Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l`Institut

publicité
PROFESSEURS HONORAIRES
1075
JACOB, F. From night bustle to printed quietness. Treballs de la SCB, 2000,
51, 11-13.
JACOB, F. Complexity and Tinkering. Annals New York Academy of Sciences,
2001, 929, 71-3.
JACOB, F. Le Monde des Cellules Souches. CR Biologies, 325, 2002, 999-1002.
Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l’Institut
(Académie des Sciences)
Embryologie cellulaire et moléculaire, 1988-2000
Les recherches effectuées au cours de l’année académique 2002-2003 ont
concerné les thèmes suivants :
I.
Neurogenèse
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés
c) Différenciation des cellules de la crête neurale
d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés
e) Étude des gènes Msx dans la formation du squelette superficiel : étude
chez la tortue Emys orbicularis
f) Analyse de l’induction de la crête neurale par le mésoderme paraxial :
une étude chez l’embryon de Xénope
II.
Hématopoïèse et immunité
a) Mise en évidence par des tests in vitro d’une fonction hématopoïétique
du placenta chez la Souris
b) Mise en évidence dans le placenta, par restauration de souris irradiées,
de cellules restauratrices à long terme (LTR-CSH)
c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance : caractérisation des cellules régulatrices chez la souris NOD
I. NEUROGENÈSE
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
Chercheurs : M.-A. Teillet, J.-B. Charrier (AHR en chirurgie maxillo-faciale,
Hôpital Lariboisière, étudiant en thèse) et N. Le Douarin
Ingénieur d’étude : F. Lapointe
Collaboration : P. Melhen et C. Thibert (Université Lyon 1, UMR CNRS 5534)
1076
PROFESSEURS HONORAIRES
Nous poursuivons nos recherches sur le développement du système nerveux des
Vertébrés en utilisant comme modèle l’embryon d’oiseau. Nous nous intéressons
particulièrement au rôle que jouent les structures axiales (notochorde et plaque
du plancher du tube nerveux ou floor plate) dans ce développement.
Dans des études précédentes nous avons montré, en utilisant le système des
chimères caille-poulet que la notochorde et la floor plate ont une origine
commune dans le nœud de Hensen, l’organisateur de l’embryon d’oiseau, et se
mettent en place grâce au recul du nœud au cours de l’allongement de l’embryon
pendant la gastrulation-neurulation (Catala et al., 1996). L’excision de l’extrémité
caudale du nœud au stade de 5-6 somites, qui correspond à la moitié de la
gastrulation, a pour conséquence un arrêt du nœud au niveau thoracique postérieur. Cependant le tube nerveux postérieur se forme et s’allonge mais il est
dépourvu de floor plate et la notochorde est absente dans cette région (Charrier
et al., 1999). On observe alors un accroissement considérable de l’apoptose ou
mort cellulaire programmée dans le neuroépithélium ainsi que dans les tissus
avoisinants, en particulier les somites. Cette mort cellulaire massive aboutit généralement à la troncation de l’embryon.
L’apoptose, qu’on met en évidence spécifiquement par la technique de TUNEL,
est un phénomène naturel qu’on observe dans la plupart des organes embryonnaires dans des zones précises et à des stades précis du développement. On parle
alors d’apoptose morphogène.
Dans nos expériences, l’accroissement de mort cellulaire et la troncation de
l’embryon après excision de la partie caudale du nœud peuvent être évitées par
la greffe de fibroblastes génétiquement modifiés produisant la protéine Sonic
Hedgehog (SHH) au voisinage du tube nerveux dépourvu de cellules de la ligne
médiane (Charrier et al., 2001). SHH est normalement produite par la notochorde
et la floor plate. On lui connaissait un rôle dans l’organisation ventro-dorsale du
tube nerveux. On a mis ici en évidence un rôle anti-apoptotique qui a été retrouvé
dans de nombreux autres systèmes. Nos études récentes ont consisté à rechercher
les mécanismes de cette action complexe de SHH dans le développement du
tube nerveux.
1. Double origine de la floor plate chez l’embryon d’oiseau
En analysant les caractéristiques moléculaires de la floor plate chez des
embryons de poulet chimères dans lesquels soit le nœud de Hensen, soit la
plaque neurale postérieure au nœud a été remplacé par la structure équivalente
prise chez un embryon de caille, nous avons observé que la floor plate est
composée de deux régions distinctes : a) un territoire médian (medial floor plate
ou MFP) formé de cellules provenant du nœud de Hensen et exprimant Shh,
HNF3b et Netrine1 mais n’exprimant à aucun moment des gènes propres à
l’ectoderme neural comme Sox1 ; b) des régions latérales (lateral floor plate ou
LFP) formées de cellules appartenant à la plaque neurale et exprimant Sox1 et
PROFESSEURS HONORAIRES
1077
d’autres gènes neuraux comme Nkx2.2. Les caractéristiques de la LFP apparaissent progressivement dans le tissu neural proche des cellules issues du nœud de
Hensen. Ce sont l’expression transitoire de HNF3 (et une expression continue
de Shh et de Netrine1 en plus de l’expression de Nkx2.2. Bien que les cellules
de la MFP aient, dans le développement normal, une origine distincte de celles
de la LFP, il est cependant possible d’induire une floor plate complète (MFP +
LFP) dans la paroi latérale du tube nerveux par l’action à un stade précoce d’un
fragment de notochorde ou de MFP. Dans les mêmes conditions, des cellules
modifiées génétiquement pour produire SHH induisent seulement une LFP. Ces
résultats montrent que l’induction d’une floor plate met en jeu un ou des facteurs
produits par les tissus dérivés du nœud de Hensen autres que SHH. On pense à
des antagonistes de BMP4 exprimé dorsalement dans le tube nerveux.
Publication : Charrier, J.-B., Lapointe, F., Le Douarin, N. and Teillet, M.-A.
(2002). Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development, 129,
4785-4796.
2. Patched est un récepteur à dépendance
Dans une étude que nous avons réalisée cette année en collaboration avec
Patrick Mehlen et Chantal Thibert de l’Université de Lyon, nous avons montré
que le rôle anti-apoptotique de SHH sur le neuro-épithélium pourrait constituer
un mécanisme essentiel du développement et de l’organisation du système nerveux par un phénomène jusque là inconnu (Thibert et al., 2003). On connaît la
voie de signalisation classique de SHH passant par le couple récepteur Patched
(Ptc)/Smoothened (Smo) responsable de la différenciation des motoneurones ventraux du tube nerveux. Nous avons mis en évidence in vivo et in vitro le fait que
l’absence de SHH entraîne l’activation par Ptc d’une autre voie de signalisation
impliquant les caspases et déclenchant l’apoptose. Cette découverte fait de Ptc
un « récepteur à dépendance ». La notion de récepteur à dépendance est récente.
Il s’agit de récepteurs dont l’action est différente selon que leur ligand est
disponible ou non. En présence du ligand, ils déclenchent un processus de différenciation. En son absence, ils déclenchent un processus de mort cellulaire.
L’existence de récepteurs à dépendance peut expliquer des phénomènes de différenciation différentielle dans le cas d’un gradient du ligand. D’autre part, la
mutation de ces récepteurs peut entraîner une prolifération cellulaire intense et
par là même la tumorigenèse.
Publication : Thibert, C., Teillet, M.-A., Lapointe, F., Mazelin, L., Le Douarin,
N.M. and Mehlen, P. (2003). Sonic hedgehog controls survival of the neuroepithelial cells of the developing neural tube by regulating Patched-induced apoptosis. Science, 301, 843-846.
b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés
Chercheurs : N. Le Douarin, G. Couly (Professeur en chirurgie maxillo-faciale
pédiatrique, Hôpital Necker), H. Etchevers (chercheur post-doctoral), S. Creuzet
1078
PROFESSEURS HONORAIRES
(chercheur post-doctoral), K. Mohammedi-Ladjali (chercheur post-doctoral),
J. De Brito Neto (chercheur post-doctoral), B. Ruhin (P.H. en chirurgie maxillofaciale, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, étudiante en thèse), L. Benouaiche (Interne
en chirurgie, Hôpital d’Amiens, étudiante en thèse)
ITA : C. Vincent
Le squelette de la face chez les vertébrés se différencie à partir de cellules
mésenchymateuses qui ont pour origine la crête neurale diencéphalique, mésencéphalique et rhombencéphalique antérieure. Ces cellules colonisent le bourgeon
nasofrontal et les arcs branchiaux. Ces cellules n’expriment aucun gène Hox et
sont donc considérées comme étant Hox-négatives. Le problème de la morphogenèse des différentes pièces du squelette facial a été posé. Contrairement à une
opinion répandue dans la littérature, les cellules des crêtes neurales elles-mêmes
ne possèdent pas l’information nécessaire pour spécifier la forme et la position
de chacun des os de la face. Nous avons exploré le rôle éventuel de l’ectoderme,
du mésoderme céphaliques et de l’endoderme de l’intestin antérieur dans ce processus.
1. Rôle de FGF8 sur la formation des structures squelettiques dérivées de la
crête neurale dans la régénération à distance des structures faciale et mandibulaire
Dans un travail précédent (Couly et al., 2002), nous avons montré que l’excision de la crête neurale s’étendant du diencéphale jusqu’au rhombomère r2
— domaine où les gènes Hox ne sont pas exprimés — résulte dans l’agénésie
du squelette facial et mandibulaire. Outre les déficits squelettiques associés à
l’ablation de la crête neurale Hox-négative, nous avons observé des perturbations
sévères du développement des vésicules céphaliques aboutissant à une exencéphalie étendue le long du territoire résequé de la crête, c’est-à-dire du prosencéphale
jusqu’au métencéphale.
Situées à la limite postérieure du territoire excisé, c’est-à-dire à la jonction
des domaines Hox-positif et -négatif, les cellules issues de la crête neurale du
rhombomère 3 (r3) subissent précocement au cours du développement normal
une apoptose massive sous le contrôle des rhombomères adjacents. Ainsi, la
région branchiale reçoit-elle une contribution mineure des cellules de la crête de
r3 dont la participation aux structures squelettiques se limite à l’apophyse du
processus rétro-articulaire dans le 1er arc (Hox-négatif) et au tiers médian du
basihyal dans le 2e arc (Hox-positif).
Toutefois, dans le modèle expérimental où la crête neurale du domaine Hoxnégatif est excisée, les cellules de la crête de r3 qui échappent au contrôle
apoptotique environnant présentent une capacité invasive accrue et développent
un statut globalement Hox-négatif. Dans ce contexte, l’implantation d’un greffon
de crête neurale au niveau diencéphalique assure le maintien du bourgeon nasofrontal et le développement du prosencéphale. Parallèlement, la présence du
PROFESSEURS HONORAIRES
1079
greffon antérieur stimule la colonisation du 1er arc branchial par les cellules de
la crête de r3 qui sont alors capables de générer la totalité du squelette cartilagineux de la mâchoire inférieure.
Nous avons cherché à identifier les mécanismes par lesquels la crête neurale
placée au niveau diencéphalique stimule à distance la régénération mandibulaire
par les cellules issues de r3. À l’excision des crêtes neurales Hox-négatives
suivent des perturbations profondes du patron d’expression de Fgf8 qui affectent
tant le neuroépithélium prosencéphalique que l’ectoderme des bourgeon nasofrontal et 1er arc branchial, mais que restaure la présence de crête neurale greffée au
niveau diencéphalique. L’apport d’une source exogène de FGF8, au moyen de
billes imprégnées de protéine recombinante placées au contact soit du bourgeon
nasofrontal soit du 1er arc branchial, oriente sélectivement la régénération soit de
la capsule nasale et du cerveau antérieur, soit des squelettes maxillaire et mandibulaire.
Nos résultats montrent que i) FGF8 exerce à distance un effet trophique et
attractant sur les cellules de la crête neurale, ii) la crête neurale issue du 3e rhombomère en réponse au facteur diffusible FGF8, supporte la régénération d’une
partie étendue des structures squelettiques de la face, iii) la crête neurale placée
rostralement exerce un effet trophique sur le développement du prosencéphale
en stimulant localement l’expression de Fgf8.
Publication : Creuzet et al., en préparation.
2. Rôle de FGF8 sur la formation des structures squelettiques dérivées de la
crête neurale dans l’induction par contact d’une conversion phénotypique dans
le 2e arc branchial
À la partition entre le domaine Hox-positif et Hox-négatif des cellules de la
crête neurale céphalique correspond une disparité dans la capacité à générer des
dérivés squelettiques. Ainsi, la différenciation ostéogénique de la crête neurale
issue du domaine Hox-négatif consiste en l’ossification endochondrale des structures squelettiques cartilagineuses, mais aussi la formation d’os de membrane
— directement différenciés à partir de cellules mésenchymateuses —, alors que
celle issue du domaine Hox-positif (2e arc) est strictement limité à la formation
de dérivés osseux endochondraux.
Nous avons testé la différenciation des cellules issues du rhombomère 3 dans
le 2e arc en l’absence des cellules issues des rhombomères 4 à 6 qui le colonisent
normalement. La régénération qui s’opère à partir des cellules situées aux extrémités du territoire excisé — c’est-à-dire issues de r3 antérieurement, et r7 postérieurement — conduit à la formation d’un squelette cartilagineux et osseux
endochondral hyoïdien normal. Si dans ce contexte, les cellules issues de r3 sont
directement placées au contact d’une source exogène de FGF8, leur différenciation conduit à la formation de pièces squelettiques ectopiques qui reproduisent
1080
PROFESSEURS HONORAIRES
l’élément proximal du squelette du 1er arc branchial, le cartilage carré. De même,
l’implantation d’un fragment de crête Hox-négative associé à une bille de FGF8,
en remplacement de la crête excisée, mime les résultats obtenus à partir de r3
et étend la conversion phénotypique du squelette du 2e arc à la formation de
cartilage de Meckel. Dans ces deux situations expérimentales, les pièces cartilagineuses ectopiques sont associées à la formation d’os de membrane.
Nos résultats montrent ainsi que FGF8 exerce au contact des cellules de la
crête neurale Hox-négative, avant même le début de leur migration, une influence
précoce qui accroît leur capacité à répondre aux signaux endodermiques et oriente
leur devenir squelettogénique vers la formation de pièces squelettiques inédites
dans le 2e arc tant par leur identité (duplication de type mandibulaire), que par
leur nature (différenciation d’os de membrane).
Publication : Creuzet et al., en préparation.
3. Spécification du squelette viscéral par l’endoderme de l’intestin antérieur
L’os hyoïde est une composante du squelette viscéral qui se forme à partir
des cellules de la crête neurale rhombencéphalique issues du domaine Hoxnégatif et Hox-positif. Nous avons précédemment démontré que les cellules issues
du domaine Hox-négatif se comportent comme un groupe d’équivalence auquel
l’endoderme ventral de l’intestin antérieur — foregut — fournit l’information
requise pour instruire la forme et l’orientation du squelette nasal et mandibulaire
(Couly et al., 2002).
En pratiquant des expériences d’ablations et de greffes en supplémentation,
nous avons étendu notre étude à la formation de l’os hyoïde et testé la capacité
de spécification des niveaux plus caudaux de l’endoderme latéro-ventral du foregut chez l’embryon de poulet. Pour cette étude, des bandes d’endoderme ont
été délimitées suivant la projection des structures céphaliques correspondant au
rhombencéphale moyen (rhombomères 4 et 5) et postérieur (rhombomères 6 à
8) au cours de la neurulation précoce.
L’extirpation des bandes transversales d’endoderme le long de l’axe antéropostérieur empêche de façon sélective la formation de la partie postérieure du
basihyal, du cératobranchial, et de l’épibranchial. Ainsi définie, l’activité squelettogénique des bandes d’endoderme a été explorée plus avant en précisant
l’origine des signaux inducteurs dans leurs portions ventro-médiale et latérale.
L’implantation homotopique des zones ventro-médiales du foregut sur la voie de
migration des cellules de la crête neurale céphalique conduit à la formation de
cartilages basihyal et basibranchial surnuméraires, alors que les zones latérales
génèrent des pièces cartilagineuses supplémentaires caractéristiques du cératobranchial et de l’épibranchial.
L’ensemble de nos résultats démontre que précocement au cours du développement l’endoderme ventral du foregut confère une information régionalisée à la
PROFESSEURS HONORAIRES
1081
crête neurale céphalique pour construire le squelette primaire facial et viscéral
dans la mâchoire et le cou. Ces données permettent d’établir une carte des
territoires squelettogéniques de l’endoderme chez la neurula et révèle qu’une
métamérisation du foregut préside à la formation du squelette dans les arcs branchiaux.
Publication : Ruhin, B., Creuzet, S., Vincent, C., Benouaiche, L., Le Douarin,
N. and Couly, G. (2003). Patterning of the hyoid cartilage depends upon signals
arising from the ventral foregut endoderm. Dev. Dyn., 228, 239-246.
4. Étude du rôle de l’isthme dans l’organisation du squelette facial
La région de l’isthme représente une jonction entre le mésencéphale et le
rhombencéphale antérieur où s’exprime FGF8 (Fibroblast Growth Factor 8) pendant les stades précoces du développement. Des études très récentes ont montré
que FGF8, en plus de son rôle comme facteur de croissance, serait le candidat
pour organiser l’activité de l’isthme en réprimant l’expression des gènes Hox
(Irving and Masson, 2000). Les cellules de la crête neurale qui sont donc Hoxnégatives sont à l’origine de la formation des pièces du squelette facial et mandibulaire (Couly et al., 2002).
Nous pratiquons des expériences de microchirurgies de régions précises à des
stades précis du développement de l’embryon très jeune pour étudier, par la
suite, l’expression d’un certain nombre de gènes (FGF8, Hox, PITX, etc). Nous
essayons ainsi de comprendre et démontrer l’origine exacte de l’information
nécessaire à l’organisation de l’activité de l’isthme impliqué dans la formation
du squelette facial et mandibulaire.
Mécanisme de la formation des arcs aortiques
L’hypoxie induit la construction de nouveaux vaisseaux sanguins et régule la
croissance des tissues par l’activation de la sous-unité alpha du facteur de transcription « hypoxia-inducible factor 1 ». Le patron d’expression de HIF1 (a été
analysé dans des structures épithéliales et mésenchymateuses de l’embryon de
poulet au cours des 7 premiers jours de développement. On trouve le transcrit
de HIF1 (d’une manière diffuse au sein du neuroépithélium, du bourgeon du
membre et dans le mésenchyme céphalique et puis, plus spécifiquement, dans la
partie ventriculaire du système nerveux central. Plus surprenante est l’expression
de HIF1 (dans l’endoderme de la poche de Sessel et dans l’ectoderme de la
poche de Rathke ainsi que dans le premier arc branchial jusqu’à la disparition
de la membrane bucco-pharyngée. Cette localisation pourrait indiquer un rôle de
HIF1 (dans la formation des arcs aortiques autour de la poche de Sessel au cours
de l’embryogenèse précoce.
Publication : Etchevers, H. (2003). Early expression of hypoxia-inducible factor 1
in the chicken embryo. Mech. Dev., 3, 49-52.
1082
PROFESSEURS HONORAIRES
c) Différenciation et plasticité des lignages cellulaires issus
de la crête neurale
Chercheurs : N. Le Douarin, A. Gonçalves-Trentin (Université de Fioranopolis,
Brésil, Professeur en année sabbatique), C. Real (étudiante en thèse, Université
de Lisbonne), G. Calloni (Université de Fioranopolis, Brésil, boursier Égide)
Ingénieurs de recherche : E. Dupin, P. Vaigot (CEA Génopole, Evry)
ITA : C. Pardanaud-Glavieux
L’étude de cellules individuelles isolées en culture in vitro a révélé que la crête
neurale (CN) est composée de précurseurs variés, la majorité étant pluripotents à
des degrés divers. Chez la caille, une cellule « totipotente » est capable de donner
naissance aux différents lignages issus de la CN céphalique (glial, neuronal,
mélanocytaire et chondrocytaire) par des restrictions progressives subies au cours
du développement. Chez le rat, des cellules pluripotentes capables d’auto-renouvellement ont été mises en évidence dans la CN troncale ainsi que dans certains
de ses dérivés nerveux. Les données acquises dans les deux systèmes ont largement contribué depuis à la connaissance du rôle de certains facteurs extrinsèques
dans le développement des différents lignages issus de la CN. BMP2, neuréguline
et TGFb(agissent respectivement sur le choix de la différenciation en neurones,
cellules gliales et fibroblastes tandis que l’endothéline 3 (ET3) favorise l’émergence des phénotypes mélanocytaire et glial (Lahav et al., 1996, 1998 ; Dupin
et al., 2000).
Ces données ouvrent la voie à une analyse plus approfondie des propriétés des
cellules pluripotentes ou de type souche au cours de la mise en place des dérivés
de la CN. Des questions importantes restent posées à ce sujet : Quels types de
précurseurs sont doués de la capacité de s’auto-renouveler ? Comment évolue la
population de cellules souches au cours du développement ? Quels sont les facteurs qui contrôlent leur capacité de se reproduire et de se différencier ?
Pour aborder ces questions, nous avons testé in vitro la capacité d’auto-renouvellement des cellules de la CN aviaire et analysé le rôle de l’ET3 dans ce
processus. L’étude a porté sur les cellules de la CN native d’origine céphalique
et troncale, ainsi que sur la descendance de cellules différenciées gliales et pigmentaires.
1. Répertoire phénotypique et auto-renouvellement des cellules souches de la
crête neurale aviaire
Au début de la migration, la CN contient des cellules multipotentes ou bipotentes douées de capacités de différenciation et de prolifération hétérogènes. Au
niveau més-métencéphalique, des cellules nerveuses, pigmentaires et de l’ectomésenchyme (cartilage) se différencient in vitro à partir d’un précurseur commun,
ce qui suggère qu’une cellule totipotente de type souche est à l’origine des
nombreux lignages de la CN céphalique. Une telle cellule par définition doit
PROFESSEURS HONORAIRES
1083
posséder un pouvoir d’auto-renouvellement, c’est-à-dire la propriété de donner
naissance à la fois à des cellules différenciées et à de nouvelles cellules souches.
Afin de déterminer quels sont les progéniteurs capables d’auto-renouvellement,
des expériences de sous-clonages successifs de cellules de CN ont été réalisées
in vitro. On s’attend alors à ce que ces progéniteurs de type souche génèrent
dans leur descendance non seulement des cellules différenciées, mais également
de nouveaux progéniteurs de mêmes capacités de développement.
Ces expériences montrent que la propagation des cellules de CN de caille est
possible au cours de plusieurs sous-clonages si les cellules sont cultivées en
présence d’ET3. Ces conditions favorisent notamment l’auto-renouvellement d’un
précurseur commun aux mélanocytes et aux cellules gliales, qui est maintenu à
long terme dans la population des cellules de CN d’origine céphalique et troncale.
Dans la CN céphalique, nous montrons également l’existence de précurseurs
communs à la glie, aux mélanocytes et à des cellules de type myofibroblastiques.
Ces précurseurs ont une capacité de se maintenir plus faible et indépendante de
la présence d’ET3 dans le milieu.
Article en préparation : A. Gonçalves-Trentin, E. Dupin, C. Glavieux-Pardanaud
et N. Le Douarin
2. Analyse de la plasticité des phénotypes mélanocytaire et glial
Au cours du développement, l’émergence de cellules différenciées est traditionnellement considérée comme la conséquence de lignages hiérarchisés et unidirectionnels établis par des restrictions géniques irréversibles. Cette vue est cependant
contredite au cours des processus de transdifférenciation (Blau et al., 2001). Il
est donc possible que des cellules de différents degrés de différenciation soient
recrutées pour jouer le rôle de cellules souches, comme c’est le cas pour les
précurseurs oligodendrocytaires (Kondo and Raff, 2000).
Dans la CN, la plasticité de la différenciation cellulaire est connue. En particulier, nous avons montré que les cellules pigmentaires isolées de l’épiderme de
caille peuvent être conduites à se dé-différencier et à adopter un phénotype glial
sous l’action mitogénique de l’ET3 (Dupin et al., 2000 ; Dupin et Le Douarin,
2003). Récemment, la transdifférenciation inverse, de cellules gliales en mélanocytes a été obtenue in vitro en traitant par l’ET3 des cellules de Schwann
purifiées à partir de nerfs sciatiques embryonnaires et cultivées individuellement
(Dupin et al., 2003). Dans ces conditions, la conversion réciproque des cellules
gliales et pigmentaires s’effectue par l’intermédiaire d’une réversion des cellules
différenciées vers l’état bipotent de leur précurseur commun.
Cette reprogrammation de cellules différenciées suggère qu’une réversion de
la hiérarchie des précurseurs pourrait être assez générale dans la CN. Nous avons
donc examiné l’étendue de la flexibilité des phénotypes dérivés de la CN, et en
particulier dans quelle mesure les cellules pigmentaires peuvent fonctionner
1084
PROFESSEURS HONORAIRES
comme des cellules souches. Les mélanocytes isolés de l’épiderme ont été clonés
puis leur descendance sous-clonée in vitro. En milieu contrôle, la répétition de
cette procédure aboutit à un épuisement rapide du pouvoir prolifératif et une
restriction vers un phénotype mélanocytaire, dès le second sous-clonage. La
présence d’ET3 permet une augmentation du nombre de repiquages productifs
et le maintien de la diversité phénotypique. Bien que la vitesse de division
cellulaire diminue progressivement, on obtient alors une grande majorité de
clones mixtes (glie-mélanocytes) jusqu’au cinquième sous-clonage (Real et al.,
en préparation). Ces expériences révèlent également la présence d’une potentialité
de différenciation myofibroblastique dans la descendance des mélanocytes. Les
cellules pigmentaires embryonnaires peuvent donc reverser vers des précurseurs
plus en amont dans la hiérarchie des cellules de CN et se comporter comme des
cellules souches.
Publications : Dupin, E., Real, C., Glavieux-Pardanaud, C., Vaigot, P. and Le
Douarin, N.M. (2003). Reversal of developmental restrictions in neural crest
lineages : transition from Schwann cells to glial-melanocytic precursors in vitro.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5229-5233.
Dupin, E. and Le Douarin, N.M. (2003). Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene 22, 3016-3023.
d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés
Chercheurs : N. Le Douarin, A.-H. Monsoro-Burq (MdC1, Collège de France),
N. Holleville (docteur vétérinaire, étudiant en thèse)
ITA : M. Bontoux
Le crâne des vertébrés est formé par l’assemblage précis de pièces osseuses
et cartilagineuses, destinées à protéger le cerveau, les organes des sens associés
et la cavité orale. Au cours du développement embryonnaire et de la vie postnatale, la croissance du crâne est étroitement corrélée au développement du cerveau ; et cela principalement par le biais d’interactions avec la dure-mère. La
croissance des plaques osseuses se fait au niveau de zones mésenchymateuses
appelées zones de suture. Les études récentes réalisées chez la souris ont permis
d’identifier les principaux gènes impliqués dans le développement tardif du crâne
(formation de la suture, puis maintien et fermeture de celle-ci). L’analyse génétique de mutants souris présentant une fermeture précoce des sutures (craniosténose) ou au contraire un retard de cette fermeture (dysplasie cleidocraniale), ont
permis d’ébaucher la description des cascades génétiques régulant la croissance
du crâne et le fonctionnement des sutures. Parmi les principaux gènes identifiés,
les FGFRs ont été mis en cause dans de nombreux syndromes (syndromes de
Pfeiffer, de Crouzon, de Jackson-Weiss et d’Apert). L’expression des FGFRs
dans les ostéoblastes varie au cours de la différenciation ; FGFR2 est particulièrement exprimé dans les précurseurs en prolifération, tandis que FGFR1 est associé
aux premières phases de la différenciation des cellules osseuses. D’autres gènes
PROFESSEURS HONORAIRES
1085
tels que TWIST et les Msx ont aussi été impliqués dans le développement du
crâne et associés à certaines malformations craniofaciales, mais leur rôle précis
n’a pas toujours été clairement établi.
Récemment, l’analyse du mutant souris Dlx5-/- a fourni un nouveau gènecandidat dans le développement du crâne. Les Dlx forment une famille comptant
actuellement 6 membres. Dans cette famille, Dlx5 et Dlx6 présentent la propriété
d’être exprimés dans tous les éléments squelettiques (chondrocytes immatures,
périoste, os mature). Chez le mutant de souris Dlx5-/-, tous les éléments osseux
du crâne sont affectés. Le pariétal et l’interpariétal sont particulièrement touchés
puisqu’ils ne présentent aucune ossification. L’étude in vitro du gène Dlx5 sur
lignées cellulaires a montré des résultats contradictoires, Dlx5 étant parfois associé à la différenciation des pré-ostéoblastes en activant le gène ostéocalcine,
tandis que dans d’autres études la surexpression de Dlx5 induit une répression
du gène codant pour l’ostéocalcine. Ces résultats suggèrent qu’un équilibre précis
est nécessaire à l’action normale du gène Dlx5. Le maintien de cet équilibre
pourrait faire intervenir les gènes Msx, dont les propriétés de liaison aux Dlx et
d’inactivation de ces derniers ont été de nombreuses fois mises en évidence.
Nous avons cherché à préciser le rôle de Dlx5 dans la mise en place du crâne
de l’embryon de poulet, et tenté de replacer ce gène dans les cascades génétiques
qui assurent l’ossification du crâne des Vertébrés ainsi que le fonctionnement
des sutures. Nous avons dressé le profil d’expression du gène Dlx5 dans la zone
de formation de l’os frontal du Poulet entre les stades E6 à E16. Nous montrons
ainsi que l’expression de Dlx5 débute dans le mésenchyme non différencié au
stade E7 et qu’il se maintient aux marges des zones de croissance osseuse jusqu’à
E16, stade correspondant à la formation des sutures. L’expression de ce gène a
été comparée à celles des principaux gènes impliqués dans la mise en place du
crâne (Bmp-2, -4, -7, FGFRs, Msx-1, -2), à la prolifération cellulaire, ainsi qu’à
la différenciation osseuse objectivée par l’expression d’un marqueur précoce des
ostéoblastes, l’ostéopontine. Nous montrons ainsi que l’expression de Dlx5 est
initiée et maintenue dans les cellules pré-ostéogéniques en prolifération, mais
pas dans les ostéoblastes matures. Le profil d’expression de Dlx5 suggère une
régulation via les voies Bmps et FGFs. Par un système de culture d’explants à
court terme, nous montrons que la voie Bmp2/4 régule positivement l’expression
de Dlx5, tandis que FGF4 stimule l’expression de Bmp4 dans le mésenchyme
non différencié. Enfin, nous avons comparé l’expression de Dlx5 dans ce système
avec celle de partenaires potentiels, et nous avons ainsi montré que Goosecoid
pourrait être une cible de Dlx5. Nous avons intégré toutes ces nouvelles informations dans les cascades génétiques contrôlant le développement du crâne.
Publication : Holleville, N., Quilhac, A., Bontoux, M. and Monsoro-Burq, A.-H.
(2003) BMP signals regulate Dlx5 during early avian skull development. Dev.
Biol. 257, 177-189.
1086
PROFESSEURS HONORAIRES
Nous avons poursuivi ces recherches en construisant un vecteur d’expression
eucaryote codant pour le gène Dlx5 de Poulet. Nous avons sur-exprimé ce vecteur
dans un système de culture primaire de jeune calvaria de Poulet pour rechercher
les gènes cibles-potentiels de Dlx5 dans ce système. Nous avons identifié un
certain nombre de gènes candidats, dont le gène-maître de la différenciation
osseuse, CBFA1. Nos résultats montrent que Dlx5 initie la différenciation osseuse
dans des cellules dérivées de la crête neurale exprimant déjà un certain nombre
de gènes comme FGFR2 ou Twist. Nous discutons ces résultats, obtenus au
niveau des cellules du futur crâne, par comparaison avec la situation observée
lors de la différenciation osseuse de la mandibule. Nous avons pour cela réalisé
l’ensemble des patrons d’expression des gènes étudiés dans notre première étude,
dans la mandibule de Poulet à E9.
Publication en préparation : Holleville, N., Bollerot, K., Bontoux, M. and MonsoroBurq, A.-H. Dlx5 initiates membrane bone differentiation in chick calvaria.
e) Étude des gènes Msx dans la formation du squelette superficiel :
étude chez la tortue Emys orbicularis
Chercheurs : N. Le Douarin, A.-H. Monsoro-Burq (MdC1, Collège de France),
ITA : C. Vincent, M. Bontoux
Collaboration : C. Pieau (Institut Jacques Monod Paris)
Nos études précédentes ainsi que celles d’autres groupes ont montré le rôle
de la voie de signalisation BMP-Msx dans la formation de la partie dorsale de
la vertèbre et d’autres structures squelettiques superficielles comme le crâne, les
côtes ou la scapula. Nous avons examiné la participation de cette voie dans une
structure squelettique qui se développe en position superficielle, la carapace de
la tortue, en utilisant des embryons de tortue européenne, Emys orbicularis. Nous
avons pour cela cloné un fragment d’ADNc codant pour une homéoboite de
type Msx et analysé l’expression des gènes Msx au cours de l’embryogenèse de
E. orbicularis. Nous avons concentré notre étude sur les étapes précédant la
condensation des cellules du derme dorsal formant la carapace, par analogie avec
d’autres systèmes où l’expression des gènes Msx est présente dans les précurseurs
squelettiques non différenciés mais disparaît des cellules en cours de condensation et de différenciation. Nous avons aussi examiné l’expression des gènes Msx
lors de la formation de la crête de la carapace ou « carapacial ridge, CR »,
structure analogue à la crête apicale ectodermique du bourgeon de membre
« AER ».
Nos résultats montrent que i) l’expression générale des gènes Msx au cours
du développement précoce de la tortue est similaire à ce qui est observé dans
d’autres embryons modèles ; ii) les gènes Msx sont présents dans la CR, selon
une expression similaire à fgf10 ; iii) l’expression des gènes Msx n’est pas détectée avant et lors de la formation des condensations dermiques de la carapace
dorsale. Ces résultats suggèrent que la carapace de la tortue, une nouveauté
PROFESSEURS HONORAIRES
1087
évolutive, spécifique des Chéloniens, n’a pas recruté des mécanismes identiques
à ceux utilisés pour la formation d’autres structures squelettiques superficielles.
Publication en révision : Vincent, C., Bontoux, M., Le Douarin, N.M., Pieau, C.
and Monsoro-Burq, A.-H. Msx gene expression in the carapacial ridge of turtle
embryos : a study of the european pond turtle, Emys orbicularis. Development,
Genes and Evolution.
f) Analyse de l’induction de la crête neurale par le mésoderme paraxial :
une étude chez l’embryon de Xénope
Chercheur : A.-H. Monsoro-Burq (séjour sabbatique à UC Berkeley)
Collaborations : Richard Harland, Russel Fletcher (UC Berkeley)
L’intérêt que je porte à la voie de signalisation de BMP4 dans l’embryogenèse
précoce, est lié à mon désir d’étudier le développement précoce de la crête
neurale. Néanmoins, l’embryon d’oiseau n’est pas le modèle de choix pour une
analyse moléculaire et génétique de ces jeunes stades. Je suis donc partie en
janvier 2002, acquérir une formation dans un autre modèle vertébré, l’embryon
de Xénope, permettant à la fois une analyse des stades précoces, une approche
génétique et moléculaire poussée, et dont les mécanismes de formation de la crête
neurale connus à l’heure actuelle sont conservés avec l’oiseau. C’est pourquoi j’ai
rejoint le laboratoire du Professeur Richard Harland à Berkeley, en souhaitant,
à mon retour, de combiner ces deux modèles complémentaires dans l’analyse du
développement de la crête neurale. Le laboratoire de Richard Harland a montré de
longue date son intérêt pour l’induction neurale et la régulation de la neurulation.
L’initiation de la crête neurale est étroitement liée à ces phénomènes. J’ai donc
naturellement trouvé une place dans les thématiques de l’équipe, et j’ai commencé
par analyser les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’induction de crête
neurale par le mésoderme paraxial.
La formation de la crête neurale chez l’embryon est contrôlée par des signaux
issus des tissus adjacents, l’ectoderme et le mésoderme. Des études, réalisées
chez le Poulet et le Xénope, ont montré que l’ectoderme agit par une signalisation
Wnt. Les mécanismes d’induction par le mésoderme restaient inconnus.
Nous avons caractérisé l’induction de crête neurale par le mésoderme, in vivo
et in vitro et analysé le rôle des Wnts et des FGFs dans l’induction de crête
neurale par le mésoderme paraxial, en bloquant chacune de ces voies séparément
et en contrôlant simultanément 1) la polarisation antéro-postérieure du tissu neural et 2) la formation du mésoderme. Cette étude montre que l’activité inductrice
du mésoderme nécessite une signalisation FGF, et que la signalisation par les
Wnt n’est pas nécessaire dans ce système. Nous avons mis en évidence la capacité
de FGF8 à induire de la crête neurale, sans addition d’antagonistes aux BMPs,
ce qui diffère de l’activité des Wnts. Cette induction est transitoire, découplant
ainsi pour la première fois la phase d’induction de la phase de maintien de
1088
PROFESSEURS HONORAIRES
l’induction de la crête neurale. Ceci montre un contrôle multifactoriel de l’induction de la crête neurale et de gènes comme Slug ou FoxD3.
In vivo, la sur-expression ou le blocage des voies Wnt modifie la polarisation
antéro-postérieure de la plaque neurale et la formation du mésoderme, les modifications de la formation de la crête neurale seraient donc consécutives à ces
premières perturbations. Nous avons mis en évidence cependant, une hétérogénéité dans l’activité de différents FGFRs in vivo, dans la polarisation neurale et
l’induction de crête neurale.
Publication : Monsoro-Burq, A.-H., Fletcher, R. and Harland, R. (2003). Neural
crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.
Development, 130, 3111-3124.
II. HÉMATOPOÏÈSE ET IMMUNITÉ
a) Mise en évidence par des tests in vitro d’une fonction hématopoïétique
du placenta chez la Souris
Chercheurs : F. Dieterlen-Lièvre, J. Salaün, M. Alvarez da Silva (Université de
Fioranopolis, Brésil, Professeur en année sabbatique)
Collaboration : C. Corbel (INSERM, Institut Cochin, Paris)
ITA : M.-C. Malidor
Au cours du développement des Vertébrés, la détermination des cellules
souches hématopoïétiques (CSH) d’une part, leur multiplication et leur engagement dans une des voies de différenciation possibles d’autre part ont lieu dans
des sites distincts. Le sac vitellin, premier des organes hématopoïétiques de
l’embryon, est le seul où ces deux fonctions coexistent. Les organes hématopoïétiques successifs identifiés à l’heure actuelle sont le foie fœtal (chez les Mammifères) et la moelle osseuse, le thymus, la rate et la bourse de Fabricius (chez les
Oiseaux). Le sac vitellin a d’abord été tenu pour le site où apparaissaient les
CSH destinées à assurer le renouvellement des cellules sanguines pendant la vie
entière d’un individu. Nos travaux antérieurs ont mis en évidence :
— l’existence, chez les Oiseaux, d’un deuxième puis d’un troisième site de
détermination de CSH, respectivement l’aorte, puis l’allantoïde ;
— chez la Souris, une production de CSH par l’aorte, comme chez les
Oiseaux.
Nos travaux actuels se focalisent sur les capacités à cet égard du placenta
chorio-allantoïdien de la Souris. À l’aide de cultures clonogéniques in vitro, nous
démontrons la présence de progéniteurs abondants dans le placenta entre E9 et
E17. Ces progéniteurs sont plus fréquents dans le placenta que dans le foie fœtal,
ils y apparaissent 24 heures plus tôt, et présentent un pourcentage plus important
de progéniteurs très immatures. Ces caractéristiques nous mènent à la conclusion
PROFESSEURS HONORAIRES
1089
que le placenta est un organe hématopoïétique très actif (manuscrit soumis pour
publication).
Nous émettons par ailleurs l’hypothèse que ces progéniteurs pourraient se
déterminer dans cet organe et sommes en train de la tester à l’heure actuelle
(collaboration avec Catherine Corbel, Institut Cochin, Paris).
b) Mise en évidence dans le placenta, par restauration de souris irradiées,
de cellules restauratrices à long terme (LTR-CSH)
Chercheurs : F. Dieterlen, J. Salaün
Collaborations : H. Mikkola, C. Gekkas et S. Orkin (Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA)
ITA : M.-C. Malidor
L’« étalon-or » de la CSH est la possibilité pour ce type de cellule de s’installer
de manière durable (6 mois ou plus) dans la moelle osseuse d’une souris adulte
irradiée et de contribuer de manière significative à l’hématopoïèse de l’hôte. Il
y a bien dans le placenta murin des LTR-CSH, mais leur évolution est un peu
différente de celle des progéniteurs clonogéniques (voir ci-dessus) : les cellules
souches à long terme présentent un pic de fréquence à E12, diminuent fortement
à E15 et ont disparu du placenta à E18. En revanche elles sont abondantes à ce
stade dans le foie.
Ces expériences permettent de conclure que le placenta a un rôle important
dans l’hématopoïèse embryonnaire, que sa contribution est probablement tout à
fait critique pour la mise en place correcte du système hématopoïétique. Le
déroulement chronologique de cette fonction par rapport à celui des activités du
foie et de l’aorte nous incite à penser que le placenta produit des cellules souches
hématopoïétiques, collaborant donc avec la région de l’aorte. Ce point important
fait l’objet de nos recherches actuelles. Le rôle du foie, comme passage obligé
permettant l’amplification de la population de CSH avant la colonisation de la
moelle osseuse, tel qu’il est conçu jusqu’à présent, est conforté par nos résultats.
c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance :
caractérisation des cellules régulatrices chez la souris NOD
Chercheurs : N. Le Douarin, J. Salaün
ITA : P. Belo-Diabangouaya
Collaborations : V. Thomas-Vaslin (CERVI-Pitié-Salpêtrière, Paris), A. Coutinho (Institut Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal)
Nos expériences de greffes de thymus surnuméraires, préalablement inoculés
avec des îlots pancréatiques de souche de souris normales, chez la souris NOD
(Non Obese Diabetic) suggèrent que des cellules régulatrices, sélectionnées dans
ces thymus ectopiques contrôlent la réactivité des cellules effectrices différenciées
dans le thymus endogène du receveur. Notre but est d’isoler et de caractériser
1090
PROFESSEURS HONORAIRES
ces cellules régulatrices (Salaün et al., 2002). Pour cela nous analysons les
cellules T périphériques des souris NOD protégées par la greffe ectopique de
thymus + îlots pancréatiques.
Leur phénotype est étudié par immunofluorométrie par marquage membranaire
permettant d’identifier les cellules T régulatrices exprimant généralement CD4,
CD25, CD62L, CD45RB.
L’activité suppressive des cellules est testée par leur transfert à des souris
NOD « naïves » pour tenter de prévenir le diabète chez ces receveurs.
Ce travail est actuellement en cours.
LISTE DES PUBLICATIONS
2002
DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. (2002). The avian embryo, a model for the
role of cellular interactions in development ; the example of neural crest-derived
pigment cells. Proceedings of the International Congress on Bird Reproduction,
Tours, September 1999. Avian Poult. Biol. Rev., 13, 155-167.
CHARRIER, J.-B., LAPOINTE, F., LE DOUARIN, N. and TEILLET, M.-A. (2002).
Dual origin of the floor plate in avian embryo. Development, 129, 4785-4796.
LE DOUARIN, N.M. (2002). La crête neurale : une structure pluripotente de
l’embryon des vertébrés. Bull. Soc. Roy. Sci. Liège, 71, 87-117.
ETCHEVERS, H.C., COULY, G. and LE DOUARIN, N.M. (2002). Morphogenesis
of the branchial vascular sector. Trends Cardiov. Med., 12, 299-304.
FREITAS, C., RODRIGUES, S., CHARRIER, J.-B., TEILLET, M.-A. and PALMEIRIM, I.
(2002). Horloge moléculaire et segmentation des vertébrés : qui fait quoi ? Méd.
Sci., 18, 883-887.
2003
ETCHEVERS, H. (2003). Early expression of hypoxia-inducible factor 1 in the
chicken embryo. Mech. Dev., 3, 49-52.
HOLLEVILLE, N., QUILHAC, A., BONTOUX, M. and MONSORO-BURQ, A.-H. (2003).
BMP signals regulate Dlx5 during early avian skull development. Dev. Biol.,
257, 177-189.
DUPIN, E., REAL, C., GLAVIEUX-PARDANAUD, C., VAIGOT, P. and LE DOUARIN,
N.M. (2003). Reversal of developmental restrictions in neural crest lineages :
transition from Schwann cells to glial-melanocytic precursors in vitro. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100, 5229-5233.
PROFESSEURS HONORAIRES
1091
DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. (2003). Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene, 22, 3016-3023.
THIBERT, C., TEILLET, M.-A., LAPOINTE, F., MAZELIN, L., LE DOUARIN, N.M.
and MEHLEN, P. (2003). Sonic hedgehog controls survival of the neuroepithelial
cells of the developing neural tube by regulating Patched-induced apoptosis.
Science, 301, 843-846.
RUHIN, B., CREUZET, C., VINCENT, C., BENOUAICHE, L., LE DOUARIN, N.M. and
COULY, G. (2003). Patterning of the hyoid cartilage depends upon signals arising
from the ventral foregut endoderm. Dev. Dyn., 228, 239-246.
Sous presse
LE DOUARIN, N.M. and DUPIN, E. (2003). Multipotentiality of the neural crest.
Curr. Op. Gen. Dev.
DIETERLEN-LIÈVRE, F., CREUZET, S. and SALAÜN, J. (2003). In vivo methods to
analyze cell origins, migrations, homing, and interactions in the blood, vascular,
and immune systems of the avian and mammalian embryo. Methods in Molecular
Medicine, Baron M. ed., Humana Press.
DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. Influence of endothelin 3 on the development
of pigment cells from the neural crest. In Proceedings of the International Workshop on Molecular Mechanisms of Tanning. Ortonne, J.-P. ed., Martin Dinitz Ltd,
London,
DISTINCTIONS ET ACTIVITÉS DIVERSES
Distinction
2002
●
Grand Officier dans l’Ordre National de la Légion d’Honneur.
Congrès et Colloques
2002
●
●
2003
●
●
Conférence au Colloque de la Fondation des Treilles (Centre d’Études
du Bassin Méditerranéen) « The body plan », organisé par E. De Robertis et D. Duboule, du 20 au 25 septembre.
Conférence à l’Hôtel d’Assezat, Toulouse, le 3 octobre, Invitation : Pr
Anne-Marie Duprat.
Conférence au XVe Colloque de l’IFSBM « Cellules souches et Thérapie cellulaire », le 28 avril.
Séminaire à l’Université de Rome « La Sapienza », le 22 mai, Invitation : Pr Gabrielle Augusti-Tocco et Pr Paolo Amati.
1092
PROFESSEURS HONORAIRES
Organisation de symposium
2003
« Immunité Innée. De la Drosophile à l’Homme », Académie des
Sciences, Institut de France, Paris, 19-20 mai.
Thèse
2003
Jean-Baptiste Charrier. « Rôles respectifs des mouvements morphogénétiques et de l’induction dans la formation de la floor plate : étude expérimentale chez l’embryon d’oiseau ». Université Paris VII — Denis
Diderot (11 juin 2003).
M. Jean LECLANT, membre de l’Institut
(Académie des Inscriptions et Belles-Lettres)
Égyptologie, 1979-1990
Missions et activités
Secrétaire perpétuel de l’Académie des inscriptions et belles-lettres. Vice-président de la Commission nationale française de l’UNESCO, président du Hautcomité des Célébrations nationales, président d’honneur de la Société asiatique
et de la Société internationale des études nubiennes, ancien président de la Société
française d’égyptologie.
Participation à des colloques et conférences (Rome, Florence, Strasbourg,
Caen, Paris, Grenoble).
Publications
— CDRom, L’écriture méroïtique (avec Claude Rilly), L’aventure des écritures, Bibliothèque nationale de France et Réunion des Musées Nationaux, 2002.
— Avec Claude Rilly : Lingua y escritura en el reino de Meroe, catalogue de
l’exposition organisée à Barcelone en 2003 par la Fundación « la Caixa » : Nubia,
Los reinos del Nilo en Sudán, pp. 76-79, 3 fig.
— Sur les relations de l’Académie des Inscriptions et Belles-Lettres et de
l’Académie des Sciences au XVIIIe siècle, Actes du Colloque « Règlement, usages
et services dans la France de l’absolutisme », Paris, Juin, 1999, 2002, pp. 95108.
Téléchargement
Explore flashcards