1199 Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l`Institut (Académie des

PROFESSEURS HONORAIRES 1199
M
me
Nicole L E D OUARIN , membre de l’Institut
(Académie des Sciences)
Embryologie cellulaire et moléculaire, 1988-2000
Les recherches effectuées au cours de l’année académique 2003-2004 ont
concerné les thèmes suivants :
I. Neurogenèse
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés
c) Différenciation des cellules de la crête neurale
II. Hématopoïèse et immunité
a) Mise en évidence par des tests in vitro d’une fonction hématopoïétique
du placenta chez la Souris
b) Mise en évidence dans le placenta, par restauration de souris irradiées,
de cellules restauratrices à long terme (LTR-CSH)
c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance : caractérisa-
tion des cellules régulatrices chez la souris NOD.
I. N
EUROGENÈSE
a) Neurogenèse et développement des organes axiaux
Chercheurs : M.-A. Teillet et N. Le Douarin
Ingénieur d’étude : F. Lapointe
Collaboration : P. Melhen (Université Lyon 1, UMR CNRS 5534), D. Duprez
(Université Paris 6, UMR CNRS 7622), T. Jaffredo (Université Paris 6, UMR
CNRS 7622) et I. Palmeirim (Institut Gulbenkian, Oeiras, Portugal)
Depuis plusieurs années nous nous intéressons à l’origine et à la différenciation
des cellules de la ligne médiane, notochorde et plaque du plancher du tube neural
(floor plate) au cours de la neurulation des vertébrés, et à Sonic Hedgehog (SHH)
une protéine secrétée par ces deux structures et jouant un rôle important dans le
développement de nombreux autres organes.
Dès 1983 nous avions montré qu’après l’ablation du tube nerveux et de la
notochorde chez l’embryon de poulet de 2 jours d’incubation (E2), le mésoderme
paraxial (somites) subit une mort cellulaire massive aboutissant à l’absence de
vertèbres (Teillet and Le Douarin, 1983). Quelques années plus tard nous avons
montré que parmi les dérivés myogéniques des somites, seules les cellules muscu-
laires des membres et de la paroi du corps survivent à l’absence des structures
axiales (Rong et al., 1992) et plus récemment, nous avons montré que la protéine
SHH secrétée par la notochorde et la floor plate est le facteur nécessaire et

PROFESSEURS HONORAIRES 1200
suffisant pour assurer la survie des cellules chondrogéniques et myogéniques
axiales des somites (Teillet et al., 1998).
Après avoir mis en évidence par la technique des chimères caille-poulet que
toutes les cellules de la ligne médiane proviennent du nœud de Hensen, l’organi-
sateur des oiseaux (Catala et al., 1996), nous avons montré que ces cellules sont
également indispensables à la survie du tube neural lui-même. En effet, lorsque
le nœud entier ou sa région postérieure sont excisées, il se produit un arrêt de
la mise en place des cellules de la ligne médiane. Une apoptose massive apparaît
en 24 h dans le tube nerveux. Celle-ci peut aboutir à la disparition de tous les
tissus caudaux et à la troncation de l’embryon. L’apoptose des tissus nerveux et
somitiques peut être évitée par l’adjonction d’une source de SHH (Charrier et
al., 2001).
Une explication à ce phénomène d’apoptose nous a été fournie par une collabo-
ration avec une équipe lyonnaise dirigée par Patrick Mehlen. Nous avons ainsi
montré que Patched1 (Ptc1) le récepteur de SHH, présent dans le tube neural et
de nombreux autres tissus embryonnaires, est responsable de l’apoptose observée
en l’absence des cellules de la ligne médiane (Thibert et al., 2003). Patched
serait un récepteur à dépendance. En présence de son ligand, SHH, il initierait
une cascade de différenciation, alors qu’en l’absence de ce ligand, il déclencherait
une cascade apoptotique. Ce récepteur transmembranaire présente en effet la
particularité, en l’absence de SHH, d’être clivé par la caspase 3 dans son domaine
intracytoplasmique, exposant ainsi un domaine pro-apoptotique. La surexpression
de Ptc1 sauvage dans le tube nerveux in vivo ou sa transfection dans des cellules
en culture en l’absence de SHH entraîne une mort cellulaire massive qui peut
être evitée par SHH. De plus, la transfection de cellules en culture avec Ptc1
tronqué au site de clivage produit également la mort cellulaire, mais celle-ci ne
peut pas être sauvée par SHH. Inversement, une mutation au site de clivage
enlève à Ptc son caractère pro-apoptotique. Lorsque le Ptc dominant négatif est
transfecté in vivo dans des cellules d’un tube nerveux privé de cellules de la
ligne médiane, l’apoptose normalement provoquée par l’absence de SHH produit
par les cellules de la ligne médiane est diminuée (Thibert et al., 2003).
Ces expériences suggèrent que Patched, récepteur à dépendance, exerce un
rôle important dans le développement du système nerveux central en régulant à
la fois la mort cellulaire programmée qui sculpte les organes, et la différenciation
cellulaire. Il est vraisemblable que la double action de Ptc s’exerce dans d’autres
systèmes où il a été montré que SHH a un rôle dans la survie cellulaire, comme
le mésoderme paraxial ou la crête neurale par exemple.
Publication : Thibert C., Teillet M.-A., Lapointe F., Mazelin L., Le Douarin
N.M. and Mehlen P. (2003). Sonic hedgehog controls survival of the neuroepithe-
lial cells of the developing neural tube by regulating Patched-induced apoptosis.
Science, 301, 843-846.

PROFESSEURS HONORAIRES 1201
Publications sous presse : Teillet M.-A., Naquet R. and Batini C. (2004) Trans-
fer of an avian genetic reflex epilepsy by embryonic brain graft : a tissue autono-
mous process ? Int. J. Dev. Biol. Charrier J.-B., Catala M., Le Douarin N. and
Teillet M.-A. (2004). Cellular dynamics and molecular control of the develop-
ment of organizer-derived cells studied in quail-chick chimeras. Int. J. Dev. Biol.
b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés
Chercheurs : N. Le Douarin, G. Couly (Professeur en Chirurgie maxillo-faciale
pédiatrique, Hôpital Necker), S. Creuzet (chercheur post-doctoral), K. Mohammedi-
Ladjali (chercheur post-doctoral), J. de Brito Neto (chercheur post-doctoral),
L. Benouaiche (Interne en chirurgie, Hôpital d’Amiens, étudiante en thèse)
Ingénieur d’étude : C. Vincent
Collaboration : S. Martinez (Instituto de Neurosciencias, San Juan de Alicante,
Espagne)
1. Régéneration à distance des structures faciale et mandibulaire
Dans un travail précédent (Couly et al., 2002), nous avons montré que l’excision
de la crête neurale s’étendant du diencéphale jusqu’au rhombomère r2 — domaine
où les gènes Hox ne sont pas exprimés — produit l’agénésie du squelette facial
et mandibulaire. Outre les déficits squelettiques associés à l’ablation de la crête
neurale Hox-négative, nous avons observé des perturbations sévères du dévelop-
pement des vésicules céphaliques aboutissant à une exencéphalie étendue le long
du territoire réséqué de la crête, c’est-à-dire du prosencéphale jusqu’au méten-
céphale.
Situées à la limite postérieure du territoire excisé, c’est-à-dire à la jonction
des domaines Hox-positif et -négatif, les cellules issues de la crête neurale du
rhombomère 3 (r3) subissent précocement au cours du développement normal
une apoptose massive sous le contrôle des rhombomères adjacents. Ainsi, la
région branchiale reçoit-elle une contribution mineure des cellules de la crête de
r3 dont la participation aux structures squelettiques se limite à l’apophyse du
processus rétro-articulaire dans le 1
er
arc (Hox-négatif) et au tiers médian du
basihyal dans le 2
e
arc (Hox-positif).
Toutefois, dans le modèle expérimental où la crête neurale du domaine Hox-
négatif est excisée, les cellules de la crête de r3 qui échappent au contrôle
apoptotique environnant, présentent une capacité invasive accrue et développent
un statut globalement Hox-négatif. Dans ce contexte, l’implantation d’un greffon
de crête neurale au niveau diencéphalique assure le maintien du bourgeon naso-
frontal et le développement du prosencéphale. Parallèlement, la présence du
greffon antérieur stimule la colonisation du 1
er
arc branchial par les cellules de
la crête de r3 qui sont alors capables de générer la totalité du squelette cartilagi-
neux de la mâchoire inférieure.

PROFESSEURS HONORAIRES 1202
Nous avons cherché à identifier les mécanismes par lesquels la crête neurale
placée au niveau diencéphalique stimule à distance la régénération mandibulaire
par les cellules issues de r3. A
`l’excision des crêtes neurales Hox-négatives
suivent des perturbations profondes du patron d’expression de Fgf8 qui affectent
tant le neuroépithélium prosencéphalique que l’ectoderme des bourgeon naso-
frontal et 1
er
arc branchial, mais que restaure la présence de crête neurale greffée
au niveau diencéphalique. L’apport d’une source exogène de FGF8, au moyen de
billes imprégnées de protéine recombinante placées au contact soit du bourgeon
nasofrontal soit du 1
er
arc branchial, oriente sélectivement la régénération soit de
la capsule nasale et du cerveau antérieur, soit des squelettes maxillaire et mandi-
bulaire.
Nos résultats montrent que i) FGF8 exerce à distance un effect trophique et
attractant sur les cellules de la crête neurale, ii) la crête neurale issue du 3
e
rhombomère en réponse au facteur diffusible FGF8, supporte la régénération
d’une partie étendue des structures squelettiques de la face, iii) la crête neurale
placée rostralement exerce un effet trophique sur le développement du prosencé-
phale en stimulant localement l’expression de Fgf8. L’identification des territoires
présencéphaliques dont la formation et la maturation sont soutenues en présence
de la protéine FGF8 fait l’objet d’une collaboration récemment initiée avec le
laboratoire du Professeur Salvador Martinez de l’Institut des Neurosciences à
l’université d’Alicante.
Publication : Creuzet S., Schuler B., Couly G. and Le Douarin N.M. (2004).
Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and fore-
brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 4843-4847.
2. Induction par contact d’une conversion phénotypique
dans le 2
e
arc branchial
A
`la partition entre le domaine Hox-positive et Hox-negative des cellules de
la crête neurale céphalique correspond une disparité dans la capacité à générer
des dérivés squelettiques. Ainsi, la différenciation ostéogénique de la crête neu-
rale issue du domaine Hox-négatif consiste en l’ossification endochondrale des
structures squelettiques cartilagineuses, mais aussi la formation d’os de mem-
brane — directement différenciés à partir de cellules mésenchymateuses, alors
que celle issue du domaine Hox-positif (2
e
arc) est strictement limitée à la
formation de dérivés osseux endochondraux.
Nous avons testé la différenciation des cellules issues du rhombomère 3 dans
le 2
e
arc en l’absence des cellules issues des rhombomères4à6quilecolonisent
normalement. La régénération qui s’opère à partir des cellules situées aux extré-
mités du territoire excisé — c’est-à-dire issues de r3 antérieurement, et r7 posté-
rieurement — conduit à la formation d’un squelette cartilagineux et osseux
endochondral hyoïdien normal. Si dans ce contexte, les cellules issues de r3 sont
directement placées au contact d’une source exogène de FGF8, leur différencia-

PROFESSEURS HONORAIRES 1203
tion conduit à la formation de pièces squelettiques ectopiques qui reproduisent
l’élément proximal du squelette du 1
er
arc branchial, le cartilage carré. De même,
l’implantation d’un fragment de crête Hox-négative associé à une bille de FGF8,
en remplacement de la crête excisée, mime les résultats obtenus à partir de r3
et étend la conversion phénotypique du squelette du 2
e
arc à la formation de
cartilage de Meckel. Dans ces deux situations expérimentales, les pièces cartilagi-
neuses ectopiques sont associées à la formation d’os de membrane.
Nos résultats montrent ainsi que FGF8 exerce au contact des cellules de la
crête neurale Hox-négative, avant même le début de leur migration, une influence
précoce qui accroît leur capacité à répondre aux signaux endodermiques et oriente
leur devenir squelettogéniques vers la formation de pièces squelettiques inédites
dans le 2
e
arc tant par leur identité — duplication de type mandibulaire —, que
par leur nature — différenciation d’os de membrane.
Publication en préparation : Creuzet S., Brito J.M., Couly G. and Le Doua-
rin N.M.
3. Spécification du squelette nasal par l’endoderme le plus rostral (foregut)
Nous avons étendu nos recherches concernant la spécification du squelette
ostéocartilagineux nasal par l’endoderme à sa partie toute antérieure. Nos résultats
préliminaires montrent i) que le squelette nasal est constitué d’une moitié droite
et d’une moitié gauche qui fusionnent précocement ; ii) qu’il existe comme pour
le cartilage de Meckel et le cartilage hyoïdien, une zone précise dans le plancher
rostral de l’endoderme, qui spécifie la crête neurale antérieure lors du développe-
ment de la capsule cartilagineuse.
Publication en préparation : Couly G., Benouaiche L., Vincent C. and Le
Douarin N.
4. Contribution de la crête neurale céphalique au développement de l’œil
et structures périoculaires
Chez les Vertébrés, l’ébauche des structures oculaires consiste précocement en
l’association de territoires ectodermiques qui dérivent de l’ectoderme du plancher
diencéphalique pour les rétines pigmentaire et sensorielle — vésicules optique —
et de l’ectoderme dorsal pour la lentille du cristallin — placode optique —. Les
contributions mésenchymateuses qu’elles soient d’origine « crête neurale » ou
mésodermique à l’ensemble des structures optiques constituent un problème
ancien. Nous avons cherché à réévaluer la participation de la crête neurale au
développement oculaire et périoculaire à travers l’utilisation du modèle des chi-
mères caille-poulet en pratiquant des greffes de remplacement des territoires
diencéphalique postérieur, mésencéphalique et métencéphalique.
Nous montrons que, précocement, les courants de migration des cellules de la
crête neurale issues des différents territoires convergent vers l’ébauche optique
qui bénéficie ainsi d’un mésectodermique massif.