Mise au point Retentissement de l’hétérogénéité intratumorale sur le diagnostic histopathologique et moléculaire The impact of intratumoral heterogeneity on pathologic and molecular diagnosis Marie-Christine Copin*, Fabienne Escande** pour la prescription de thérapies ciblées dans de nombreux cancers exige une meilleure connaissance de l’hétérogénéité intratumorale. Le diagnostic anatomopathologique et les caractéristiques morphologiques d’une tumeur sont une première approche de cette hétérogénéité, reflétée par la complexité croissante de la plupart des classifications des cancers. Les outils moléculaires modernes de plus en plus sensibles et puissants accentuent cette nécessité afin, d’une part, d’identifier les anomalies oncogéniques majeures susceptibles de devenir la cible de nouveaux traitements et, d’autre part, de ne pas méconnaître des anomalies plus rares, portées par des clones tumoraux minoritaires mais impliquées dans l’apparition d’une résistance au traitement. Mots-clés : Hétérogénéité – Cancer – Anatomopathologie – Séquençage nouvelle génération – Thérapies ciblées. L a notion d’hétérogénéité intratumorale est connue depuis longtemps mais, grâce aux récentes innovations technologiques, on constate une augmentation rapide des connaissances conceptuelles et mécanistiques. L’hétérogénéité intratumorale se décline à plusieurs niveaux : morphologique, immunophénotypique et moléculaire. Elle est la conséquence d’une instabilité génétique propre aux cellules tumorales, associée à une évolution clonale de type darwinien lors de la croissance tumorale (1). Dans le tissu tumoral, cette hétérogénéité peut être régionale, lorsque différents sous-clones dominent dans des parties distinctes d’une tumeur, ou “mosaïforme”, lorsque des cellules aux propriétés différentes sont mêlées dans la tumeur. Cette hétérogénéité évolue dans l’espace et le temps lors du développement tumoral (figure 1, p. 74) [2]. Dans la période actuelle d’évolution majeure SUMMARY RÉSUMÉ » L’importance actuelle de la détection des anomalies moléculaires The importance of the detection of molecular alterations for the prescription of targeted therapies in several cancer types requires a better knowledge of intratumoral heterogeneity. The pathologic diagnosis and the morphological characteristics of a tumor are a first approach of this heterogeneity, highlighted by the increasing complexity of the classifications of cancer. The sensitivity and the strength of molecular tools increases. We need to identify the major oncogenic alterations, potentially the target of new therapies and, on the other hand, not to miss less frequent alterations carried by minor clones which may be involved in resistance. Keywords: Heterogeneity – Cancer – Pathology – Next generation sequencing – Targeted therapies. des technologies de détection des anomalies moléculaires, la mise en évidence de cette hétérogénéité tumorale constitue un véritable enjeu pour le diagnostic et la sélection des patients en vue d’une prescription de traitements ciblés. Retentissement de l’hétérogénéité tumorale sur les différentes étapes de la prise en charge anatomopathologique L’hétérogénéité intratumorale, dans sa dimension morphologique et immunophénotypique, est connue de longue date des pathologistes, qui l’ont intégrée dans leur stratégie diagnostique. L’étape macroscopique, essentielle dans le diagnostic des tumeurs opérées, prend en compte cette hétéro- Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. III - n° 2 - avril-mai-juin 2014 * Institut de pathologie, Centre de biologiepathologie, CHU de Lille ; université de Lille II. ** Institut de biochimie, Centre de biologiepathologie, CHU de Lille. 73 Mise au point généité, quand elle existe, afin de sélectionner les zones d’intérêt pour l’examen microscopique. Il est recommandé d’échantillonner les tumeurs pour le diagnostic, au minimum un prélèvement par centimètre. Cette règle simple permet de ne pas méconnaître, à l’échelle microscopique, un contingent tumoral qui, bien que minoritaire, pourrait être essentiel au diagnostic. Dans les cas de carcinome sarcomatoïde du poumon, constitué d’une prolifération fusocellulaire qui mime un sarcome, il est important d’identifier un contingent Figure 1. Modèle “tronc-branches” du cancer rénal selon C. Swanton (2). 1. Anomalies portées par des clones minoritaires, éventuellement impliquées dans la résistance au traitement (par exemple : T790M dans le cancer du poumon). 2. Anomalies de distribution hétérogène dans une même tumeur ou entre la tumeur primitive et la métastase. 3. Anomalies à l’origine de l’instabilité génomique. 4. Tronc commun correspondant aux mutations “driver” précoces, présentes dans tous les échantillons tissulaires (par exemple, anomalies du gène VHL dans le carcinome à cellules claires du rein). Figure 2. Carcinome sarcomatoïde du poumon. À gauche, contingent tumoral sarcomatoïde (HES, × 100) ; à droite, contingent adénocarcinomateux (flèches) [HES, × 200]. 74 carcinomateux, souvent minoritaire, bien différencié (adénocarcinome ou carcinome épidermoïde) et qui permet de poser le diagnostic (figure 2). Dans ce type tumoral, la composante sarcomatoïde est souvent la seule représentée sur un prélèvement biopsique. Sur biopsie, ce diagnostic ne peut qu’être suspecté si la composante carcinomateuse n’est pas prélevée. Par ordre de fréquence, chez un sujet de plus de 50 ans, le diagnostic de carcinome sarcomatoïde est hautement probable par rapport au diagnostic de sarcome, les sarcomes pulmonaires étant rares (3). L’échantillonnage tumoral, qu’il soit macroscopique ou issu de prélèvements biopsiques multiples de type cartographie, est également indispensable pour déterminer de façon fiable le grade tumoral : par exemple, le grade de Fuhrman pour les cancers du rein, ou le grade de Gleason pour les cancers de la prostate (4, 5). Le grade 4 du score de Gleason est hétérogène sur le plan architectural et pourrait justifier à lui seul une sous-classification avec un impact pronostique (5). La mise en évidence, dans une tumeur hétérogène, d’un clone tumoral de grade élevé est souvent déterminante sur le plan pronostique, une faible différenciation, un index mitotique élevé et des atypies cytonucléaires marquées étant des facteurs de mauvais pronostic dans la plupart des carcinomes et des sarcomes (6). À l’échelle microscopique, l’hétérogénéité intratumorale est décrite depuis longtemps dans les classifications des différents types et sous-types tumoraux sur le plan diagnostique et dans l’évaluation des grades histopronostiques. Les carcinomes pulmonaires ont toujours été considérés comme des tumeurs hétérogènes initialement caractérisées par l’association de critères ultrastructuraux distincts d’une composante tissulaire à l’autre (7). La classification des adénocarcinomes, actualisée en 2011, en est un exemple (8). Elle rappelle l’importance de préciser l’existence de composantes tumorales de plus mauvais pronostic, comme l’adénocarcinome de type micropapillaire, souvent associé à d’autres contingents adénocarcinomateux de morphologie différente. L’hétérogénéité intratumorale peut également être l’expression d’une progression tumorale, comme dans le lymphome folliculaire, lorsque sur biopsie, une zone de transformation en un lymphome diffus à grandes cellules B est identifiée. L’hétérogénéité phénotypique évaluée par le pathologiste, par immunohistochimie, constitue également une source de difficultés diagnostiques pour les marqueurs de différenciation, ou de manque de reproductibilité, par exemple, pour les marqueurs de prolifération. Le carcinome pulmonaire connu pour sa diversité morpho- Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. III - n° 2 - avril-mai-juin 2014 Retentissement de l’hétérogénéité intratumorale sur le diagnostic histopathologique et moléculaire logique, peut être très hétérogène au sein d’une même tumeur, sur le plan phénotypique. Les marqueurs de différenciation, comme les différents types de cytokératines sont particulièrement concernés par cette hétérogénéité. Même le facteur de transcription TTF-1, à la fois marqueur d’adénocarcinome et de l’origine pulmonaire des carcinomes, peut être très hétérogène, en fonction de la différenciation tumorale. TTF-1 est peu, voire n’est pas exprimé dans les adénocarcinomes mucineux du poumon. Nous avons montré que l’expression de TTF-1 était inversement corrélée à celle de la mucine MUC5B et que le gène MUC5B était régulé négativement par TTF-1 (9). Dans un même adénocarcinome, en fonction de la production de mucus de la cellule tumorale, des zones TTF-1+ peuvent coexister avec des zones avec sécrétion de mucus TTF-1−. Enfin, l’examen microscopique, éventuellement complété d’une étude immunohistochimique, permettra d’éliminer une fausse hétérogénéité représentée par la présence de cellules normales englobées dans la tumeur. Retentissement de l’hétérogénéité intratumorale sur le diagnostic moléculaire Une tumeur maligne est constituée de différentes sous-populations homogènes ou hétérogènes sur le plan morphologique, qui peuvent se révéler très différentes sur le plan génétique. La question de la justesse des approches moléculaires dans la décision diagnostique ou thérapeutique se pose de plus en plus. Alors que les techniques de prélèvement pour le diagnostic de cancer, de moins en moins invasives, permettent d’obtenir des échantillons tissulaires de plus en plus petits, voire uniquement des échantillons cytologiques, chacun s’interroge sur la représentativité de ces échantillons tumoraux. La question d’une éventuelle hétérogénéité des mutations au niveau des “drivers” oncogéniques est au cœur du débat. D.L. Longo, en 2012, dans son éditorial du New England Journal of Medicine, cite Albert Einstein : “Things should be made as simple as possible but not simpler” (10). Cet éditorial introduit les travaux récents de l’équipe menée par C. Swanton, du Cancer Research UK London Institute, qui montrent, sur des échantillons tissulaires, issus de 4 patients porteurs d’un carcinome du rein métastatique, que les 2/3 des mutations trouvées dans une biopsie donnée, n’étaient pas détectables dans tous les échantillons prélevés dans une même tumeur. De plus, le profil mutationnel pouvait être, dans la même tumeur, selon l’échantillon considéré, tantôt de “bon pronostic”, tantôt de “mauvais pronostic” (11). Les anomalies du gène VHL, considérées comme précoces dans le cancer du rein, étaient, elles, toujours présentes, quel que soit l’échantillon considéré. Dans le cancer du poumon, l’hétérogénéité intratumorale de la distribution des mutations du principal driver oncogénique, l’EGFR, semble rare (12). L’analyse par cartographie tumorale d’une série de 50 adénocarcinomes divisés en 3 échantillons et de 5 autres en 100 échantillons montre la présence de mutations du gène EGFR identiques dans les différents échantillons d’une même tumeur. Un des exemples caractéristiques des conséquences, en pratique courante, de l’hétérogénéité intratumorale morphologique et moléculaire est le carcinome adénosquameux qui associe un carcinome épidermoïde et un adénocarcinome dans la même tumeur, les 2 contingents tumoraux étant habituellement bien distincts. Ce type histopathologique qui, jusqu’à présent, n’avait pas de particularité pronostique, a de nouveau fait l’objet d’un débat récemment, à la lumière de l’intégration des données théranostiques. Une étude récente a montré que, lorsqu’une mutation du gène EGFR était détectée dans un carcinome épidermoïde sur des prélèvements biopsiques, il s’agissait dans la grande majorité des cas d’un carcinome adénosquameux dont la composante adénocarcinomateuse avait échappé à la prise biopsique. Ce carcinome, hétérogène sur le plan morphologique, se révélait donc homogène quant à la présence d’une mutation du gène EGFR : cette mutation était détectée dans les 2 composantes adénocarcinomateuse et épidermoïde (13). Cette constatation a une implication pratique essentielle, puisque, dans la plupart des centres français, la recherche de mutations du gène EGFR est maintenant réalisée, à partir des échantillons biopsiques, dans les carcinomes épidermoïdes du patient non fumeur. En effet, même si les mutations du gène EGFR sont rares dans les carcinomes épidermoïdes, il peut s’agir d’un carcinome adénosquameux méconnu et donc potentiellement porteur d’une mutation, comme le serait un adénocarcinome. Hétérogénéité intratumorale et résistance aux traitements Une question essentielle dans la compréhension des mécanismes de résistance aux inhibiteurs de tyrosine Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. III - n° 2 - avril-mai-juin 2014 Références 1. Marusyk A, Almendro V, Polyak K. Intra-tumour heterogeneity: a looking glass for cancer? Nat Rev Cancer 2012;12:323-34. 2. Swanton C. Intratumor heterogeneity : evolution through space and time. Cancer Res 2012;72:4875-82. 3. Copin MC. 2014 classification of lung carcinomas: latest entities and clinical implications. Case 3. Sarcomatoid carcinoma, pleiomorphic type. Ann Pathol 2013;33:314-7. 4. Novara G1, Martignoni G, Artibani W, Ficarra V. Grading systems in renal cell carcinoma. J Urol 2007;177:430-6. 5. Dong F, Yang P, Wang C et al. Architectural heterogeneity and cribriform pattern predict adverse clinical outcome for Gleason grade 4 prostatic adenocarcinoma. Am J Surg Pathol 2013;37:1855-61. 6. Neuville A, Chibon F, Coindre JM. Grading of soft tissue sarcomas: from histological to molecular assessment. Pathology 2014;46:113-20. 7. Saba SR, Espinoza CG, R i c h m a n AV, A z a r H A . Carcinomas of the lung: an ultrastructural and immunocytochemical study. Am J Clin Pathol 1983;80:6-13. 8. 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Rekhtman N, Paik PK, Arcila ME et al. Clarifying the spectrum of driver oncogene mutations in biomarker-verified squamous carcinoma of lung: lack of EGFR/KRAS and presence of PIK3CA/AKT1 mutations. Clin Cancer Res 2012;18:1167-76. 14. Turke AB, Zejnullahu K, Wu YL et al. Preexistence and clonal selection of MET amplification in EGFR mutant NSCLC. Cancer Cell 2010;17:77-88. 15. Lawrence MS, Stojanov P, Polak P et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancerassociated genes. Nature 2013;499:214-8. 16. Jiang L, Huang J, Morehouse C et al. Low frequency KRAS mutations in colorectal cancer patients and the presence of multiple mutations in oncogenic drivers in nonsmall cell lung cancer patients. Cancer Genet 2013; 206:330-9. au point kinases (ITK) est de savoir si les anomalies responsables de la résistance apparaissent sous l’influence du traitement ou si elles sont déjà présentes. Le concept d’hétérogénéité intratumorale moléculaire apporte des éléments de réponse. L’idée que des clones minoritaires, porteurs d’anomalies moléculaires impliquées dans la résistance aux thérapies ciblées, peuvent être présents dans la tumeur avant traitement, est sous-tendue par des travaux fondamentaux sur des lignées cellulaires, comme ceux de l’équipe menée par P.A. Jänne, du DanaFarber Cancer Institute de Boston (14). Cette équipe met en évidence, dans des lignées cellulaires et dans des cancers du poumon, des sous-populations cellulaires présentant une amplification de MET avant tout traitement. L’hypothèse est que l’émergence de cette population, sous la pression thérapeutique (notion de sélection positive), explique la résistance aux ITK anti-EGFR. Il reste aujourd’hui à déterminer comment des techniques de type NGS (Next Generation Sequencing) vont nous permettre d’identifier ces anomalies “latentes”, faiblement représentées, et susceptibles de devenir une source d’adaptation des cellules aux traitements (15). La présence de mutations à fréquence faible, jusqu’à moins de 10 % des cellules tumorales, a été montrée, notamment dans le cancer du côlon et les cancers non à petites cellules du poumon (16). L’identification au diagnostic d’une mutation T790M dans un cancer du poumon portant également une mutation de sensibilité à un traitement anti-EGFR va-t-elle modifier la prise en charge thérapeutique initiale ? Ces questions restent aujourd’hui en suspens et nécessiteront des études longitudinales intégrant de nouvelles biopsies au moment de la récidive. 17. Yachida S, Jones S, Bozic I et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature 2010;467:1114-7. 18. Vignot S, Frampton GM, Soria JC et al. Next-generation sequencing reveals high concordance of recurrent somatic alterations between primary tumor and metastases from patients with non-smallcell lung cancer. J Clin Oncol 2013;31:2167-72. 76 Hétérogénéité et métastases Dans les cancers, l’hétérogénéité génétique n’est pas toujours synonyme d’hétérogénéité morphologique, raison pour laquelle le premier examen à réaliser pour porter le diagnostic de métastase d’un cancer déjà connu est de comparer la morphologie de la métastase à celle de la tumeur initiale. Sur le versant moléculaire, le débat est largement ouvert : les métastases sont-elles issues de clones présents dans la tumeur primitive ou se sont-elles modifiées sur le plan moléculaire, à un stade précoce de la progression tumorale ? Sont-elles plus ou moins hétérogènes que les tumeurs primitives ? Les réponses à ces questions sont probablement nuancées. De manière générale, les études comparatives montrent que les signatures mutationnelles observées dans les métastases reflètent le profil de différents sous-clones existant dans la tumeur primitive, certaines sous-populations étant toutefois enrichies dans la métastase. Des sous-clones pourraient également acquérir des mutations additionnelles spécifiques en fonction de la localisation métastatique (17). Dans le cancer du poumon, une bonne corrélation des anomalies moléculaires récurrentes entre tumeur primitive et métastase a été montrée par NGS (18). Cependant, en pratique clinique, la réponse devra être apportée pour chaque cancer. Dans les cancers avancés, pour lesquels plusieurs lignes de traitement ont déjà été mises en œuvre, les choses sont sans doute différentes et l’analyse de la tumeur primitive reflète probablement mal la biologie de la tumeur métastatique soumise à la sélection positive induite par les différents traitements. Actuellement, la conduite à tenir consiste à biopsier la cible du traitement pour l’étude des marqueurs théranostiques (métastase, quand cela est possible, si la tumeur a été réséquée) et de réaliser les analyses sur une biopsie récente. Conclusion Actuellement, les exigences de la médecine personnalisée relancent l’intérêt de la corrélation entre la morphologie et les données moléculaires d’une part, et l’impact de l’hétérogénéité tumorale sur la sensibilité au traitement et le risque de récidive, d’autre part. Enfin, l’hétérogénéité tumorale temporelle, sous l’influence des traitements, nécessitera de traquer les clones minoritaires qui vont influencer significativement l’évolution de la maladie et expliquer les phénomènes de résistance. ■ Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. III - n° 2 - avril-mai-juin 2014