Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l`Institut

PROFESSEURS HONORAIRES 1075
J ACOB , F. From night bustle to printed quietness. Treballs de la SCB, 2000,
51, 11-13.
J
ACOB , F. Complexity and Tinkering. Annals New York Academy of Sciences,
2001, 929, 71-3.
J
ACOB , F. Le Monde des Cellules Souches. CR Biologies, 325, 2002, 999-1002.
M
me
Nicole L E D OUARIN , membre de l’Institut
(Académie des Sciences)
Embryologie cellulaire et moléculaire, 1988-2000
Les recherches effectuées au cours de l’année académique 2002-2003 ont
concernéles thèmes suivants :
I. Neurogenèse
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés
c) Différenciation des cellules de la crête neurale
d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés
e) Étude des gènes Msx dans la formation du squelette superficiel : étude
chez la tortue Emys orbicularis
f) Analyse de l’induction de la crête neurale par le mésoderme paraxial :
une étude chez l’embryon de Xénope
II. Hématopoïèse et immunité
a) Mise en évidence par des tests in vitro d’une fonction hématopoïétique
du placenta chez la Souris
b) Mise en évidence dans le placenta, par restauration de souris irradiées,
de cellules restauratrices àlong terme (LTR-CSH)
c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance : caractérisa-
tion des cellules régulatrices chez la souris NOD
I. N EUROGENÈSE
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
Chercheurs : M.-A. Teillet, J.-B. Charrier (AHR en chirurgie maxillo-faciale,
Hôpital Lariboisière, étudiant en thèse) et N. Le Douarin
Ingénieur d’étude : F. Lapointe
Collaboration : P. Melhen et C. Thibert (UniversitéLyon 1, UMR CNRS 5534)

PROFESSEURS HONORAIRES 1076
Nous poursuivons nos recherches sur le développement du système nerveux des
Vertébrés en utilisant comme modèle l’embryon d’oiseau. Nous nous intéressons
particulièrement au rôle que jouent les structures axiales (notochorde et plaque
du plancher du tube nerveux ou floor plate) dans ce développement.
Dans des études précédentes nous avons montré, en utilisant le système des
chimères caille-poulet que la notochorde et la floor plate ont une origine
commune dans le nœud de Hensen, l’organisateur de l’embryon d’oiseau, et se
mettent en place grâce au recul du nœud au cours de l’allongement de l’embryon
pendant la gastrulation-neurulation (Catala et al., 1996). L’excision de l’extrémité
caudale du nœud au stade de 5-6 somites, qui correspond àla moitiéde la
gastrulation, a pour conséquence un arrêtdunœud au niveau thoracique posté-
rieur. Cependant le tube nerveux postérieur se forme et s’allonge mais il est
dépourvu de floor plate et la notochorde est absente dans cette région (Charrier
et al., 1999). On observe alors un accroissement considérable de l’apoptose ou
mort cellulaire programmée dans le neuroépithélium ainsi que dans les tissus
avoisinants, en particulier les somites. Cette mort cellulaire massive aboutit géné-
ralement àla troncation de l’embryon.
L’apoptose, qu’on met en évidence spécifiquement par la technique de TUNEL,
est un phénomène naturel qu’on observe dans la plupart des organes embryon-
naires dans des zones précises et àdes stades précis du développement. On parle
alors d’apoptose morphogène.
Dans nos expériences, l’accroissement de mort cellulaire et la troncation de
l’embryon après excision de la partie caudale du nœud peuvent être évitées par
la greffe de fibroblastes génétiquement modifiés produisant la protéine Sonic
Hedgehog (SHH) au voisinage du tube nerveux dépourvu de cellules de la ligne
médiane (Charrier et al., 2001). SHH est normalement produite par la notochorde
et la floor plate. On lui connaissait un rôle dans l’organisation ventro-dorsale du
tube nerveux. On a mis ici en évidence un rôle anti-apoptotique qui a étéretrouvé
dans de nombreux autres systèmes. Nos études récentes ont consistéàrechercher
les mécanismes de cette action complexe de SHH dans le développement du
tube nerveux.
1. Double origine de la floor plate chez l’embryon d’oiseau
En analysant les caractéristiques moléculaires de la floor plate chez des
embryons de poulet chimères dans lesquels soit le nœud de Hensen, soit la
plaque neurale postérieure au nœudaétéremplacépar la structure équivalente
prise chez un embryon de caille, nous avons observéque la floor plate est
composée de deux régions distinctes : a) un territoire médian (medial floor plate
ou MFP) forméde cellules provenant du nœud de Hensen et exprimant Shh,
HNF3bet Netrine1 mais n’exprimant àaucun moment des gènes propres à
l’ectoderme neural comme Sox1 ; b) des régions latérales (lateral floor plate ou
LFP) formées de cellules appartenant àla plaque neurale et exprimant Sox1 et

PROFESSEURS HONORAIRES 1077
d’autres gènes neuraux comme Nkx2.2. Les caractéristiques de la LFP apparais-
sent progressivement dans le tissu neural proche des cellules issues du nœud de
Hensen. Ce sont l’expression transitoire de HNF3 (et une expression continue
de Shh et de Netrine1 en plus de l’expression de Nkx2.2. Bien que les cellules
de la MFP aient, dans le développement normal, une origine distincte de celles
de la LFP, il est cependant possible d’induire une floor plate complète (MFP +
LFP) dans la paroi latérale du tube nerveux par l’action àun stade précoce d’un
fragment de notochorde ou de MFP. Dans les mêmes conditions, des cellules
modifiées génétiquement pour produire SHH induisent seulement une LFP. Ces
résultats montrent que l’induction d’une floor plate met en jeu un ou des facteurs
produits par les tissus dérivésdunœud de Hensen autres que SHH. On pense à
des antagonistes de BMP4 exprimédorsalement dans le tube nerveux.
Publication : Charrier, J.-B., Lapointe, F., Le Douarin, N. and Teillet, M.-A.
(2002). Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development, 129,
4785-4796.
2. Patched est un récepteur àdépendance
Dans une étude que nous avons réalisée cette année en collaboration avec
Patrick Mehlen et Chantal Thibert de l’Universitéde Lyon, nous avons montré
que le rôle anti-apoptotique de SHH sur le neuro-épithélium pourrait constituer
un mécanisme essentiel du développement et de l’organisation du système ner-
veux par un phénomène jusque làinconnu (Thibert et al., 2003). On connaîtla
voie de signalisation classique de SHH passant par le couple récepteur Patched
(Ptc)/Smoothened (Smo) responsable de la différenciation des motoneurones ven-
traux du tube nerveux. Nous avons mis en évidence in vivo et in vitro le fait que
l’absence de SHH entraîne l’activation par Ptc d’une autre voie de signalisation
impliquant les caspases et déclenchant l’apoptose. Cette découverte fait de Ptc
un «récepteur àdépendance ». La notion de récepteur àdépendance est récente.
Il s’agit de récepteurs dont l’action est différente selon que leur ligand est
disponible ou non. En présence du ligand, ils déclenchent un processus de diffé-
renciation. En son absence, ils déclenchent un processus de mort cellulaire.
L’existence de récepteurs àdépendance peut expliquer des phénomènes de diffé-
renciation différentielle dans le cas d’un gradient du ligand. D’autre part, la
mutation de ces récepteurs peut entraîner une prolifération cellulaire intense et
par làmême la tumorigenèse.
Publication : Thibert, C., Teillet, M.-A., Lapointe, F., Mazelin, L., Le Douarin,
N.M. and Mehlen, P. (2003). Sonic hedgehog controls survival of the neuroepi-
thelial cells of the developing neural tube by regulating Patched-induced apopto-
sis. Science, 301, 843-846.
b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés
Chercheurs : N. Le Douarin, G. Couly (Professeur en chirurgie maxillo-faciale
pédiatrique, Hôpital Necker), H. Etchevers (chercheur post-doctoral), S. Creuzet

PROFESSEURS HONORAIRES 1078
(chercheur post-doctoral), K. Mohammedi-Ladjali (chercheur post-doctoral),
J. De Brito Neto (chercheur post-doctoral), B. Ruhin (P.H. en chirurgie maxillo-
faciale, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, étudiante en thèse), L. Benouaiche (Interne
en chirurgie, Hôpital d’Amiens, étudiante en thèse)
ITA : C. Vincent
Le squelette de la face chez les vertébrés se différencie àpartir de cellules
mésenchymateuses qui ont pour origine la crête neurale diencéphalique, mésencé-
phalique et rhombencéphalique antérieure. Ces cellules colonisent le bourgeon
nasofrontal et les arcs branchiaux. Ces cellules n’expriment aucun gène Hox et
sont donc considérées comme étant Hox-négatives. Le problème de la morphoge-
nèse des différentes pièces du squelette facial a étéposé. Contrairement àune
opinion répandue dans la littérature, les cellules des crêtes neurales elles-mêmes
ne possèdent pas l’information nécessaire pour spécifier la forme et la position
de chacun des os de la face. Nous avons exploréle rôle éventuel de l’ectoderme,
du mésoderme céphaliques et de l’endoderme de l’intestin antérieur dans ce pro-
cessus.
1. Rôle de FGF8 sur la formation des structures squelettiques dérivées de la
crête neurale dans la régénération àdistance des structures faciale et mandi-
bulaire
Dans un travail précédent (Couly et al., 2002), nous avons montréque l’exci-
sion de la crête neurale s’étendant du diencéphale jusqu’au rhombomère r2
—domaine oùles gènes Hox ne sont pas exprimés—résulte dans l’agénésie
du squelette facial et mandibulaire. Outre les déficits squelettiques associésà
l’ablation de la crête neurale Hox-négative, nous avons observédes perturbations
sévères du développement des vésicules céphaliques aboutissant àune exencépha-
lie étendue le long du territoire résequéde la crête, c’est-à-dire du prosencéphale
jusqu’au métencéphale.
Situées àla limite postérieure du territoire excisé,c’est-à-dire àla jonction
des domaines Hox-positif et -négatif, les cellules issues de la crête neurale du
rhombomère 3 (r3) subissent précocement au cours du développement normal
une apoptose massive sous le contrôle des rhombomères adjacents. Ainsi, la
région branchiale reçoit-elle une contribution mineure des cellules de la crête de
r3 dont la participation aux structures squelettiques se limite àl’apophyse du
processus rétro-articulaire dans le 1
er
arc (Hox-négatif) et au tiers médian du
basihyal dans le 2
e
arc (Hox-positif).
Toutefois, dans le modèle expérimental oùla crête neurale du domaine Hox-
négatif est excisée, les cellules de la crête de r3 qui échappent au contrôle
apoptotique environnant présentent une capacitéinvasive accrue et développent
un statut globalement Hox-négatif. Dans ce contexte, l’implantation d’un greffon
de crête neurale au niveau diencéphalique assure le maintien du bourgeon naso-
frontal et le développement du prosencéphale. Parallèlement, la présence du

PROFESSEURS HONORAIRES 1079
greffon antérieur stimule la colonisation du 1
er
arc branchial par les cellules de
la crête de r3 qui sont alors capables de générer la totalitédu squelette cartilagi-
neux de la mâchoire inférieure.
Nous avons cherchéàidentifier les mécanismes par lesquels la crête neurale
placée au niveau diencéphalique stimule àdistance la régénération mandibulaire
par les cellules issues de r3. A
`l’excision des crêtes neurales Hox-négatives
suivent des perturbations profondes du patron d’expression de Fgf8 qui affectent
tant le neuroépithélium prosencéphalique que l’ectoderme des bourgeon nasofron-
tal et 1
er
arc branchial, mais que restaure la présence de crête neurale grefféeau
niveau diencéphalique. L’apport d’une source exogène de FGF8, au moyen de
billes imprégnées de protéine recombinante placées au contact soit du bourgeon
nasofrontal soit du 1
er
arc branchial, oriente sélectivement la régénération soit de
la capsule nasale et du cerveau antérieur, soit des squelettes maxillaire et mandi-
bulaire.
Nos résultats montrent que i) FGF8 exerce àdistance un effet trophique et
attractant sur les cellules de la crête neurale, ii) la crête neurale issue du 3
e
rhom-
bomère en réponse au facteur diffusible FGF8, supporte la régénération d’une
partie étendue des structures squelettiques de la face, iii) la crête neurale placée
rostralement exerce un effet trophique sur le développement du prosencéphale
en stimulant localement l’expression de Fgf8.
Publication : Creuzet et al.,enpréparation.
2. Rôle de FGF8 sur la formation des structures squelettiques dérivées de la
crête neurale dans l’induction par contact d’une conversion phénotypique dans
le 2
e
arc branchial
A
`la partition entre le domaine Hox-positif et Hox-négatif des cellules de la
crête neurale céphalique correspond une disparitédans la capacitéàgénérer des
dérivés squelettiques. Ainsi, la différenciation ostéogénique de la crête neurale
issue du domaine Hox-négatif consiste en l’ossification endochondrale des struc-
tures squelettiques cartilagineuses, mais aussi la formation d’os de membrane
—directement différenciésàpartir de cellules mésenchymateuses —, alors que
celle issue du domaine Hox-positif (2
e
arc) est strictement limitéàla formation
de dérivés osseux endochondraux.
Nous avons testéla différenciation des cellules issues du rhombomère 3 dans
le 2
e
arc en l’absence des cellules issues des rhombomères 4 à6 qui le colonisent
normalement. La régénération qui s’opère àpartir des cellules situées aux extré-
mités du territoire excisé—c’est-à-dire issues de r3 antérieurement, et r7 posté-
rieurement —conduit àla formation d’un squelette cartilagineux et osseux
endochondral hyoïdien normal. Si dans ce contexte, les cellules issues de r3 sont
directement placées au contact d’une source exogène de FGF8, leur différencia-
tion conduit àla formation de pièces squelettiques ectopiques qui reproduisent