MASTER SV - UE13 Génétique Moléculaire

MASTER SV - UE13
Génétique Moléculaire
Sujet n°1
Durée conseillée 1h30
D’après :
Le contrôle de la réplication des rétrovirus
dans des cellules infectées de façon
chronique pourrait être à la base de
thérapies efficaces dans le cas des virus
affectant le système immunitaire. Les
auteurs proposent dans cet article
l’utilisation de l’ARN interférence pour
inhiber la réplication virale dans le cas
d’une infection par le FIV (Feline
Immunodeficiency Virus). Ils désignent
pour cela quatre RNAi (G1 à G4) dirigés
contre le gène viral gag et utilisent en
contrôle un RNAi dirigé contre la
luciférase (Luc). Ces différents RNAi sont
transfectés en utilisant le réactif Mock dans
une lignée cellulaire chroniquement
infectée par le FIV. Les auteurs évaluent
ensuite l’activité de reverse transcriptase
(RT) dans le surnageant de culture de ces
cellules, 48h après transfection. Les
résultats sont indiqués dans la figure ci-
dessous.
D’après vous comment a été effectué le
dosage de l’activité RT ?
Décrivez les composants et les conditions
nécessaires à cette expérience de dosage
de RT. A quoi correspond la colonne
marquée Mock ? En quoi cette colonne
est elle importante ? Commentez les
résultats obtenus.
Les auteurs poursuivent leurs expériences
avec le RNAi G4. Ils comparent les
résultats qu’ils obtiennent à différentes
doses sur la quantité d’ARN du virus FIV
et l’activité de la RT. Ils analysent d’autre
part l’activité RT au cours des jours
suivants la transfection des RNAi (figures
ci-dessous). Analysez ces figures. Quelles
conclusions pouvez vous en tirer ?
D’après vous quelle concentration de
RNAi avait été utilisée dans l’expérience
précédente ?

Les auteurs décident alors de modifier leur
stratégie. Ils clonent le RNAi G4 dans un
vecteur d’expression sous forme de RNA
hairpin (shG4 ; hairpin = épingle à
cheveu). Cette technique de clonage
permet la production à partir du vecteur
d’expression d’ARN interférants par
simple transcription. Les auteurs utilisent
le vecteur ainsi construit pour réaliser une
transfection stable de leur lignée cellulaire
infectée par le FIV. Ils réalisent alors le
dosage de l’activité RT toujours dans les
mêmes conditions mais cette fois-ci
plusieurs semaines après établissement des
lignées stables (figure ci-dessous ; shNC :
vecteur RNA hairpin non relevant en
contrôle)
Décrivez le principe d’une transfection
stable. Interprétez ces nouveaux
résultats. Pourquoi les auteurs ont-ils
modifié leur stratégie?
Décrivez avec précision une expérience
« réaliste » que vous pourriez proposer
pour valider ces résultats « in vivo » sur
des chats infectés par le FIV, en
considérant que le dosage d’une activité
RT peut être réalisée sur du sérum à
partir d’une prise de sang.