciplinaire.
En France, ces tests sont réalisés depuis 2009 pour
la prescription de thérapies ciblées au sein des
plates-formes de génétique moléculaire labellisées
et soutenues par l’Institut national du cancer (INCa)
[figure 2].
DOSSIER THÉMATIQUE
En pratique
Les mutations de BRAF (exon 15, codon V600) sont
recherchées systématiquement en première intention (positivité d’environ 50 %). En cas de négativité,
le séquençage des exons 11, 13, 17 et 18 de c-KIT est
réalisé pour les mélanomes muqueux, acrolentigineux et ceux induits par une exposition chronique
au soleil, parmi lesquels 10 à 30 % sont positifs.
Enfin, en cas de négativité de cette deuxième étape
de génotypage, le séquençage des exons 2 et 3 de
NRAS peut être réalisé en vue d’une caractérisation
complète de ces tumeurs dans la perspective du
développement d’autres inhibiteurs susceptibles
d’avoir une activité sur les mélanomes mutés NRAS,
tels que les inhibiteurs de MEK.
Depuis 2009, le nombre de tests réalisés par le laboratoire de pharmacogénomique de l’hôpital SaintLouis (plate-forme de l’AP-HP soutenue par l’INCa)
ne cesse de progresser (tableau II).
par polymérase (Polymerase Chain Reaction [PCR]) de
l’exon 15 (figure 3) ou par PCR en temps réel avec
sondes fluorescentes détectant spécifiquement la
mutation V600E (figure 4).
Tableau II. Génotypage des mélanomes à l’hôpital Saint-Louis.
Test
2009
2010
2011
2 premiers trimestres
BRAF
24
222
160
Mutations c-KIT
5
44
35
Amplification c-KIT
24
222
160
NRAS
12
122
80
G
T
G A
A
A
A
G
T
A
G
w
G A
A
A
G
T/A
G
A
A
A
G
A
G
100
T
C
T
Génotype sauvage
Méthodologie de génotypage
BRAF, c-KIT et NRAS
dans les mélanomes
➤ Extraction des ADN à partir de blocs de tumeurs
incluses en paraffine ou de prélèvements biopsiques
congelés après vérification histologique et macrodissection afin d’assurer, au sein de l’échantillon, un
pourcentage de cellules tumorales entre 70 et 80 %.
➤ Extraction des ADN par kit FFPE Qiagen® après
déparaffinage ou kit DNeasy Blood and Tissue
Qiagen®. L’analyse quantitative des ADN extraits
est réalisée.
➤ Génotypage BRAF : il est réalisé par séquençage
des produits d’amplification par la réaction en chaîne
A
G
A
A
A
A
100
T
T
C
C
T
Mutant hétérozygote V600E
A
T
C
A
A A T
A
A
100
T
C
A
G
A
G
A
T
C
G
C
Q
4,0
Hétérozygote
Q
Allèle Y
A
C
hv
VIC
Allèle X
Les deux
Allèle Y
Contrôle négatif
Sauvage
5,0
FAM
A
C
T
Figure 3. Génotypage BRAF : séquençage Sanger de l’exon 15 de BRAF.
Principe de la méthode ▾▾▾
Q
T
Mutant homozygote V600E
Présentation des résultats selon les différents génotypes ▸▸▸
FAM
T
3,0
2,0
FAM
Homozygote
Q
G
C
1,0
0,0
Figure 4. Génotypage BRAF : discrimination allélique par PCR en temps réel.
0,3
0,8
1,3
1,8
2,3
2,8
3,3
Allèle X
La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011 |
541
DOSSIER THÉMATIQUE
Oncodermatologie
Les voies de signalisation activées dans le mélanome
et les principes actuels du génotypage
➤ Génotypage c-KIT : les exons 11, 13, 17 et 18
sont séquencés par la méthode de Sanger après une
réaction de PCR spécifique. Les mutations c-KIT se
produisent avec la fréquence la plus élevée (environ
70 %) dans l’exon 11 du domaine juxta-membranaire, mais aussi dans le domaine kinase I, exon 13
(environ 17 %), et dans le domaine kinase II, l’exon 17
(environ 15 %) [tableau III]. Les mutations de c-KIT
sont réparties sur toute la longueur des 4 exons. Par
conséquent, il est nécessaire de réaliser un séquençage de l’intégralité de ces exons. La principale difficulté du génotypage de c-KIT est due à la qualité de
l’ADN à séquencer. Les tissus à génotyper sont en
grande majorité des prélèvements fixés puis inclus en
paraffine (FFPE). Il faut tenir compte d’un pourcentage de prélèvements non informatifs de 10 à 25 %
en fonction des centres.
La découverte dans le mélanome de mutations
fréquentes dans les voies de signalisation a représenté une percée majeure dans la génétique de
ce cancer ces dernières années. Le développement rapide d’inhibiteurs spécifiques apporte un
grand espoir pour le traitement de certains mélanomes. Cependant, chaque mélanome présentant plusieurs altérations génétiques, il devient
maintenant clair que plusieurs oncogènes devront
être ciblés pour obtenir une réponse durable au
traitement. C’est donc un traitement spécifique
et à la carte pour chaque mélanome qui se profile
à l’horizon.
Dans cette optique, il est important de développer
des systèmes de génotypage des mélanomes fiables,
précis et rapides pour adapter le traitement des
patients.
■
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DOSSIER THÉMATIQUE
Les voies de signalisation activées dans le mélanome
et les principes actuels du génotypage
Oncodermatologie
▸▸▸ Suite de la p. 542
Tableau III. Mutations c-KIT.
Mutations
Acide
aminé
n
%
K550N
1
2
11
Satzger I et al., Br J Cancer 2008
Y553N
1
2
11
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006
W557R
3
5
11
Beading C et al., Clin Cancer Res 2008 ; Rivera RS et al., Virchows Arch 2008 ; Satzger I et al., Br J Cancer 2008
K558N
1
2
11
Beading C et al., Clin Cancer Res 2008
K558E
1
2
11
Tate G et al., Cancer Genet Cytogenet 2009
V559A
4
6
11
Beading C et al., Clin Cancer Res 2008 ; Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006 ; Jiang X et al., Clin Cancer Res 2008 ;
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
V559G
1
2
11
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
V559D
1
2
11
Beading C et al., Clin Cancer Res 2008
V560D
2
3
11
Quintas-Cardama A et al., Nat Clin Prat Oncol 2008 ; Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
N566D
1
2
11
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006
V569G
1
2
11
Rivera RS et al., Virchows Arch 2008
L576P
23
37
11
Antonescu CR et al., Int J Cancer 2007 ; Beading C et al., Clin Cancer Res 2008 ;
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006 ; Satzger I et al., Br J Cancer 2008 ; Willmore-Payne C et al., Hum Pathol 2005 ;
Willmore-Payne C et al., Hum Pathol 2006 ; Went PT et al., J Clin Oncol 2004 ; Sekine S et al., Virchows Arch 2009 ;
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
R634W
1
2
13
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006
K642E
10
16
13
Ashida A et al., Int J Cancer 2009 ; Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006 ; Rivera RS et al., Virchows Arch 2008 ;
Lutzky J et al., Pigment Cell Melanoma Res 2008 ; Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
N655K
1
2
13
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
D816H
3
5
17
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006
D816V
2
3
17
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
D820Y
1
2
17
Ashida A et al., Int J Cancer 2009
N822I
1
2
17
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
Y823D
1
2
17
Beading C et al., Clin Cancer Res 2008
A829P
1
2
18
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006
I841V
1
2
18
Satzger I et al., Br J Cancer 2008
Total
62
Exon
Références
Acide aminé
Mutations (n)
Délétion 576
1
11
Monsel et al., Oncogene 2010
Délétion 579
1
11
Satzger I et al., Br J Cancer 2008
Délétion 554-559
1
11
Beading C et al., Clin Cancer Res 2008
Délétion intronique (-1)
1
Duplication de 7 codons
1
11
Hodi FS et al., J Clin Oncol 2008
Délétion 566-572
1
11
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
Délétion 566-574
1
11
Torres-Cabala et al., Mod Pathol 2009
712 | La Lettre du Cancérologue ̐ Vol. XX - n° 9 - novembre 2011
Exon
Références
Curtin JA et al., J Clin Oncol 2006