Stress Oxydant et Vieillissement (Isabelle Petropoulos)
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Stress Oxydant et Vieillissement Modifications oxydatives des protéines au cours du vieillissement GERONTOLOGIE FONDAMENTALE Isabelle Petropoulos Laboratoire de Biologie Cellulaire du Vieillissement UMR 7079 Plan du cours ¾ Implication du stress oxydant dans les processus de vieillissement (rôle des espèces réactives de l’oxygène ou ERO) ¾ Modifications par voie oxydative des protéines au cours du vieillissement ¾ Implication du protéasome et plus généralement des systèmes de maintenance (élimination et réparation des protéines oxydées) Qu’est ce que le vieillissement ? Le vieillissement se caractérise par une diminution de la capacité d’un organisme à faire face à son environnement Usure de l’organisme suite à l’accumulation d’altérations subies au cours du temps Théorie des radicaux libres Les changements associés au vieillissement sont dus à l’accumulation des dommages produits pas les ERO. ¾ Production des ERO ¾ Défenses antioxydantes ¾ Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondre au stress oxydant Relation entre la longévité et résistance au stress oxydant Igf-1 receptor Tyrosine-kinase receptor (Nature, 2003, Y. Le Bouc) 26 % increase in KO mouse Enhanced (paraquat, H202) Origine et réponses cellulaires aux ROS Sources endogènes • Mitochondries • Péroxysomes • Lipoxygénases • NADPH oxydase • Cytochrome P450 Défenses antioxydantes • Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx • Systèmes non-enzymatiques : Glutathion et vitamines (A, C et E) ONOO- ROS H2O2 Taux basal ROO. RO. Homéostasie • Croissance normale • métabolisme normal O2.- Sources exogènes • UV • Radiations ionisantes •Toxines • inflammation (cytokines) NO2 NO. Taux élevé OH. Altération des fonctions physiologiques • vieillissement • maladie • mort cellulaire Les principales cibles des Espèces Réactives de l’Oxygène dans la cellule Oxydation de l’ADN mutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl : 8 hydroxyguanine Coupures simple brin et double brin Délétions (ADN mitochondrial) Oxydation des lipides Oxydation des phospholipides des membranes Formation de peroxydes lipidiques - 4-hydroxynonenal (4-HNE) - malonaldéhyde (MDA) Oxydation des protéines Modifications oxydatives multiples (carbonyles) Qu’est-ce que l’oxydation des protéines? Modification covalente des protéines provoquées par des espèces réactives de l’oxygène ou par des dérivés induits par le stress oxydant Oxydation Protéine active Protéine oxydée non fonctionnelle Modification des protéines par voie oxydative Oxydation Tous les acides aminés Hydroxyls R-OH Carbonyls R-C-H, R-C-R’, Protéine native O O Disulfide cys-S-S-cys Methionine sulfoxide MeSO Lysine Arginine Conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA) Glycation Produits d’Amadori Glycoxydation AGEs N N N R H Pentosidine N H R’ R Histidine Cystéine Lysine NH CH2 COO - Carboxymethylysine Acides aminés les plus susceptibles à l’oxydation et leurs principaux produits de réaction Acide aminé Produits d’oxydation Cysteine Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiques Methionine Methionine sulfoxide, methionine sulfone Tyrosine Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPA Tryptophane Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynurenines Phenylalanine Hydroxyphenylalanines Valine, Leucine Hydroperoxides Histidine 2-Oxohistidine, asparagine, aspartate Glutamyl acide oxalique, acide pyruvique Proline Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehyde Threonine Acide 2-Amino-3-cetobutyrique Arginine semialdehyde glutamique, chloramines Lysine semialdehyde, chloramines, Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l’oxydation des protéines ¾ Athérosclérose (LDL) ¾ Arthrite rhumatoïde (IgG) ¾ Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébrale ¾ Emphysème pulmonaire (inhibiteur de l’α -1-proteinase, elastase) ¾ Maladies neurodegeneratives - Alzheimer - Parkinson ¾ Dystrophie musculaire ¾ Syndrome de détresse respiratoire ¾ Vieillissement ¾ Progeria/syndrome de Werner ¾ Alcoolisme ¾ Cataracte (α-crystallines) ¾ Cancer Modification et devenir des protéines cellulaires endommagées OXYDATION GLYCATION/ GLYCOXIDATION CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION LIPIDIQUES Aggregats PROTEINE ENDOMMAGEE PROTEINE NATIVE BIOSYNTHESE REPARATION Peptide methionine sulfoxide reductase system Acides Aminés DEGRADATION Proteasome PEPTIDES Immunodétection des groupements carbonyles sur les protéines ** * ** * O proteine oxydée DNP DNPH protéine DNP DNP anticorps Anti-DNP protéine DNP Western blot, ELISA, immunohistochimie En western blot : • Détection des protéines oxydées dans un mélange de protéines (susceptibilité différentielle des protéines à l’oxydation) • Sensibilité ≤1 pmol de groupement carbonyle Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502 (fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche) Modification et devenir des protéines cellulaires endommagées OXYDATION GLYCATION/ GLYCOXIDATION CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION LIPIDIQUES Aggregats PROTEINE ENDOMMAGEE PROTEINE NATIVE BIOSYNTHESE REPARATION Peptide methionine sulfoxide reductase system Acides Aminés DEGRADATION Proteasome PEPTIDES ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES LE PROTEASOME Rôles dans le vieillissement et les maladies liées à l’âge Le protéasome : machinerie d’élimination des protéines endommagées Complexe 19S α β ATP β α Chymotrypsine-similaire Hydrolase post-glutamique Trypsine-similaire Protéasome 20S Protéasome 26S Régulateur 19 S + ATP Protéasome 26 S Protéasome 20 S Dégradation des protéines marquées par les chaînes de polyubiquitines Dégradation des protéines modifiées par oxydation Rôles physiologiques importants dans: Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines) La présentation de l ’antigène L ’inflammation (activation de NFkB) L ’apoptose (p53) La réparation de l ’ADN (PARP) Micrographies de particules protéasomales Dégradation des protéines ubiquitinées par le protéasome 26 S Dégradation des protéines oxydées par le protéasome 20 S Protéasome et vieillissement de la peau Vieillissement intrinsèque chronologique et génétique Vieillissement extrinsèque Stress oxydant, photo-vieillissement Diminution du renouvellement cellulaire, sénescence Dégradation de la matrice extra-cellulaire Endommagement des macromolécules cellulaires ¾ Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l’épiderme ¾ Rôle du protéasome dans les processus de vieillissement Modifications des protéines cytosoliques durant le vieillissement de l’épiderme A Oxyblot C Western blot anti-AGE MWM kDa 120 MWM kDa 84 97.4 68 120 84 47.8 Western blot anti-HNE D ng eq glycated-BSA/μg of proteins B 47.8 ELISA anti-AGE 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 age of donor (years) 80 Activités protéolytiques du protéasome Activité Hydrolase post - glutamique LLE-NA (Coupure après acide aminé acide) Activité Chymotrypsine-similaire LLVY-AMC (Coupure après acide aminé aromatique) LSTR-AMC (Coupure après acide aminé basique) Activité Trypsine -similaire 20S Excitation 350 nm Emission 440 nm -βNA -AMC -AMC Excitation 333 nm Emission 410 nm Chymotrypsin-like pmol AMC/min. per mg A 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 10 B MWM kDa 33.2 20 20 30 40 50 60 70 age du donneur (années) 80 Peptidylglutamyl-peptide hydrolase pmol NA/min. per mg Effet de l’âge sur les activités du protéasome dans les cellules épidermiques GEL BIDIMENSIONNEL DE PROTEASOME PURIFIE A PARTIR DE L’ EPIDERME DE DONNEUR DE 17 ANS pH=3 b SDS-PAGE 30.6 kDa pH=10 21kDa Comparaison avec des donneurs plus âgés : Diminution de 3 sous-unités α : α3, α4 et α5 Augmentation d ’1 sous-unité β : β4 Expression des sous-unités du protéasome 20 S β7 β5 β2 100 100 100 80 80 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 MRC5 8 α3 0 MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C6 E E) 28 50 80 C1 C2 C3 C6 MRC5 8 α6 100 100 100 80 80 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C6 28 50 80 C1 C2 C3 C6 MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C6 18 22 26 30 34 Nombre de passages Effet de l’âge sur les activités peptidasiques du protéasome espèce tissu âge effet sur l’activité 21-30 ans vs 65-85 ans Chymotrypsine Cristallin clair vs cataracte Chymotrypsine Foie 3-8 mois vs 24-34 mois Coeur Poumon Cerveau 3 mois vs 28 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH muscle 4 mois vs 34 mois Humain Lymphocytes T Rat Chymotrypsine Chymotrypsine Trypsine PGPH Effet de l’âge sur l’expression du protéasome Analyse de transcriptome espèce tissu âge Humain Fibroblastes 8 ans vs 92 ans souris Muscle squelettique 5 mois vs 30 mois Effet sur l’expression α2, α7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) β2, β7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) Effet de la restriction calorique PROTEASOME ET VIEILLISSEMENT CONCLUSIONS Le contenu en groupements carbonyles des protéines augmentent avec l ’âge dans les kératinocytes et les fibroblastes. Ces groupements peuvent être générés : - soit par oxydation directe d ’acides aminés - soit par conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique - soit par glycation Deux des activités (chymotrypsine et peptidyl-glutamylpeptide hydrolase) du protéasome diminuent avec l ’âge, ce qui peut s ’expliquer, au moins en partie, par une diminution de la quantité de protéasome cellulaire. Une diminution de l ’activité, de la quantité du protéasome est également observée au cours de la sénescence réplicative (kératinocytes et fibroblastes en culture). Une diminution de l ’expression de certains gènes codant des sous-unités catalytiques et régulatrices a été observée dans les fibroblastes âgés. Les centenaires semblent avoir la capacité de «préserver» leur protéasome Rôle de l’oxydation des LDL dans l’athérogenèse Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l’ athérogenèse et sont impliquées dans les événements précoces de formation de la plaque : - Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T) - Formation de cellules spumeuses - Migration et prolifération des cellules musculaires lisses - Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose) - Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome Oxydation des HDL et transport reverse du cholestérol Bile HDL Mature A-I F C Foie CE CE LCAT Macrophage HDL Naissant A-I CL FC CL CETP 9 HDL impliqués dans le transport réverse du cholestérol des macrophages spumeux vers le foie. 9 Dysfonctionnement des HDL mis en cause dans les maladies cardiovasculaires 9 Ce dysfonctionnement serait en partie du aux attaques oxydatives (myélopéroxydase élevée dans les macrophages des tissus athérosclérotiques). 9 Rôle de l’oxydation de l’Apo A1 sur l’activité de la LCAT (lecithine:cholestérol acyltranférase) Oxydation de l’Apo A1 et activité LCAT Exemple de l’α1-antitrypsine 9 Synthétisée dans les hépatocytes. 9 Présente dans le parenchyme pulmonaire. Protection de la matrice alvéolaire contre l’activité de l’élastase (sérine protéase). 9 Contient 9 résidus méthionines dont 2 (Met 351 et Met 358) seulement sont oxydables en présence d’oxydant. Une déficience de l’activité de cette enzyme est mise en cause dans l’emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonaire caractérisée par une destruction des bronchioles) Inactivation de l’ α1-antitrypsine par oxydation des résidus méthionines Cigarette (H202, phénol) cigarette Régulation de l’activité élastase Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d’Alzheimer Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence et mort neuronale
