Introduction - MeetOchondrie
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Mitochondrie et reproduction Julie Steffann INSTITUT IMAGINE Hopital Necker-Enfants Malades Paris Impossible d'afficher l'image liée. Le fichier a peut-être été déplacé, renommé ou supprimé. Vérifiez que la liaison pointe vers le fichier et l'emplacement corrects. LA CHAINE RESPIRATOIRE ADN nucléaire 70 polypeptides H+ H+ CI NADH NAD+ H+ CIII CII CIV O2 CV H 2O 13 polypeptides ADN mt ADP 22 tRNA et 2 rRNA H+ ATP mitochondrie ovocyte fécondé ADNmt 1 ADNmt 2 Embryon préimplantatoire Blastomères Cellules somatiques La ségrégation mitotique homoplasmie hétéroplasmie homoplasmie mitochondrie ovocyte fécondé blastocyste ADNmt 1 ADNmt 2 ≈200 000 ADNmt Blastomères ≈ 1000 ADNmt/cell. Ovocytogenèse cellules primordiales germinales ≈ 10 ADNmt/cell Théorie du « bottleneck » ovocytes matures ≈ 200 000 ADNmt (11 000 - 903 000) Nb de copies d’ADNmt au cours du développement embryonnaire chez la souris Nb de copies ADNmt x 103 Cree, Nat Genet 2008 Nb de copies ADNmt/cell 160 000 Wai, Biol Reprod 2010 40 000 20 000 5 Cattle embryos N°1 N°2 mtDNA copy number Chiaratti et al., 2010 D0 centrifugation In vitro culture (9 days) Removal of the mitochondria In vitro culture (9 days) J9 Induced mtDNA-depletion is spontaneously reversible during early embryogenesis Nb de copies d’ADNmt au cours du développement embryonnaire chez l’homme 90 000 à 1 550 000 copies d’ADNmt Steuerwald, 2000 Reynier, 2001 Barrit, 2002 May-Panloup, 2005 300 000 à 1 100 000 copies d’ADNmt Lin, 2004 7 QUESTION Ovocytes et embryons porteurs de mutations de l’ADNmt: modèles spontanés de déficit énergétique Mutation de l’ADNmt ? Mutation de l’ADNmt ? Arrêt de développement embryonnaire Impact sur le métabolisme mitochondrial Le diagnostic préimplantatoire Stimulation, ponction ovarienne et ICSI Biopsie embryonnaire J3 wild-type mutant Gigarel et al., MGM, 2005 Diagnostic PCR 12 à 24 heures Transfert à J5 de 1 à 3 embryons « sains » Myopathy Encephalopathy Lactic Acidosis Stroke-like episodes MT-TL1 m.3243A>G MELAS Neurogenic muscle weakness Ataxia Rétinitis Pigmentosa mtDNA MT-ND3 m.10197G>A LEIGH Myoclonic Epilepsie Ragged-Red Fibers disease MT-TK m.8344A>G MERRF MT-ATP6 m.9185T>G m.8993T>G NARP or LEIGH Données humaines ovocyte/embryon mutation m.8993T>G 1 ♀ hétéroplasmique Nb d ’embryons/ovocytes 7 3 embryons 7 ovocytes 6 5 4 3 2 Blok,1997 1 0 0 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 100 % de mutation Steffann, 2005 Données humaines ovocyte/embryon mutation MELAS 2 ♀ hétéroplasmiques 38 embryons 84 oocytes Nombre d’embryons Brown, 2001 9 60 8 7 50 6 40 5 4 3 2 1 0 0 1-10 11-20 21-30 31-40 X 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 % de mutation 30 20 10 0 Données humaines ovocyte/embryon mutation MERRF 1 ♀ hétéroplasmique Nb d ’embryons/ovocytes 7 14 embryons 5 ovocytes 6 5 4 3 2 1 0 0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100 Monnot et al., 2011; Steffann et al., 2015 % de mutation Conclusions La présence d’une mutation de l’ADNmt ne semble pas impacter le développement embryonnaire précoce Mutation de l’ADNmt NON ? Arrêt de développement embryonnaire Impact sur le métabolisme mitochondrial MATERIEL et METHODES FIV avec ICSI Ovocytes n=36 12 MELAS 5 MERRF 19 TEMOINS Lyse Embryons totaux (J3-J5) n=41 12 MELAS 12 MERRF 17 TEMOINS 10’ à 65° + 15 µl H 2O Mesure du taux d’hétéroplasmie mutant wt + mix PCRfluo + mix qPCR Mesure du nombre de copies d’ADNmt par qPCR mtDNA copies in human control oocytes and embryos mtDNA copy number 1,000,000 800,000 600,000 400,000 200,000 0 oocytes embryos No mtDNA réplication and no mtDNA degradation during early embryogenesis Or Degradation = Synthesis EMBRYOS : mtDNA copy number mtDNA copy 1,200,000 number p = 0.0003 1,000,000 p = 0.53 800,000 600,000 400,000 200,000 0 control m.3243A>G m.8344A>G mtDNA copy number in embryos carriers of - m.3243A>G MELAS - m.8344A>G MERRF Monnot et al., 2011, JMG 2 hypothesis: 1 / mutation-dependent activation of mtDNA replication? 2/ only MELAS embryos with high-mtDNA copy number survive? mtDNA copy number in m.3243A>G MELAS cells increases gradually with early human development Monnot et al., 2011, JMG Mutant load (%) A correlation between mtDNA copy numbers and mutant loads was observed in m.3243A>G MELAS embryos (R2=0.42, p<0.0013) Monnot et al., 2011, JMG CONCLUSIONS Les taux d’hétéroplasmie ovocytaires et embryonnaires sont superposables. Pas de sélection négative contre les embryons porteurs d’un taux élevé de mutation au cours du développement embryonnaire précoce. Défaut de l’ADNmt Défaut fertilisation Il existe une sélection négative contre les cellules germinales ayant un taux élevé de mutation MELAS (>80%). La maturation ovocytaire est probablement affectée par des taux élevé de mutation MELAS. Il n’y pas de sélection négative contre d’autres mutations (NARP et MERRF). Effet moins délétère sur la respiration cellulaire? Défaut de l’ADNmt Défaut maturation Mutations de l’ADNmt / infertilité Vers le développement de nouveaux « traitements »? Le transfert nucléaire ZYGOTE -20 000 gènes nucléaires -37 gènes mitochondriaux Pronucléi Craven L et al., 2010 Nature ü Interdit en France? Projet à soumettre à l’ABM Entre ovocyte M2 ü Risque à long terme? Transcriptomique sur embryons Fuseau meiotique Tachibana et al, Nature « corrigés » 2009 Transfert noyau de GP Wang et al., Cell., 2014 Mitochondries et amélioration des capacités ovocytaires? Transfert d’ooplasme à partir de cellules immatures ovocytaires pour augmenter les chances de succès de la fécondation in vitro « ovascience » AUGMENT 7 mai 2015 : naissance du premier bébé avec le traitement AUGMENT d’ovascience Dr Casper, Toronto, Mount Sinai Hospital Une collaboration Necker/Béclère Laboratoire de Génétique Moléculaire Institut IMAGINE • J. Steffann • S. Monnot • N. Gigarel • A. Munnich • A. Rotig • J-P. Bonnefont Biologie de la reproduction et Gynécologie Obstétrique • N. Frydman • L. Hesters • A. Benachi Hôpital AntoineBéclère Hôpital Necker-Enfants Malades Agence de biomédecine
