MASTER SV - UE13 Génétique Moléculaire
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MASTER SV - UE13 Génétique Moléculaire Sujet n°1 Durée conseillée 1h30 D’après : Le contrôle de la réplication des rétrovirus dans des cellules infectées de façon chronique pourrait être à la base de thérapies efficaces dans le cas des virus affectant le système immunitaire. Les auteurs proposent dans cet article l’utilisation de l’ARN interférence pour inhiber la réplication virale dans le cas d’une infection par le FIV (Feline Immunodeficiency Virus). Ils désignent pour cela quatre RNAi (G1 à G4) dirigés contre le gène viral gag et utilisent en contrôle un RNAi dirigé contre la luciférase (Luc). Ces différents RNAi sont transfectés en utilisant le réactif Mock dans une lignée cellulaire chroniquement infectée par le FIV. Les auteurs évaluent ensuite l’activité de reverse transcriptase (RT) dans le surnageant de culture de ces cellules, 48h après transfection. Les résultats sont indiqués dans la figure cidessous. D’après vous comment a été effectué le dosage de l’activité RT ? Décrivez les composants et les conditions nécessaires à cette expérience de dosage de RT. A quoi correspond la colonne marquée Mock ? En quoi cette colonne est elle importante ? Commentez les résultats obtenus. Les auteurs poursuivent leurs expériences avec le RNAi G4. Ils comparent les résultats qu’ils obtiennent à différentes doses sur la quantité d’ARN du virus FIV et l’activité de la RT. Ils analysent d’autre part l’activité RT au cours des jours suivants la transfection des RNAi (figures ci-dessous). Analysez ces figures. Quelles conclusions pouvez vous en tirer ? D’après vous quelle concentration de RNAi avait été utilisée dans l’expérience précédente ? Les auteurs décident alors de modifier leur stratégie. Ils clonent le RNAi G4 dans un vecteur d’expression sous forme de RNA hairpin (shG4 ; hairpin = épingle à cheveu). Cette technique de clonage permet la production à partir du vecteur d’expression d’ARN interférants par simple transcription. Les auteurs utilisent le vecteur ainsi construit pour réaliser une transfection stable de leur lignée cellulaire infectée par le FIV. Ils réalisent alors le dosage de l’activité RT toujours dans les mêmes conditions mais cette fois-ci plusieurs semaines après établissement des lignées stables (figure ci-dessous ; shNC : vecteur RNA hairpin non relevant en contrôle) Décrivez le principe d’une transfection stable. Interprétez ces nouveaux résultats. Pourquoi les auteurs ont-ils modifié leur stratégie? Décrivez avec précision une expérience « réaliste » que vous pourriez proposer pour valider ces résultats « in vivo » sur des chats infectés par le FIV, en considérant que le dosage d’une activité RT peut être réalisée sur du sérum à partir d’une prise de sang.
