Modèles d`enzymes

Modèles d’enzymes
•
•
•
•
systèmes conçus pour mimer les substrats et les catalyseurs des réactions enzymatiques
facilitent l’étude mécanistique d’une réaction similaire à la réaction enzymatique
informations mécanistiques ainsi accueillies peuvent avancer notre compréhension de la
catalyse enzymatique et nous permettre de concevoir d’autres catalyseurs
section organisée selon les enzymes étudiées, leurs mécanismes natifs et leurs modèles
d’enzyme représentatifs
Références
A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism
R.B. Silverman, The Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions
Voet & Voet, Biochemistry
1
Phosphodiesterase
• catalyse l’hydrolyse des liens P-OR dans des phosphodiesters : (RO)P(O)O• enzyme digestive qui catalyse l’hydrolyse de l’ARN en nucléotides
Ribonucléase A
• première enzyme dont la séquence a été déterminée en 1960 (seulement 124 acides aminés)
• synthétisée par Merrifield en 1969
• Moore et Stein ont gagné le Prix Nobel en 1972 pour les techniques de séquençage qu’ils ont
développées pour déterminer la séquence de la RNase A
• l’ARN est clivé avec préférence (spécificité) pour une base de côté 3' de pyrimidine (uracile
ou cytosine)
Site actif de la ribonucléase A.
Notez l’orientation des groupes imidazoles des résidus His12 et His119.
Mécanisme
• l’ARN est clivé, mais pas l’ADN, à cause de la cyclisation avec 2'-OH qui a lieu, suivie par
l’hydrolyse lente du phosphate cyclique intermédiaire
• profil pH-vitesse : deux valeurs de pKa provenants du kcat / KM vs pH : 5.22 et 6.78 (enzyme
libre) ou 6.3 et 8.1 provenants du kcat vs pH (complexe enzyme-substrat)
• deux mécanismes ont été proposés pour la réaction catalytique : un mécanisme
« concomitant » et un mécanisme « séquentiel »
2
•
mécanisme « concomitant » :
R
R
O
O
P
O
O
O
O
CH2
P
O
O
C
O
CH2
NH
C
O
N
O
O
O
P
NH
H
H
His12
O
O
O
H
His12
O
P
NH
N
N
CH2
O
H
OH
A
O
His119
O
NH
N
O
P
His119
OH
O
R
O
O
OR'
O
P
O
O
CH2
C
O
O
O
P
O
3
O
O
H
•
mécanisme « séquentiel » :
R
R
O
O
O
P
O
O
P
O
O
O
CH2
CH2
C
C
O
O
NH
N
O
O
O
P
O
H
HO
O
N
CH2
H
P
O
CH2
A
A
O
O
His119
O
O
P
O
OH
O
O
OH
P
O
OR'
OR'
O
His12
H
O
O
NH
O
R
R
O
O
P
O
O
P
O
O
O
CH2
CH2
C
C
O
O
NH
H
O
O
O
O
H
H
NH
O
NH
N
H
A
O
His119
P
OR'
O
O
P
O
CH2
C
O
O
O
P
O
P
OR'
O
4
OH
O
O
O
A
O
R
O
triester intermédiaire
CH2
His119
OH
O
O
O
N
CH2
O
His12
O
P
P
O
N
O
H
O
Modèle de Breslow
• site de liaison fonctionnalisé avec des groupements catalytiques
• figure la liaison d’un modèle de substrat par un modèle d’enzyme (« enzyme artificielle ») (J.
Mol. Cat. 1994, 91, 161-174)
Cyclodextrine
•
•
•
•
•
•
polymère cyclique du α-D-glucopyranose
la cyclodextrine peut comprendre six (α), sept (β) ou huit (γ) unités de glucose
son intérieure est relativement hydrophobe, son extérieure est relativement hydrophile
(soluble dans l’eau)
forme un cavité avec des groupements OH primaires autour du bout étroit et des groupements
OH secondaires situés au bout plus large
diamètre interne du β-CD est ~7.0 Å (parfait pour l’inclusion d’un anneau aromatique)
groupes fonctionnels (OH) rendent le CD plus susceptible à modification synthétique, pour
introduire des groupes réactifs
OH
HO
HO
OH
O
O
O
OH
O
O
OH
OH
OH
HO
O
HO
OH
OH
O
HO
O
HO
O
β-cyclodextrine :
(1,4-α-D-glucose)7
OH
O
OH
OH
HO
O
O
O
HO
O
OH
HO
5
•
Breslow a synthétisé un β-CD substitué sur deux groupes hydroxyles primaires avec un
groupe imidazole :
N
N
HO
N
N
CH2
7
•
Breslow a aussi synthétisé un phosphate cyclique (qui possède un groupe t-butylphényle qui
se lie bien dans la cavité) en tant que substrat pour la réaction d’hydrolyse suivante:
O
O
O
O
P
O
OH
O
H2O
OH
P
O
Données cinétiques
•
•
•
•
l’apparition du produit est mono-exponentielle (premier ordre) et démontre la cinétique de
saturation en fonction de la concentration du phosphate cyclique (liaison du substrat suivie
par la réaction du complexe formé)
le profil pH-vitesse déterminé a la forme d’une cloche avec un sommet à pH 6.3 (la forme
active du modèle est mono-protoné)
l’effet isotopique de solvant mesuré est de 4 (effet isotopique primaire)
la grandeur de l’effet isotopique varie selon le pourcentage de D2O en solution (expérience
d’inventaire de protons, « proton inventory »), de manière concordante avec deux protons en
vol à l’état de transition (deux transferts de proton en cours)
6
•
mécanisme proposé : catalyse « bifonctionnelle » par le complexe « E•S » mono-protoné,
impliquant un acide général et une base générale :
H
H
N
N
N
N
O
H
N
O
O
P
N
O
H
O
N
O
P
O
N
O
O
+
N
HO
O
N
P
O
O
N
N
H
OH
N
N
O
H
OH
HO
N
O
P
N
O
N
H
N
N
HO
O
N
OH
P
O
+
7
O
O
OH
OH
P
O
O
•
•
•
•
de plus, ils ont étudié l’effet de la substitution d’un oxygène non-liant (sur le phosphore) par
un soufre : la réaction est légèrement ralentie, mais elle aurait été beaucoup plus ralentie s’il
y avait la formation d’un triester (avec un groupe hydroxyle du β-CD)
effets isotopiques aussi concordants avec un état de transition légèrement associatif
informations mécanistiques fournis par le modèle étaient utiles pour élucider le mécanisme
MAIS, ce mécanisme (concomitant, figurant la catalyse bifonctionnelle) a été confirmé par
l’étude directe de la réaction enzymatique…
8
Aminotransferases
•
•
enzymes qui participent à la dégradation des acides aminés et à l’expulsion de l’ammoniac
dépendent du coenzyme pyridoxal-5'-phosphate (PLP) / pyridoxamine phosphate (PMP) :
HO
H
CH2
H2C
NH2
O
C
O
-2
H2C
CH2
O
-2O PO
3
O3PO
N
CH3
H
pyridoxine
(vitamine B6)
O
H2C
-2
O3PO
N
CH3
N
CH3
H
H
pyridoxal-5'-phosphate
(PLP)
pyridoxamine-5'-phosphate
(PMP)
Site actif de l’aspartate aminotransferase, avec un analogue de la PLP.
Notez l’orientation de la Lys258.
9
Mécanisme
• catalysent le transfert d’un groupe amino d’un acide aminé au coenzyme, suivi par le transfert
du groupe amino du coenzyme à un α-cétoacide
•
dans la première étape de la réaction globale, un acide aminé réagit en tant que donneur du
groupe amino (comme une source d’ammoniac) et produit un α-cétoacide
•
dans la deuxième étape de la réaction globale, un deuxième α-cétoacide réagit comme un
accepteur d’ammoniac pour former un deuxième acide aminé
acide aminé1
+
Enzyme-PLP
α-cétoacide1
+ Enzyme-PMP
α-cétoacide2
+
Enzyme-PMP
acide aminé2
+ Enzyme-PLP
10
•
mécanisme général des aminotransferases :
R
H
Enzyme
H
CO2-
C
NH2
R
(CH2)4
+
Acide
α-aminé H2C
H
N
N
C
H
H
H2C
O
O3PO
N
R
(CH2)4
NH2
H
N
O
N
CH3
H
H
OH
Enzyme
H
H2N
N
C
H
H
H2C
R
H
H
N
C
H
H2C
O
CO2-
C
(CH2)4
CO2-
C
NH2
Base de Schiff
Acide aminé-PLP
R
(CH2)4
CH3
H
Intermédiaire
Diamine géminal
Enzyme
H
-2O PO
3
CH3
Base de Schiff
Enzyme-PLP
N
H2C
O
CO2-
C
C
-2O PO
3
-2
H
Enzyme
Enzyme
CO2(CH2)4
H
N
C
H
H
C
O
-2
-2O PO
3
O3PO
N
Cétimine
N
CH3
H
H
H
R
(CH2)4
NH2
Enzyme
O
Enzyme
H
H
CH3
(CH2)4
CO2-
C
NH2
N
C
H
H
H2C
H
H
N
C
H
H2C
O
O
-2
O3PO
-2
O3PO
N
+
N
CH3
CH3
R
C
CO2-
H
H
Carbinolamine
Enzyme•PMP
O
H
R'
R'
O
C
CO2-
NH2
11
C
CO2-
Acide α-céto
Modèle de Breslow
• les groupes coenzymes PLP et PMP peuvent tout seuls catalyser la plupart des réaction dans
lesquelles ils sont impliqués, mais les réactions en absence du reste de l’enzyme sont plus
lentes et ne démontrent pas de sélectivité
• Breslow a donc synthétisé un β-CD substitué avec un groupe PMP (Science 1982, 218, 532537 ; JACS 1980, 102, 421-422)
H
N
H
H C
H
OH
CH2
CH3
N
HO
S
CH2
CH2
7
β-cyclodextrine-PMP
•
le β-CD-PMP est capable de transformer des α-cétoacides en acides α-aminés :
H
N
O
H
H C
H
H
OH
CH2
C
OH
CH2
CH3
N
N
O
S
CH3
NH2
S
CH2
CH2
+
R
+
CO2H
β-cyclodextrine-PLP
β-cyclodextrine-PMP
12
R
CO2H
Liaison (?)
•
•
•
•
les α-cétoacides aromatiques transformés en acides-aminés plus rapidement que les
α-cétoacides alkyles ; e.g. Trp produit ~200 fois plus rapidement que Ala
cette préférence n’a pas été observée pour la réaction avec la PMP tout seul
cette observation a été interprétée en termes de la liaison du bicycle aromatique dans la cavité
de la cyclodextrine…
MAIS, aucune cinétique de saturation n’a été rapportée…
Stéréosélectivité
•
•
•
•
la cavité est chirale (formée des monomères chirales), ce qui permet de la stéréosélectivité ;
e.g. : 3 fois plus de L-Phe est produit que D-Phe, ce qui n’est pas observé avec le PMP tout
seul (MAIS : Rappel : ee = quel % ? seulement 50 %)
par contre, cette comparaison a été faite pour un α-cétoacide qui ne réagit pas très bien ; dans
le cas d’un α-cétoacide plus réactif, aucune comparaison n’a été faite (réactivité vs
sélectivité ?)
(en raison de comparaison, un dérivé chiral de la PMP a été synthétisé par le même groupe de
recherche (JACS 1984, 106, 1490) et donne des ee de 92%)
Catalyse
•
le système est catalytique ; en présence d’un deuxième acide aminé (source du groupe amino)
le coenzyme est régénéré ; un acide aminé est converti en cétoacide et un cétoacide est
converti en acide aminé
•
appelé «la première génération des transaminases artificielles » MAIS qu’est-ce qui arrive
depuis les années 80 ? ?
récemment, les dérivés modifiés ont été synthétisés (Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 709-714)
mais l’énantiosélectivité est encore modeste et aucune autre étude mécanistique n’a été
rapportée…
•
13
Protéases à Sérine
• catalysent l’hydrolyse (des esters et) des amides – les protéines, les peptides
• étudiées deouis 40 ans, leur mécanisme est parmi les mieux compris (surtout pour la trypsine,
la chymotrypsine, l’élastase et la subtilisine)
• contiennent un triad catalytique de Ser, His et Asp :
Triade catalytique au site actif de la chymotrypsine :
Ser195, His57, Asp102
14
Chymotrypsin
• provient de la pancréas et aide à la digestion des protéines à l’intestin
• catalyse l’hydrolyse du lien peptidique « après » (de côté du terminus C) un acide aminé dont
la chaîne latérale contient un groupe aromatique – Phe, Trp, Tyr)
Mécanisme
• cinétique biphasique dans la réaction avec le pNPA : une phase rapide à l’état préstationnaire, suivie par une phase lente à l’état stationnaire (implique la formation d’un
intermédiaire) :
[p-nitrophenolate] (mM)
4
[E]=0.8 mg mL-1
3
2
[E]=0.4 mg mL-1
1
0
0
2
4
6
8 10
Temps (min)
12
(Biochem. J. 1954, 56, 294)
•
•
l’intermédiaire impliqué est l’acyl-enzyme ; le cycle catalytique figure une étape d’acylation
(N!O) et une étape de désacylation (O!O)
le profil pH-kcat plafonne à haut pH (pKa ~7) (la forme basique de l’imidazole est nécessaire
pour la catalyse)
15
O
H
O
N
R
R'
H
N
R
R'
O
O
H
H
N
N
N
Ser
H
His
O
O
O
O
R'
N
N
H
O
His
O
H2O R'NH2
H
O
His
Asp
O
Asp
H
O
O
N
Ser
Acyl-enzyme intermédiaire
O
R
N
O
N
Ser
Asp
H
H
R
H
O
O
Intermédiaire tétraédrique
H
R
H
His
Asp
Complexe Michaelis
O
N
Ser
O
O
H
O
H
R
N
N
Ser
H
O
O
H
N
His
O
Intermédiaire tétraédrique
•
•
N
Ser
Asp
H
O
His
O
Asp
le mécanisme a été vérifié en étudiant le mécanisme d’inhibition de l’enzyme par des
inhibiteurs naturels (qui empêchent, par exemple la digestion catalytique de la pancréas!) qui
sont des analogues de l’état de transition pour la formation de l’intermédiaire tétraédrique
un aspect important de l’enzyme est la présence d’une poche oxyanionique (« oxyanion
hole ») qui stabilise l’intermédiaire tétraédrique, mais pas le groupe carbonyle du substrat
16
Modèle de Bender
• Bender a couplé un modèle d’un site de liaison (oui, c’est encore un cyclodextrine !) avec un
modèle de la triade catalytique des protéases à sérine
• en fait c’était un des premiers modèles d’enzyme d’incorporer tous les composants du
système enzymatique, dans la même molécule, pour participer à une réaction
intermoléculaire avec un modèle de substrat
• la molécule choisie comme un modèle de substrat était l’acétate de p-t-butylphényle (ce qui
n’est pas, malheureusement, un amide !)
O
H3C
O
+
O
CO2-
N
N
H
CO2-
N
H
H3C
O
N
H
O
H
O
S
S
O
CO2N
N
H
O
HO
H
CO2-
N
N
H3C
H
O
O
S
S
CH3CO2-
17
H
Données cinétiques
•
•
[p-t-butylphenolate]
•
cinétique de saturation observée, permettant le calcul des constantes kcat et KM (en indiquant
qu’il y a la formation d’un complexe de liaison)
1 mmol de catalyseur a effectué l’hydrolyse de > 10 mmol de substrat (regéneration de
catalyseur; la vraie catalyse)
cinétique biphasique : l’observation d’un « burst » au graphique de [produit] vs time
(formation rapide d’un intermédiaire dont la réactivité limite la vitesse de la réaction à l’état
stationnaire) :
Temps
(Acc. Chem. Res. 1987, 20, 146-152.)
•
•
•
•
la réaction est trois fois plus lente dans le D2O que dans l’eau (ce qui indique qu’il y a un
proton en vol à l’état de transition et suggère que le mécanisme entraîne la catalyse de base
générale et ne pas la catalyse nucléophile, ce qui est aussi possible avec des imidazoles)
le profil pH-kcat plafonne au-delà de pH 10 (ce qui indique que la forme basique est active et
est à l’appui d’un rôle en tant que base générale pour le groupe phénylimidazole)
comparaisons (par l’auteur!) entre la chymotrypsine et la « chymotrypsine artificielle » :
o modèle plus stable par rapport aux conditions de pH et température
o modèle plus efficace que l’enzyme par rapport à leurs masses moléculaires
o le point de départ pour la synthèse des « enzymes artificielles »
o « the ultimate proof of the mechanismof chymotrypsin catalysis »
MAIS, la chymotrypsine catalyse l’hydrolyse des amides au pH 7 !
18
Modèle de Brown
• Brown a proposé un modèle de la triade catalytique des protéases à sérine sans aucun site de
liaison
•
il a aussi proposé un modèle de substrat qui ressemble beaucoup plus au substrat natif (et
pourrait avoir un mécanisme d’hydrolyse plus similaire) :
H
N
N
O
O
H
N
O
O
N
GBC
N
N
H
H
O
O
O
GBC
O
H
N
N
OH
O
O
N
H
O
O
(JACS 1989, 111, 1445-1451)
19
Protéase à Cystéine
• catalysent l’hydrolyse des (esters et des) amides – les peptides, les protéines
• étudiées deouis longtemps, leur mécanisme est assez bien connu, surtout pour la papaïne
• contiennent un « triade » catalytique de Cys, His (et Asx : Asp ou Asn)
Papaïne
• provient du papaye ; son rôle physiologique est (peut-être) de catalyser l’hydrolyse des
enzymes digestives des insectes qui mangent les feuilles ou le fruit
Site actif de la papaïne : His159 et Cys25.
Mécanisme
• le profil pH-kcat montre des valeurs de pKa cinétique de 4.2 et 8.3 (la Cys25 et la His159 du
site actif sont actives sous forme zwitterionique (thiolate imidazolium) au pH neutre)
• il n’y a aucun cas rapporté de la catalyse de base générale de l’attaque nucléophile d’un thiol ;
c’est toujours la forme thiolate qui fait l’attaque
• l’hydrolyse des anilides substitués donne un graphique de Hammett dont ρ = -1.04, et l’effet
isotopique pour l’azote du groupe partant est assez grand (k 14 N k 15 N ) = 1.024 (ce qui
suggèrent que le départ de l’amine est impliqué dans l’état de transition de l’étape limitante
(i.e. la décomposition de l’intermédiaire tétraédrique) :
20
O
H
O
H
N
R
N
R
R'
R'
S
S
H
H
N
N
N
Cys
N
Cys
H
H
His
His
Intermédiaire tétraédrique
Complexe Michaelis
O
O
H
O
R
H
R
H
S
H
N
R'
S
N
N
N
Cys
H2O R'NH2
H
N
Cys
His
H
His
Acyl-enzyme intermédiaire
O
H
O
O
R
H
O
S
H
R
N
N
H
S
Cys
H
N
N
His
Intermédiaire tétraédrique
•
H
Cys
His
pour l’étape de désacylation, l’effet isotopique dans le D2O est de ~3 et le profil pH-kcat
plafonne au-delà de pH ~4 (catalyse de base générale de l’hydroyse de l’acyl-enzyme)
21
Modèles avant Brown
• la plupart de modèles figurent la réaction intramoléculaire des thiolesters substitués avec des
groupements imidazoles, ou la réaction intermoléculaire entre des thioles (et thiolamines) et
des esters activés (oui, c’est encore le pNPA)
• par contre, aucun modèle n’a démontré la collaboration entre le groupe amino et le groupe
thiol
• de plus, très peu de systèmes modèles entraîne la réaction intermoléculaire entre des
thiolamines et des amides (pourquoi? les amides réagissent très lentement…)
Modèle de Brown
Modèle de substrat
•
Brown a synthétisé un amide tendu (JOC 1986, 51, 2676) qui figure la distorsion du lien
amidique et diminue ainsi l’importance de la stabilisation due à la résonance, le rendant plus
susceptible à l’attaque nucléophile :
O
hydrolysé 107 fois plus rapidement que
N
O
•
N
CH3
CH3
l’amide tendu est supposé de ressembler à un peptide lié au site actif d’une protéase
(déstabilisation de l’état fondamental du complexe Michaelis lors de la distorsion du substrat)
Modèle d’enzyme
•
Brown a proposé un modèle simple (qui ressemble à son modèle d’une protéase à sérine), qui
comprend deux groupements importants : un thiol alkyle et un imidazole simple (par rapport
aux thiophénols et aux benzimidazoles)
e.g. :
SH
N
N
CH3
•
la synthèse des ces modèles est légèrement plus compliqué, et ils sont légèrement plus
susceptibles à l’oxydation (tout comme les protéases à cystéine !)
22
Données cinétiques
•
•
•
•
•
•
•
le progrès de la réaction est suivi lors de l’ouverture du cycle pour « libérer » l’aniline comme
chromophore
pas de cinétique de saturation (parce que le modèle ne contient aucun site de liaison !)
réaction de deuxième ordre
la régénération du catalyseur est très lente (l’étape de « désacylation » est plus lente que
l’étape « d’acylation »)
le profil pH-vitesse a la forme d’une cloche (ce qui signifie que la vitesse maximale est
réalisé lorsque le système est sous la forme « monoprotonée »)
les valeurs des pKa ont été déterminées d’être 6.48 et 9.25 (probablement du thiolimidazole et
pas de l’amide)
au pH 7, ~70 % du modèle d’enzyme existe en forme zwitterionique :
SH
N
N
CH3
H
N
N
SH
N
N
CH3
CH3
H
S
N
N
CH3
23
k2 [amide]
S
•
mécanisme proposé (JACS 1992, 114, 7983-7989):
N
N
O
N
O
S
H
S
OH
H
N
N
S
N
N
N
CH3
N
CH3
CH3
S
N
H
O
N
N
O
S
CH3
N
N
N
H
CH3
H2O
GBC
OH
S
O
+
N
H
N
N
CH3
H
•
•
•
•
il est à noter que la forme zwitterionique est active parce qu’elle contient un nucléophile
(thiolate) et un agent de protonation du groupe partant
il n’y a pas de catalyse de base générale de l’attaque nucléophile du thiol tout comme il n’y a
pas de catalyse d’acide général pour l’expulsion du thiolate (selon la loi de réversibilité
microscopique)
l’état d’ionisation de la forme active appuie la proposition que le site actif de la papaïne est
aussi active en cette forme
l’effet isotopique cinétique est 1.0 (ce qui signifie qu’il n’y a pas de proton en vol à l’étape
limitante de la réaction ; c’est soit l’attaque nucléophile ou la décomposition de
l’intermédiaire tétraédrique « piégé »)
24
Conclusions et pertinence
•
•
•
ce modèle est à l’appui de l’hypothèse que c’est bien la forme zwitterionique du site actif qui
est en le bon état d’ionisation pour faire la catalyse
le catalyseur est assez efficace pour l’hydrolyse et la formation des amides (JACS 1994, 116,
4669-4673) (application ?)
un autre élément important de cette étude est la différence entre le profil pH-vitesse pour la
réaction de l’amide avec la catalyseur et celui pour la réaction avec le pNPA :
N
O
2-
H
H
SH
N
log k2obs
1-
S
N
N
N
N
CH3
N
CH3
0-
S
CH3
O
CH3
O
O2N
-1 4
5
6
7
8
9
10
11
pH
•
•
on voit ici que les mécanismes ont des dépendances de pH qui sont assez différentes (le
pNPA n’ayant pas besoin de protonation de son groupe partant et étant capable de réagir avec
les deux formes de thiolate)
ceci démontre l’importance de la conception du modèle vis-à-vis la pertinence des résultats
au système biologique…
25
Métallophosphatase
• catalysent l’hydrolyse des phosphates (monoesters)
• joue un rôle important dans le phénomène de la transduction de signal : la phosphorylation
est souvent utilisée pour activer des protéines (enzymes) dedans la cellule :
• e.g. : la phosphorylation d’une Sér rend le résidu ionique (négativement chargée) et
capable d’attirer des Arg pour effectuer un changement de conformation de la
protéine
Enzyme modificative
forme
moins
active
K1
M
+ e1
M•e1
forme
plus
active
ATP
ADP
OH
forme
moins
active
P
E
Enzyme ciblée
Pi
forme
moins
active
D
+
E*
forme
plus
active
H2O
e2
D•e2
K2
forme
plus
active
Enzyme démodificative
Représentation générale d’un cascade de régulation enzymatique
•
•
les phosphatases sérine/thréonine ont besoin de deux ions métalliques pour leur activité, ce
qui suggère un mécanisme associatif qui entraîne l’activation des phosphoesters par deux
acides de Lewis
O
ces enzymes lient les phosphates sous forme oxyanionique :
RO
P
O
26
O
Phosphatase de phosphoprotéine 1
• rôle physiologique : métabolisme du glycogène aux muscles ; déphosphorylation (et donc
désactivation) des enzymes qui catalysent la phosphorylation (qui résulte en la
consommation) du glycogène :
Enzyme modificative: Phosphorylase kinase
forme
moins
active
K1
M
+ e1
M•e1
ATP
forme
plus
active
ADP
OH
forme
Synthèse
moins
du glycogène
active
E
P
Enzyme ciblée:
Glycogène phosphorylase
Pi
forme
moins
active
D
+
(activée par l'épinephrine)
e2
E*
forme
plus Consommation
active du glycogène
H2O
D•e2
K2
forme
plus
active
(activée par l'insuline)
Enzyme démodificative: Phosphoprotéine phosphatase-1
•
transduction des signaux : nettement, la PP1 est activée par l’insuline pour « communiquer le
message » de synthétiser le glycogène, tandis qu’elle est désactivée par l’épinéphrine pour
transmettre le message de consommer le glycogène
27
•
existe sous forme d’un complexe dinucléaire avec MnII et FeII :
O
Asp95
O
H
His125
N
Tyr272
N
H
Asn124
O
O
O
R
HO
P
O
O
NH2
HOH
O
HO
FeII
MnII
Asp64
O
NH
N
O
HN
His248
O
HN
N
N
Asp92
His66
His173
•
•
les ions métalliques exaltent la nucléophilie d’une molécule d’eau (qui est rendue
effectivement un anion hydroxyde)
selon les résultats des expériences de mutagenèse, le résidu de la His éloignée est aussi
important ; l’enzyme mutée H125A est inactive
• la His125 joue probablement le rôle d’un acide général qui catalyse le départ de l’alcool
28
Modèles de Chin
• complexe dinucléaire avec deux atomes de CoIII qui réagit de manière intramoléculaire pour
donner le produit d’hydrolyse (voir Acc. Chem. Res. 1999, 32, 485-493 et JACS 1999, 121,
3341-3348):
X
O
O
O
HN
HN
Co3+
NH
O
O
P
P
H
O
O
O
H
NH
Co3+
O
NH
H2O
HN
HN
NH
Co3+
NH
H
O
O
H
O
Co3+
NH
NH
NH
X
O
Données pH-vitesse
•
•
la valeur de log khyd augmente de manière linéaire avec le pH (entre ~5 et ~13); i.e., khyd
dépend de la concentration de –OH (alors la forme basique du système est la forme active)
MAIS le pKa cinétique ne peut pas être déterminé sans un plateau du graphique (pKa > 13?)
Données d’échange d’isotope
•
•
l’étude de la réaction effectuée dans le H2O18 indique qu’aucun 18O n’est incorporé dans le
produit d’hydrolyse (alors la réaction est intramoléculaire)
en suivant la réaction du composé marqué avec 18O dans le H2O par RMN-31P, le couplage
31 18
P- O indique qu’un nouveau lien P-18O est formé (ce qui suggère que la réaction
intramoléculaire implique un attaque nucléophile sur le phosphore par un oxygène)
Données du graphique de Brønsted
•
•
•
le changement du groupe partant aux « substrats » (phosphoesters aromatiques) affectent
assez fortement la constante de vitesse observée à un pH donné : βlg = -1.1 (ce qui indique
qu’il y a du bris partiel du lien P-OAr à l’état de transition)
une fois que l’on corrige pour l’effet sur l’équilibre, on peut calculer la charge sur l’oxygène
partant à l’état de transition et donc le degré de bris du lien : 67 % brisé (ce qui est loin de
complet et donc le mécanisme est seulement partiellement dissociatif (et donc partiellement
associatif))
c’est dommage qu’on pouvait pas déterminer si le groupe substituant influençait aussi le pKa
cinétique…
29
Mécanisme proposé
X
X
O
O
O
HN
HN
Co3+
NH
O
O
+ L2O
P
H
O
O
O
H
NH
Co3+
+ L3O+
P
O
Ka
NH
HN
Co3+
HN
NH
NH
O
O
Co3+
O
H
X
NH
NH
NH
k
O
O
O
O
P
P
O
HN
HN
Co3+
NH
•
H
O
O
H
O
O
Co3+
NH
HN
NH
HN
Co3+
NH
NH
O
O
O
H
Co3+
NH
NH
NH
système est facile (?) à caractériser, mais il ne représente qu’une réaction intramoléculaire
modèle (pas de catalyse)
Données des effets isotopiques
•
•
•
•
•
•
l’effet isotopique de solvant (D2O plutôt que H2O) sur kobs ( = kKa / Kw) est inverse et égale
0.56
pour une réaction qui implique la réaction intramoléculaire de la forme basique d’un
composé, cet effet est le résultat de la combinaison des effets isotopiques sur l’acidité du
composé (Ka), l’acidité du solvant (Kw) et la solvatation des produits libérés dans l’étape
limitante (k)
l’effet sur k est calculé d’être assez petit (désolvatation), ~1.1
l’effet sur 1/Kw est connu d’être 0.135
l’effet sur Ka est habituellement entre 2.5 et 4 pour acides oxygénés et peut être calculé (selon
kobs = kKa / Kw) d’être 3.8 ( 0.56 = 0.135 × 1.1 × 3.8 )
(effets isotopiques concordants avec mécanisme proposé, mais n’aident pas à la proposition
d’un mécanisme, sauf peut-être l’ionisation avant l’étape limitante)
30
•
grâce au changement du modèle – en utilisant le CuII plus labile – la réaction intramoléculaire
modèle avec ApA (plus pertinente?) a été démontrée :
Ad
HO
O
O
HO
OH
HN
HN
•
•
O
O
P
O
Cu2+
OH
N
Ad
H O
O
Cu2+
HO
NH
NH
N
MAIS, aucune évidence de catalyse pour les deux modèles
réactions modèles sont quand même 103 – 106 fois plus rapides que les réactions de fond
31
Décarboxylases
• enzymes métalliques (e.g. décarboxylase d’oxaloacétate) et non-métalliques (e.g.
décarboxylase d’acétoacétate) qui catalysent la décarboxylation des acides caroxyliques
Décarboxylase d’acétoacétate
• joue (possiblement) un rôle métabolique chez les micro-organismes
• catalyse la décarboxylation de l’acétoacétate pour donner l’acétone et le dioxyde de carbone :
O
O
C
H3C
•
C
CH2
O
O
+
C
OH
H3C
CH3
C
O
utilisée pendant la première guerre mondiale pour la production de l’acétone, un composant
important de la colle pour les ailes des avions, à partir de l’acétoacétate, un produit naturel
hautement disponible
Mécanisme proposé
•
le mécanisme a été proposer d’impliquer la catalyse covalente, plus spécifiquement la
formation d’une base de Schiff (à partir d’un résidu de Lys) :
CO2
O
O
H+
O
O
Réaction chimique :
H3C
O
Réaction enzymatique :
H3C
H3C
CH2
CH3
RNH2
RNH2
-OH
-
OH
R
H3C
CO2
H
N
R
O
H
N
O
H3C
32
CH2
H+
R
H
N
H3C
CH3
Expériences de marquage
•
Westheimer a trouvé que la réaction enzymatique avec acac-18O produit de l’eau marquée :
18O
O
C
C
CH2
H3C
•
acétoacétate
décarboxylase
OH
O
H2O
H3C
H218O
+ CO2 +
C
CH3
Westheimer a également montré que la réaction enzymatique effectuée dans le D2O donne de
l’acétone marqué :
O
C
H3C
acétoacétate
décarboxylase
O
C
CH2
OH
O
H3C
HOD
+ CO2 +
C
D2O
CH2D
Piégeage
•
Westhemier a aussi « quenché » (éteint) la réaction enzymatique lors de l’ajout du NaBH4 qui
réduit la base de Schiff pour piéger l’enzyme en forme alkylée au résidu Lys115 :
R
H3C
CO2
H
N
R
O
H
N
O
H3C
CH2
H+
R
H
N
H3C
CH3
NaBH4
R
H
N
H3C
33
H
CH3
Mutagenèse
•
l’enzyme mutée K115C est inactive ; MAIS la modification de la Cys115 avec 2bromoéthylamine (Gerlt & Kenyon) restaure l’activité ! (« chemical rescue ») :
mutagénèse
SH
BrCH2CH2NH2
S
H2N
H2N
active
Cys115
Cys115
Lys115
inactive
34
active
Décarboxylase d’oxaloacétate
• catalyse la décarboxylation de l’oxaloacétate :
HO
C
C
C
HO
C
CH2
C
OH
CH3
C
+
O
O
O
acide oxaloacétique
•
O
O
O
O
acide pyruvique
le mécanisme enzymatique dépend de la présence d’un métal – Mn2+ ou Mg2+
Expériences de marquage
•
la réaction enzymatique avec un β-cétoacide marqué donne la cétone marquée :
Mn2+
Mn2+
18O
-O
C
C
O
18O
O-
Mn2+
C
CH2
O
-
O
C
O
- CO2
C
CH2
C
18
O-
O
O
C
C
O
O
CH2
H
B
18
O
-
O
C
C
O
35
CH3
Application industrielle
•
le processus de Rozzell est utilisé pour synthétiser la Phe :
H2N
O
H
C
HO
C
C
CH2
OH
HO
O
C
C
C
O
CH2
oxaloacétate
décarboxylase
OH
acide oxaloacétique
+
O
HO
H2N
HO
C
C
R
O
2-cétoacide
+ C
C
C
CH3
O
transaminase
+
O
O
HO
O
acide L-aspartique
•
•
O
H
C
C
R
O
acide L-aminé
notez l’usage de la transaminase !
il serait préférable de pouvoir utiliser un catalyseur sans métaux…
36
acide pyruvique
O
Modèle de Benner
• catalyse de la décarboxylation de l’oxaloacétate selon le mécanisme de la décarboxylase
d’acétoacétate – catalyse covalente; formation d’une base de Schiff; pas de métaux
• conception (design) rationnelle d’un nouveau catalyseur de squelette protéique (Nature 1993,
365, 530-532.)
Conception
•
basée sur les critères jugées d’être critiques pour la catalyse, étant donné ce qui est connu du
mécanisme de la décarboxylase d’acétoacétate et du mécanisme de la réaction de
l’oxaloacétate avec une amine simple :
O
+
RNH2
-O
C
C
O
A
O
C
CH2
RHN
k1
-O
-
O
k-1
C
C
C
CH2
O
O
O
OH
O+
k2 [H ]
C
k-2
R
H
N
-
O
k3
O
R
-
O
C
C
CH3
O
P
+
RNH2
•
H
R
N
-O
C
C
O
N
C
C
H
-O
CH3
O
C
CH2
O-
I1
CO2
C
C
O
CH2
O
I2
critères pour la catalyse :
1. présence d’une amine primaire pour former une imine ; soit un groupe amino-α ou un
groupe amino-ε (Lys)
2. accélération de l’étape limitante : formation de l’imine I1 au-delà de pH 4
3. entre pH 4 et 7, l’étape limitante est l’élimination de l’eau à partir de la
carbinolamine, ce qui est catalysée par acide spécifique, alors les acides généraux ne
sont pas nécessaires
4. puisque la carbinolamine est l’intermédiaire de plus haute énergie, l’état de transition
pour la formation de l’imine à partir de la carbinolamine ressemble à la
carbinolamine ; donc, il faut stabiliser la carbinolamine pour stabiliser l’état de
transition et ainsi accélérer la réaction (comment? interactions électrostatiques)
37
5. l’amine libre est la forme active pour l’attaque nucléophile, mais βnuc = 0.5 ; alors
l’efficacité catalytique augmente par 0.5 unité de log lors de chaque unité de
diminution du pKa à un pH donné jusqu’à ce que le pKa ≈ pH ; au pKa < pH, la
concentration de l’amine libre augmente très peu, et la nucléophilie diminue encore;
(alors le pH optimal est ~ pKa )
6. la basicité de l’amine affecte similairement la probabilité de la réaction de l’imine
pour expulser un équivalent de CO2 ou de subir d’une attaque nucléophile par l’eau
(étape inverse) ; donc, le ratio de partition est indépendant du pKa de l’amine ; donc,
la perturbation de la basicité de l’amine n’affectera pas cette étape de catalyse
Réalisation
•
•
•
le squelette choisi est une hélice-α ; (ce qui baisse le pKa de l’amine-α par l’effet de dipôle
hélice)
plusieurs Lys sont situées à côté l’une de l’autre, ce qui perturbe leurs pKa par effet
électrostatique
synthétisé sur phase solide en utilisant « la chimie standard de Boc » ; purifié par HPLC
(phase inverse)
RNH
Côté hydrophobe
Leu
Leu
Leu
Leu
8 1 12
Leu
4
11
Leu
7
Ala
14
Lys
H2NCO
3 10
5
Ala
9
2
Ala
13
6
Lys
Lys
Lys
Lys
Côté hydrophile
RNH-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-CONH2
38
Données cinétiques
•
•
•
•
•
la structure hélice a été établie à l’aide des études de CD et des nOE, et à cause de la
dépendance de la concentration de TFE
le progrès de la réaction a été suivi par la disparition de l’énol de l’oxaloacétate et/ou la
formation de la pyruvate, détecté par sa réaction avec une enzyme
la cinétique de saturation a été observée, ce qui n’était pas observée avec des amines simples
(ce qui signifie qu’un complexe est formé – liaison ?)
la réactivité nécessite la formation de hélice – la protéine mutée est moins active (alors la
« liaison » dépend de la structure secondaire)
la réaction est accélérée : kcat / KM = 103 – 104 × k2 (pour des amines simples), « due à la
stabilisation électrostatique » :
k2
k3
k1
- CO2
Énergie
libre
interactions électrostatiques
C
M+O
perturbation du pKa
I1
A+O
Co-ordonnée de réaction
39
Comparaisons
•
par rapport, les anticorps catalytiques accélèrent la réaction 103 – 106 fois; la décarboxylase
d’oxaloacétate l’accélère 108 fois
la « liaison »,n’est pas aussi bonne avec l’acétoacétate (donc elle implique une spécificité –
probablement purement électrostatique ?)
la « stabilisation électrostatique » par autant de Lys est compliquée; mais la catalyse n’est pas
simplement due à la perturbation du pKa des amines; par contre l’augmentation de la
concentration effective de la Lys doit être aussi important (quelle(s) Lys font la catalyse ?
quelle expérience de contrôle pourrait-on faire ?)
•
•
•
il est à noter que l’on pourrait tenter de catalyser le processus de Rozzell à l’aide de deux
différents modèles d’enzymes :
• application potentielle : la catalyse de la synthèse stéréochimique des acides aminés par
des catalyseurs synthétiques ?
RNH
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Ala
A la
H2N
HO
O
H
C
O
CH2
HO
H
OH
N
H C
H
O
HO
CH2
acide oxaloacétique
O
H2N
HO
2-cétoacide
à la Benner
HO
+ C
C
C
CH3
CH3
N
S
+
O
Lys
O
+
R
OH
O
C
C
C
CH2
Lys
Lys
OH
CH2
acide L-aspartique
C
C
H
O
O
Lys
Lys
H2NCO
C
C
A la
O
à la Breslow
H
C
C
R
O
acide L-aminé
40
acide pyruvique
O
Catalyseurs « de novo »
• nouveaux catalyseurs qui sont conçus selon des critères pour la catalyse d’une réaction ciblée,
déterminées par des études mécanistiques précédantes de la réaction chimique et enzymatique
• miment des enzymes en principe mais pas nécessairement en détail
• souvent conçus pour catalyser des réactions jugées utiles ; par exemple :
Ligase peptidique
• dans un article récent (JACS 2001, 123, 1797-1803) Ghadiri résume très bien le domaine des
modèles d’enzymes et présente un système qui démontre la catalyse de la formation d’un lien
peptidique entre deux protèines (voir aussi Nature 1997, 389, 706-709)
Conception
•
•
•
le système démontre très bien l’importance de la complémentarité et de l’approche dans la
catalyse
deux hélices-α ont été conçues qui forment un dimer (« E•P ») ; la hélice-α « P » a été divisé
en deux fragments (« S ») avant un résidu Cys
le fragment N-terminal était dérivé en ester thiobenzyle et réagit avec le fragment C-terminal
de manière non-catalysée pour donner le produit « P » encore :
O
NH
S
S
HS
HN
H2N
O
O
NH
S
HN
H2N
P*
O
SH
O
NH
HN
HN
O
P
41
•
l’autre protéine du dimer (« E ») sert comme un gabarit pour rapprocher les deux fragments et
accélérer la réaction :
kuncat
Sα
α
ω
Sω
Sα
α
ω
Sω
P
E•Sα
α•Sω
ω
E
kcat
E•P
E•P*
Données cinétiques
•
•
•
•
la cinétique de saturation a été observée (ce qui signifie la formation d’un complexe des
réactifs)
la réaction en présence des quantités sous-stoechiométriques du gabarit est accélérée (~4000
fois) par rapport à la réaction en absence du gabarit et la vitesse réactionnelle dépend de la
concentration du gabarit (ce qui signifie la catalyse)
le thiol utilisé pour former le thiolester de départ a été varié et une relation « linéaire » a été
déterminée entre la constante de vitesse et le pKa de l’acide conjugué du groupe partant ; la
pente βnuc de ce graphique de Brønsted est ~ -0.2 (ce qui signifie que la vitesse réactionnel
dépend légèrement de la nucléofugalité de la thiolate, suggérant ainsi que le départ est
impliqué à l’état de transition de l’étape limitante)
« démonstration de la possibilité de concevoir des sites de liaison de substrat et l’utilité des
hélices-α dans la construction des enzymes artificielles », MAIS :
• la « conception » d’un site de liaison ? les substrats ont été « retro-conçus » à partir du
produit ! est-ce que le site démontre de la specificité (en compétition avec d’autres
substrats similaires) ?
• quel est le dépendance de pH du système ? par exemple, est-ce que l’ionisation du thiol
est importante ?
42
Commentaires
• distinction (subtile) possible :
• modèle d’enzyme : conçu pour ressembler à la structure de l’enzyme, étudié pour révéler
le mécanisme enzymatique (apprentissage)
• mimique d’enzyme : conçu pour mimer l’activité de l’enzyme, basé sur ce qui est déjà
connu du mécanisme, typiquement en incluant certains éléments de la structure, et
souvent utilisé pour catalyser une réaction similaire (application)
•
•
•
•
•
•
•
limitation de la pertinence du modèle d’enzyme est la qualité de la conception du système
très utiles au cours des années passées pour l’accueil des informations mécanistiques des
réaction enzymatiques
pas encore passé de mode !
MAIS, il est maintenant plus facile (qu’avant) d’étudier directement les réaction
enzymatiques
on a des outils de plus en plus puissants (e.g. biologie moléculaire, mutagenèse)
le développement de nouveaux catalyseurs est encore le but ultime de la modélisation des
enzymes, mais même ce dernier pourrait être réaliser en utilisant des techniques biologiques,
pour modifier des enzymes existantes pour mieux servir nos besoins (évolution dirigée)
la Professeure Pelletier vous en discutera…
43