857 Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l`Institut

PROFESSEURS HONORAIRES 857
M
me
Nicole L E D OUARIN , membre de l’Institut
(Académie des Sciences)
Embryologie cellulaire et moléculaire, 1988-2000
Les recherches effectuées au cours de l’année académique 2004-2005 ont
concerné les thèmes suivants :
I. Neurogenèse
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
b) Spécification du squelette nasal par l’endoderme le plus rostral (foregut)
et le bourrelet neural antérieur
c) La crête neurale et le développement du cerveau antérieur et moyen
d) Étude chez l’embryon d’oiseau du rôle de Sonic hedgehog (Shh) dans le
développement du squelette facial dérivé de la crête neurale
e) Mise en évidence de cellules souches dans la crête neurale et ses dérivés
II. Hématopoïèse et immunité
a) Mise en évidence d’une fonction hématopoïétique du placenta chez la
Souris
b) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance
I. N
EUROGENÈSE
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
Chercheurs : M.-A. Teillet, J.-B. Charrier et N. Le Douarin
Ingénieur d’étude : F. Lapointe
Collaboration : M. Catala (UMR CNRS 7000 et Laboratoire d’Histologie et
Embryologie, Faculté de Médecine Pitié-Salpêtrière, Université Pierre et Marie
Curie)
Le développement des organes axiaux chez l’embryon d’oiseau est dirigé par
une structure appelée nœud de Hensen qui est l’équivalent de la lèvre dorsale
du blastopore des amphibiens, du nœud des mammifères et du bouclier chez le
poisson zèbre. Dans des expériences précédentes, nous avons montré que le nœud
de Hensen est à l’origine de toutes les cellules de la ligne médiane (floor plate,
notochorde et endoderme dorsal). La mise en place de ces cellules se fait par
un mouvement rostro-caudal du nœud dépendant de l’intégrité de celui-ci. En
effet, en l’absence de la partie caudale du nœud, ce mouvement n’a pas lieu et
les cellules de la ligne médiane s’amassent sur place, privant ainsi la région
caudale du tube nerveux de notochorde et de floor plate. La partie caudale du
nœud, indispensable à son recul, est constituée de cellules mésenchymateuses
qui, lors de l’ablation de la région du nœud plus antérieure, sont capables de
fournir les deux types de cellules : floor plate et notochorde. Nous pensons que
les cellules mésenchymateuses de la région caudale du nœud de Hensen ont les
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caractères de cellules souches bipotentielles. Elles doivent donc, à un moment
du développement, effectuer un choix de différenciation. Ce choix pourrait
dépendre de la signalisation Notch/Delta comme cela a déjà été montré chez le
poisson zèbre et le xénope. Par des hybridations in situ in toto chez des embryons
de poulet au stade de 5 somites nous avons montré que Notch et Delta sont co-
exprimés dans la région caudale du nœud de Hensen, alors que ces gènes ne
sont pas exprimés dans la région rostrale du nœud où le choix floor plate/
notochorde est déjà réalisé (Charrier et al., 2005). La surexpression de l’un ou
l’autre de ces gènes nous permettra de conclure si, chez les oiseaux comme chez
le poisson zèbre ou le xénope, l’expression de Notch favorise le développement
de la floor plate aux dépens de la notochorde.
Publication : Charrier J.B., Catala M., Lapointe F., Le Douarin N. and Teillet
M.A. (2005). Cellular dynamics and molecular control of the development of
organizer-derived cells in quail-chick chimeras. Int. J. Dev. Biol. 49, 181-191.
b) Spécification du squelette nasal par l’endoderme le plus rostral
(foregut) et le bourrelet neural antérieur
Chercheurs : N. Le Douarin, G. Couly (Professeur en Chirurgie maxillo-faciale
pédiatrique, Hôpital Necker), L. Benouaiche (Interne des Hôpitaux de Paris,
étudiante en thèse)
Ingénieur d’étude : C. Vincent
Nous avons montré dans nos travaux antérieurs que l’endoderme embryonnaire
précoce de l’oiseau (au stade 3-5 somites) spécifiait la crête neurale antérieure
afin de déterminer la différenciation cartilagineuse, la forme et l’orientation de
la pièce squelettique. Nous avons étendu nos recherches à la spécification du
squelette ostéocartilagineux nasal par l’endoderme dans sa partie toute antérieure.
Nos résultats préliminaires montrent i) que le squelette nasal est constitué d’une
moitié droite et d’une moitié gauche qui fusionnent précocement ; ii) qu’il existe
comme pour le cartilage de Meckel et le cartilage hyoïdien, une zone précise
dans le plancher rostral de l’endoderme, qui spécifie la crête neurale antérieure
lors du développement de la capsule cartilagineuse, mais uniquement dans sa
partie basale (basi-septum). La partie neurosensorielle de la capsule nasale
(ethmoïde médian, crista galli, lamina cribosa, conchae) paraît spécifiée par le
bourrelet neural antérieur ectodermique comportant la placode olfactive.
Publication en préparation : Couly G., Benouaiche L., Vincent C. and Le
Douarin N. Specification by foregut and rostral ectoderm of the nasal capsule
development by the neural crest cells.
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c) La crête neurale et le développement du cerveau antérieur et moyen
Chercheurs : N. Le Douarin, S. Creuzet (chercheur post-doctoral)
Collaboration : S. Martinez (Professeur, Institut des Neurosciences, Université
d’Alicante, Espagne)
Le squelette craniofacial et hyoïdien des vertébrés est constitué de chondro-
cytes et d’ostéocytes dérivés de la crête neurale (CN). Nos précédents travaux
ont montré que, suite à l’ablation de la CN faciale, dont le territoire s’étend du
diencéphale jusqu’au 2
e
rhombomère (r2), l’agénésie du squelette craniofacial
s’accompagne de perturbations profondes du développement prosencéphalique
et mésencephalique.
Nous avons cherché à évaluer l’étendue des déficits générés par l’absence de
CN céphalique sur le devenir du neuroépithélium céphalique et le développement
du cerveau. Les embryons privés chirurgicalement de CN, qui se développent en
absence de structure faciale, présentent un défaut de fermeture du tube neural et
un cerveau largement exencéphalique le long des territoires excisés (i.e. pros-,
més-, rhombencéphale antérieur). En outre, chez ces embryons, l’expression des
marqueurs thalamique et mesencéphalique dorso-médians Wnt1 et Wnt8b dispa-
raît complètement ; il s’ensuit l’agénésie des noyaux thalamiques dorsaux. De
plus, des modifications profondes du patron d’expression des gènes Emx,Pax6,
Dlx2 affectent le primordium téléncéphalique alors que, simultanément, la dorsa-
lisation de la lame basale impliquant une signalisation dépendante Shh et la
rostralisation du domaine d’expression d’Otx2 s’opèrent aux dépens de la spécifi-
cation du primordium diencéphalique.
Dans un précédent travail nous avions montré que l’ablation de la CN anté-
rieure coïncide précocement avec une perte d’expression de Fgf8 dans le bourre-
let neural antérieur. Chez les embryons privés de CN faciale, l’apport d’une
source exogène de FGF8 permet de régénérer le développement tél-, di- et
mésencéphalique. Nous avons pu montrer que l’apport de FGF8 consiste à stimu-
ler la progression rostrale des cellules de la CN à partir de r3, situé à la limite
du territoire excisé. Il s’avère que les cellules de la CN au cours de leur migration
le long de l’ébauche neurale antérieure permettent la fusion des lames latérales
du neuroépithélium céphalique. Ultérieurement, elles assurent la restauration du
« patterning moléculaire » thalamique et téléncéphalique.
L’ensemble de ces données tend à accréditer l’existence d’une signalisation
dorsale dépendant de la CN essentielle pour les premières étapes précoces de la
neurulation et la morphogenèse du cerveau moyen et antérieur.
Publication en préparation : Creuzet S., Martinez S., and Le Douarin N.M.
(2005) Effects of cephalic neural crest on fore- and midbrain development.
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PROFESSEURS HONORAIRES 860
d) Étude chez l’embryon d’oiseau du rôle de Sonic hedgehog (Shh) dans
le développement du squelette facial dérivé de la crête neurale
Chercheurs : N. Le Douarin, J. de Brito Neto (chercheur post-doctoral)
Ingénieur d’étude : C. Vincent
Le squelette craniofacial des vertébrés est constitué de chondrocytes et d’ostéo-
cytes issus de la crête neurale céphalique (CNC). On distingue deux domaines
dans la CNC : un domaine antérieur où les gènes Hox ne sont pas exprimés
(domaine Hox-négatif) qui donne naissance au squelette fronto-nasal et maxillo-
mandibulaire ; un domaine postérieur où les gènes Hox sont exprimés (domaine
Hox-positif) qui donne naissance à l’os hyoïde. Sonic Hedgehog (SHH) est une
protéine morphogène qui participe à de nombreux processus embryonnaires. Au
début de la formation céphalique, le gène Shh est exprimé par la plaque préchor-
dale et la partie ventrale de l’endoderme antérieur. La mutation de Shh provoque
de multiples malformations parmi lesquelles l’holoprosencephalie, la cyclopie et
l’absence des éléments squelettiques faciaux. Une partie de ces phénotypes est
la conséquence de la mort cellulaire par apoptose de cellules de la CNC. La
disparition de ces cellules provoque le non-développement du 1
er
arc branchial
qui est à l’origine de la mâchoire des vertébrés (le bec des oiseaux).
Afin d’étudier le rôle de SHH dans la formation du squelette facial nous avons
entrepris de faire varier expérimentalement l’expression de cette protéine aux
jeunes stades du développement, chez l’embryon de poulet. Initialement, nous
avons réalisé des ablations de la partie prosencéphalique de la tête (principale
source de SHH) sur des embryons de 5-6 somites (1 jour et demi d’incubation),
dans l’œuf. Ces expériences ont provoqué la formation d’embryons privés de
bec. En revanche, l’addition chez les excisés de billes imprégnées de la protéine
SHH a induit la formation d’une mandibule, montrant qu’elle compensait l’absence
de la région prosencéphalique. Ce résultat suggère que SHH déclenche la voie
de signalisation responsable du développement de la mâchoire à partir des cel-
lules de la CNC compétente. Cette hypothèse a été confirmée avec le résultat
de la greffe de cellules transfectées avec Shh (QT6-Shh) sur des embryons intacts,
au niveau du mésencéphale postérieur, dans le domaine Hox-négatif. Cette expé-
rience a produit la triplication en miroir de la mandibule, avec ses éléments
cartilagineux et osseux. La greffe de cellules QT6-Shh dans le domaine Hox-
positif ne provoque pas la formation d’une mâchoire supplémentaire.
e) Mise en évidence de cellules souches dans la crête neurale et ses dérivés
Chercheurs : N. Le Douarin, C. Real (étudiante en thèse, Université de Lisbonne)
Ingénieurs de recherche : E. Dupin, P. Vaigot (CEA Génopole, Évry)
ITA : C. Pardanaud-Glavieux
Collaborations : A. Gonçalves-Trentin (Université de Fioranopolis, Brésil)
La mise en place des multiples organes et types cellulaires dérivés de la
crête neurale se fait à partir de précurseurs dotés de larges potentialités, dont la
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PROFESSEURS HONORAIRES 861
différenciation est soumise à l’influence de facteurs locaux rencontrés au terme
de leur migration. Récemment, nous avons poursuivi la caractérisation de ces
précurseurs chez l’embryon d’oiseau, aux niveaux troncal et céphalique.
Par des études clonales in vitro, nous nous avons démontré notamment l’exis-
tence de différents types de cellules souches pluripotentes, qui présentent une
capacité d’auto-renouvellement en présence d’une cytokine peptidique exprimée
dans certains tissus embryonnaires, l’endothéline 3 (ET3) (Trentin et al., 2004).
Parmi les dérivés de la crête neurale, les cellules pigmentaires de la peau et
les cellules gliales des nerfs périphériques ont révélé une plasticité insoupçonnée.
In vitro, ces cellules différenciées peuvent en effet revenir à un état plus immature
et être re-programmées vers d’autres types cellulaires issus de la crête neurale.
Les cellules de Schwann effectuent ainsi une transdifférenciation en mélanocytes
et myofibroblastes (Real et al., 2005). Sous l’effet mitotique de ET3, les cellules
pigmentaires isolées de l’épiderme se dédifférencient et peuvent être reconverties
en cellules gliales et myofibroblastes. Cette reprogrammation implique la généra-
tion de cellules pluripotentes capables d’auto-renouvellement in vitro, tout à fait
comparables aux cellules souches présentes dans la crête neurale native (Real et
al., soumis).
Ces résultats montrent la grande plasticité de différenciation des précurseurs
de la crête neurale (Le Douarin et al., 2004, revue Development) et suggèrent
que, dans certaines pathologies, des cellules différenciées dérivées de la crête
neurale pourraient être recrutées pour participer aux processus de réparation.
Publications : Trentin A., Glavieux-Pardanaud C., Le Douarin N.M. and Dupin E.
(2004). Self-renewal capacity is a widespread property of various types of neural
crest precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 101 4495-4500. Le Douarin
N.M., Creuzet S., Couly G. and Dupin E. (2004). Neural crest cell plasticity
and its limits. Development 131, 4637-50. Review article. Real C., Glavieux-
Pardanaud C., Vaigot P. Le Douarin N.M. and Dupin E. (2005). The instability
of the neural crest phenotypes : Schwann cells can differentiate into myofibro-
blasts. Int. J. Dev. Biol., 49, 151-159.
Publication en préparation : Real C., Glavieux-Pardanaud C., Le Douarin N.M.
and Dupin E. Differentiated pigment cells generate self-renewing neural crest
cells in clonal culture.
II. H
ÉMATOPOI
¨ÈSE ET IMMUNITÉ
a) Mise en évidence d’une fonction hématopoïétique du placenta chez la Souris
Chercheurs : F. Dieterlen, J. Salaün
Collaborations : C. Corbel (INSERM U567, CNRS 8104, Institut Cochin, Paris),
H. Mikkola, C. Gekkas et S. Orkin (Children’s Hospital, Harvard Medical School,
Boston, USA)
ITA : P. Belo-Diabangouaya
Nous montrons chez le fœtus de souris que le placenta est riche en progéniteurs
et en cellules souches hématopoïétiques (CSH), ce qui indique un rôle important
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