Génomique fonctionnelle appliquée chez l’organisme modèle Drosophila melanogaster Melano : noir / Gaster: estomac, ventre -Mâles et femelles faciles à distinguer (dimorphisme sexuel) -Fécondité 40 œufs/femelle/jour - Cycle de vie court 10 jours à 25°C 20 jours à 18°C 5 days (0,5mm) 1day - Développement externe - Tissus transparents - Développement bien caractérisé 1day 2 days (2mm) 1day (4,5mm) - Durée de vie de l’adulte : entre 40 et 120 jours Dépend du régime alimentaire et du stress (idem vertébrés). = Régime riche (farine de maïs) = Régime strict Courbe de survie de mouches adultes en fonction du régime alimentaire Durée de vie diminue avec l’augmentation des carbohydrates et du cholestérol (15%sugar/yeast) 0 day = éclosion de l’adulte - Elevage et Entretien des stocks en laboratoire simple et peu onéreux - Pas de stockage à long terme : pas de possibilité de congélation d’embryons - Nombreuses Bases de Données : Ex: FlyBase : a database for drosophila genetics and molecular biology (since 1993) Génome : 180Mb dont 120Mb d’ euchromatine (haploide) Séquencé en 2000 : 14,000 gènes 8 Chromosomes ( 2x3 autosomes + XX ou XY) -2007 : Séquence du génome de 12 autres espèces (Drosophila Comparative Genome Sequencing and Analysis Consortium) Caractérisation des éléments fonctionnels, de leur signature évolutive de leur changements phylogenétiques Comparaison des génomes de 4 eucaryotes : Levure Nématode Drosophile Homme S. cerevisiae C.elegans D. melanogaster H sapiens Taille du génome haploide (Mb) 13 100 180 3.000 Nombre de chromosomes (n) 16 6 4 23 nd 33% 44% 57% 68% 27% 18% 1,4% 2 5 9 ~100 6200 19100 ~14000 ~25000 Fraction non codante (fraction transcrite/ non traduite) Fraction codante (fraction transcrite/ traduite ) fréquence moyenne des gènes de la fraction codante(par kb) Nombre de gènes Génome compact: Au cours de l’évolution, le génome humain subit deux duplications successive d’un génome élémentaire non redondant représenté par le génome de la Drosophile Comparaison des protéomes prédits de 4 eucaryotes: Levure-Nematode-Drosophile-Homme -Drosophile vs Levure et Nematode: 20% d’ orthologues Processus communs aux eucaryotes ( réplication, transcription, traduction, division cellulaire…) -Drosophile vs Nematode: 35% d’ orthologues Processus communs aux développement des organismes pluricellulaires . Ex: interactions cellule- cellule / cellule substrat, protéines à homéodomaines, molécules d ’adhérence cellulaire. Familles de protéines uniques à la drosophile. Ex: cuticule, réponse immunitaire, protéines transmembranaires de fonctions inconnues Drosophile vs homme: plus de 50% d’orthologues -Haut degré de conservation des voies biologiques fondamentales. -Différences physiologiques reflétées par l’absence de protéines spécifiques. Ex: hémoglobines (thalassémies) réarrangement des gènes d’immunoglobuline (système immunitaire acquis) -Parmi 289 gènes impliqués dans des pathologies sévères, 177 (60%) ont des homologues évidents chez la drosophile. Utilisation de la drosophile comme système modèle pour l’étude de pathologies humaines: Cancers, Endocrines (diabète, obésité), Métaboliques (maladie de Niemann- Pick ), Croissance et Développement (syndrome de Cornelia-Nipbl), Neurodégénaratives (Alzheimer, Parkinson, Paraplégie spatique) , Fertilité, Glaucome, Rénales (Acidose tubulaire), Musculaires (dystrophie musculaire de Duchenne ,Syndrome hypertrophiques et dilatées, LongQT….), etc. de Barth), Cardiovasculaires (Cardiomyopathies Utilisation de la drosophile comme modèle d’analyse de processus complexes: Développement - Organogenèse - Comportement Cerveau sophistiqué Système moteur , système sensoriel Capacité de mémoire et d’ apprentissage Comportements complexes Confocal image of a whole mount adult brain immunolabelled with anti-nc82 terminals). Bruchpilot protein enriched in active zones of synaptic Visualisation of cortical areas in the fly brain, including:: optic lobes (OL), antennal lobes (AL), superior protocerebrum (SP), lateral protocerebrum (LP), mushroom bodies (MB), deuterocerebrum (D), and subesophageal ganglion (SG). CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, 2010, Vol. 9. Drosophila flight control study: - neural control of behavior - neuromotor flight control pathways Swiss Federal Institute of Technology (ETH) and University of Zürich (UZH) at the Institute of Neuroinformatics (INI) and the Institute of Robotics and Intelligent systems (IRIS). -Système trachéal : système respiratoire, développement bronches /bronchioles Larval tracheae -Glandes de la lymphe : Réponse immunitaire cellulaire -Système cardiovasculaire :système circulatoire ouvert -Hémolymphe : équivalent du sang -Corps gras : - équivalent du foie: métabolisme des lipides - analogue tissu adipeux: stockage des lipides) -Tubules de Malpighi : équivalent du rein: organe sécrétoire; sécrétion des fluides 100 ans de Génétique Batterie de mutants Recombinaison homologue: mutation dirigée Analyses à l’échelle du génome des le début du XXème siècle: - Crible génétiques (forward et reverse screens) Elément transposable P et Transgenèse Système Gal4 UAS RNA interference : dsDNA specific to a target gene Génétique classique et Génétique inverse Génétique Classique Forward genetic Génétique inverse Reverse genetic Du phénotype au(x) Géne(s) Du (des) gène(s) au phénotype Mutagenèse au hasard Phénotype Premier crible à l’échelle du génome: 1980 Nüsslein –Volhard et Wieschaus 40000 mutations 15 gènes zygotiques impliqués dans contrôle du développement du patron de segmentation embryonnaire Mise en évidence du premier réseau d’interactions génétiques Gène Mutagenèse dirigée Cribles perte de fonction ou gain de fonction à l’échelle du génome Outil Élément P Système UAS GAL4 Ovocyte : gènes maternels Zygote Altération globale du patron segmental Antérieur , postérieur , terminal Bicoid patron région Délétion au niveau d’un groupe de segment Délétion au niveau d’un segment sur deux Délétion au niveau de chaque segment 100 ans de Génétique Batterie de mutants Recombinaison homologue: mutation dirigée Analyses à l’échelle du génome des le début du XXème siècle: - Crible génétiques (forward et reverse screens) Elément transposable P et Transgenèse Système Gal4 UAS RNA interference : dsDNA specific to a target gene L’élément transposable P : outil n°1 chez la drosophile Drosophila transgenesis. Transposase gene + Germ cell precursors white+ transgene DNA (red) is injected into generation zero Drosophila embryos (G0) of less than 1 hour old, which have been obtained from a parental (P) generation. The early developmental stages of Drosophila embryos are characterized by rapid nuclear divisions that occur without accompanying cell divisions, creating a syncytium. Prior to cellularization, pole cells (black) bud off at the posterior end. For germ line transmission to occur, the transgenic DNA must be taken up into the pole cells that are fated to become germ cells. Transgenic DNA integrated into a pole cell (red pole cell) can be transmitted from one generation (G0) to the next (G1 progeny). The resulting integration events are identified using an appropriate marker, such as as white+. When used in a mutant white– strain, this transgene marks transgenic flies by giving them a darker eye color. From Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster Koen J. T. Venken and Hugo J. Bellen Development 134, 3571-3584 (2007) 100 ans de Génétique Batterie de mutants Recombinaison homologue: mutation dirigée Analyses à l’échelle du génome des le début du XXème siècle: - Crible génétiques (forward et reverse screens) Elément transposable P et Transgenèse Système Gal4 UAS RNA interference : dsDNA specific to a target gene Study of gene function using SYSTEM GAL4 - UAS which allow: - Ectopic and/or overexpression expression of a WT or Mutant form of a gene (Gain of Function) important way to obtain functional data considering that up to 60% of Drosophila genes will have no loss-of-function phenotype - Gene knockdown (Loss of Function): RNA interference determine if a gene is necessary for a given fate/process Système UAS GAL4 (different space and time) GAIN OF FUNCTION UAS - cDNA LOSS OF FUNCTION UAS - dsRNA -Gene knockdown using RNA interference: !! Revoir this dia Michael boutros et al. Genome-Wide RNAi Analysis of Growth and Viability in Drosophila Cells. 2004 Science : 303, 832 Premier crible RNAi specific dsDNA complementary to a target generated from a transgene containing an PCR product able to produce by in vitro transcription an inverted repeat sequence that can form double strand hairpins First RNAi Screen on drosophila cells dsRNA is cell autonomous in drosophila : - designed against 91% of known Drosophila gene - dsRNA incubated in a microtiter well containing cultured Drosophila cells from 2 embryonic hemocytes lines several days - Quantitative assay (cell number) for proliferation/growth and survival: -fluorescent probes specific for dying (SYTOX green) or living (HOECHST red) -Ratio green/red (z score) :High z score suggest a defect in cell survival or cell proliferation -Proof of concept: dsRNA against genes inhibiting apoptosis should increase cell death >>>High z score proliferation A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila Georg Dietzlet al 2007 Nature 448, 151-156 Reverse genetic screen RNAi screen based on Conditional inactivation of gene function in specific tissues of the intact organism. Short gene fragment (300-400bp) cloned as inverted repeats in vector pMF3 and expressed using the UAS-GAL4 system Release 4.3 of the Drosophila genome sequence. 15,072 PCR products were successfully amplified and cloned as IRs into pMF3, representing 13,344 genes or 97% of Drosophila genome. A genome-wide transgenic RNAi library. a, Strategy used to generate UAS-IR constructs. Restriction sites in the original PCR primers were used to digest and ligate PCR products, followed by ligation of the inverted repeat into the pMF3 vector. pMF3 contains 10 GAL4responsive UAS elements, the basal hsp70 promoter, the 150 bp second intron of ftz and the SV40 polyadenylation signal. Most, but not all, inverted repeats were cloned in the antisense-sense orientation using EcoRI and XbaI as indicated. IR-L and IR-R indicate the primer pairs used to amplify the left or right halves, respectively, of the inverted repeat. P3 and P5 indicate P element ends. Efficient and specific gene interference with ubiquitous RNAi. Act5C-GAL4/UAS-IR Classical loss-of-function a, Efficiency of RNAi-mediated knock down assessed using quantitative RT–PCR on RNA prepared from viable Act5C-GAL4/UAS-IR adults and controls. Examples of morphological phenotypes : Transformer 2 (tra2) RNAi and mutant females anatomically resemble males, including male genitalia and abdominal pigmentation (arrowheads). Eye absent (eya) RNAi and mutant prsent greatly reduced or absent in eyes absent . Stubble (Sb) RNAi and mutant have short, stubby bristles on the notum (asterisks indicate the shortened scutellar bristles). Tissue-specific RNAi and the enhancing effect of Dicer-2. Examples of RNAi phenotypes in the eye and notum. RNAi against argos results in eye roughening RNAi against tkv leads to eyes that are both rough and reduced in size. RNAi against flamingo (stan) leads to a defect in planar cell polarity, evident in the misorientation of microchaetae (arrowheads RNAi against ed results in the formation of ectopic macrochaetae (asterisks). All of the defects shown here are enhanced by co-expression of UAS-Dcr-2 (bottom row).