Etude des réseaux de pollinisation par génomique environnementale (GENOPOLI) Mots clés : interactions plantes/pollinisateurs, réseaux de pollinisation, barres-codes à ADN, séquençage haut débit, métabarcoding. Présentation du projet Résumé Les insectes pollinisateurs subissent depuis plusieurs années un fort déclin avec des conséquences potentielles importantes sur les productions agricoles, le fonctionnement des écosystèmes et la biodiversité. Si ses causes sont connues, ses conséquences le sont beaucoup moins, principalement en raison de la très grande complexité des réseaux d’interactions plantes-pollinisateurs et de l’existence de verrous méthodologiques. Le doctorant devra utiliser les nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS) et de génomique environnementale (métabarcoding) pour étudier les réseaux de pollinisation dans des milieux agricoles ou naturels. Les méthodes conventionnelles en vigueur ne permettent pas de connaitre la nature (négative, neutre, positive ; directe vs indirecte) et la force des interactions entre tous les partenaires du réseau et cantonnent les études à un nombre restreint de systèmes simplifiés. La possibilité de quantifier par métabarcoding les interactions dans les réseaux, représenterait un progrès méthodologique inédit. Ce projet est porté par 2 laboratoires de l’Université Fédérale Toulouse Midi-Pyrénées l’un appartenant à l’UT3 Paul Sabatier (Laboratoire Evolution et Diversité Biologique-EDB- UMR 5174), l’autre à l’UT2 Jean Jaurès (Laboratoire Géographie de l’Environnement-GEODE-) rattachés à 3 Labex (EDB : Labex TULIP, Labex CEBA ; GEODE : Labex DRIIHM). La thèse sera co-dirigée par 2 représentants de ces unités (A. Pornon, EDB ; D. Galop, GEODE) Ce projet s’appui sur un important réseau de collaborations existantes : CNBPMP (G. Largier), OPIE (D. Pelletier) LECA-Grenoble (P. Taberlet), INRA-Toulouse (J.P. Sarthou), MNHN (C. Daugeron), GENOPOLE-MIDI PYRENEES (O. BOUCHEZ; J. MARIETTE), F. Jabot (LISC –IRSTEA). Etat de l’art et motivations La diversité, l’abondance et l’amplitude géographique de beaucoup d’espèces d’insectes pollinisateurs [1], particulièrement des abeilles sauvages (incluant les bourdons), ont diminué au cours des dernières décennies. Par exemple, un quart des espèces de bourdons recensées en Europe est menacé d’extinction [2]. Les conséquences sur les productions agricoles, sur le fonctionnement des écosystèmes et la biodiversité pourraient être considérables. En effet, la survie ou l’évolution de plus de 80 % des espèces végétales dans le monde, et la production agricoles de 84 % des espèces cultivées en Europe dépendent directement de la pollinisation par les insectes. Ce déclin devrait altérer la quantité mais également la qualité de l’alimentation avec des effets envisagés désastreux sur la santé humaine [3]. Même si certaines espèces végétales entomogames sont capables de s’auto-polliniser toutes ont besoin, à l’échelle des populations, des insectes pour maintenir leur diversité génétique, garante de leurs potentialités d’évolution dans un environnement changeant. D’ores et déjà certaines études ont révélé un déclin parallèle des pollinisateurs et des plantes entomogames [4,5]. Si les causes de ce déclin sont, dans les grandes lignes connues, ses conséquences dans la structure et le fonctionnement des réseaux de pollinisation le sont beaucoup moins, principalement en raison de leur très grande complexité et de l’existence de verrous méthodologiques. La complexité d’un réseau de pollinisation réside dans le très grand nombre de partenaires interagissant et dans la multitude de liens interactifs réels ou potentiels qui en découlent. De plus, ces liens peuvent recouvrir différences situations : des interactions positives (mutualisme plantes/pollinisateurs) ou négatives (par exemple dépôt de pollen hétérospécifique sur les stigmates), des interactions directes (entre une plante et un visiteur) ou indirectes (quand les plantes de la communauté déterminent ensemble la composition et l’abondance des assemblages de pollinisateurs). L’intensité des interactions varie également en fonction du degré de spécialisation des partenaires. Ces différents paramètres changent en fonction de nombreuses caractéristiques des assemblages de plantes et de pollinisateurs. Cette incroyable complexité explique que la très grande majorité des études se soit focalisée sur des systèmes de pollinisation très simplifiés incluant un nombre restreint d’espèces et à une échelle spatio-temporelle réduite [6]. Les méthodes communément utilisées pour caractériser les réseaux, basées sur les taux de visites, comportent de très sérieuses limites [7] : (i) elles assimilent toute visite à une interaction positive alors que, lors d’une visite, un insecte peut ne pas déposer de pollen ou déposer du pollen hétérospécifique et ainsi, interagir négativement avec la plante [1] ; (ii) beaucoup d’espèces d’insectes sont difficilement voire non identifiables in situ, induisant un faible niveau de résolution du réseau ; (iii) les pollinisateurs de certaines plantes sont si rares qu’ils ne sont que très rarement observés en milieu naturel ; (iv) la constitution de réseaux de visites nécessite de très longs temps d’observation excluant toute possibilité de mener des études à large échelle spatio-temporelle ; (v) finalement, ces réseaux sont incomplets car ils n’incluent pas les interactions que les insectes ont réalisées en dehors de l’aire d’observation lors de leur déplacement dans le paysage. Des études récentes comparant des réseaux basés sur l’identification des pollens sur le corps des insectes avec des réseaux de visites, montrent que ces derniers donnent une image biaisée de la réalité [8]. Ils montrent également que l’étude des charges polliniques des insectes et des stigmates permettrait de bien mieux décrire les réseaux d’interactions, laquelle se heurte à de nouvelles difficultés : l’identification visuelle des pollens très longue et très difficile voire impossible pour bon nombre d’espèces et une expertise souvent absente dans les laboratoires. L’imprécision des méthodes conventionnelles en vigueur et leur coût en temps excluent toute possibilité d’étudier les réseaux de pollinisation à grandes échelles spatiales et à un niveau de résolution élevé. Ainsi, l’un des défis majeurs à relever est de développer de nouvelles méthodologies pour : (1) comprendre par quels processus les changements globaux peuvent déstabiliser les réseaux de pollinisateurs, et (2) évaluer les risques de mise en place de spirales d’extinction et les risques de perte de services écologiques [1]. Objectifs L’objectif de ce projet est d’utiliser les nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS, technologie Mi-Seq Illumina) et de génomique environnementale (métabarcoding) pour étudier les réseaux de pollinisation dans des milieux agricoles ou naturels. Le métabarcoding consiste à identifier les espèces dans un échantillon environnemental contenant un mélange d’ADN de nombreux organismes à partir de courts fragments d’ADN (codes-barres à ADN) spécifiques à chaque espèce [9]. Les codes-barres à ADN permettront d’identifier à l’espèce les pollens présents dans la charge pollinique des insectes (CPI) et celles des stigmates (CPS). L’étude des CPI vise à identifier quelles espèces végétales sont visitée et quels insectes assurent le transfert de leur pollen tandis que l’étude de la CPS vise à connaitre la composition du pollen déposé sur les stigmates. La quantification de la multitude de séquences (140 millions de lecture de séquence obtenus dans l’étude POLLIBAR) générées par NGS vise à obtenir une estimation de la quantité de pollens dans les CPI et les CPS. Position du projet dans le contexte local/national/international Des études précédentes ont montré que l’extraction et le génotypage d’un seul grain de pollen est possible, et que les grains de pollens collectés par les insectes peuvent être identifiés [10] permettant, par exemple, d’évaluer l’efficacité d’une espèce de pollinisateur pour une espèce de plante cible [11]. Aspect novateur/ Actuellement, aucune méthode ne permet de décrire en détail et à large échelle les interactions agissant au sein de communautés complètes de pollinisateurs et de plantes. L’originalité et le caractère novateur de ce projet résident dans les faits que jusqu’à ce jour, aucune équipe au monde n’a utilisé les NGS et la génomique environnementale pour : (1) étudier des réseaux de pollinisation incluant les assemblages entiers de pollinisateurs et de plantes ; (2) décrire en détail (quantité et composition) les charges polliniques des pollinisateurs et des stigmates et en inférer les multiples liens biotiques entre l’ensemble des plantes et des pollinisateurs (interactions directes) et les différentes espèces de plantes (interactions indirectes) au sein de la communauté ; (3) reconstituer et modéliser des réseaux de pollinisation à une très haute résolution (infra-spécifique) incluant force, signe, symétrie des interactions. Les acquis/ Une étude préliminaire (POLLIBAR, Labex TULIP-Toulouse : ANR-10-LABX41; ERESA, APEGE 2013-2014 : DJ/ST/IP/2013/D-112) menée par EDB sur une communauté végétale subalpine pyrénéenne a montré que : (i) Pour une même durée et une même surface d’exploration les NGS permettent de détecter 2.5 fois plus d’espèces de plantes visitées par les insectes que la seule observation des visites, une proportion importante poussant en dehors de la zone explorée. Ainsi l’approche métagénomique élargit considérablement la fenêtre d’observation des interactions plantes-pollinisateurs. (ii) Nous avons développé des codes-barres à ADN pour près de 150 espèces de plantes et de pollinisateurs mais l’utilisation en routine et à grande échelle de cette méthode pour l’étude de nombreux réseaux nécessite d’avoir des codes-barres à ADN pour toutes les espèces de plantes et de pollinisateurs des communautés ciblées. (iii) Il existe, tous visiteurs confondus, une relation positive significative entre le nombre de visites reçues par une espèce végétale et le nombre de séquences Mi-Seq (figure 1) de cette espèce obtenues à partir des charges polliniques des insectes. Globalement, nos résultats sont cohérents avec les attendus basés sur la biologie des insectes pollinisateurs : en moyenne nous trouvons plus de séquences sur les insectes connus pour être de bons convoyeurs de pollen (abeilles domestiques et sauvages) que sur d’autres insectes (diptères, coléoptère). Néanmoins, la quantification des interactions nécessite à l’échelle spécifique une bonne calibration de la relation ‘quantité de pollen/quantité d’ADN et nombre de séquences Mi-Seq’ pour les espèces cibles. Figure 1 : Relation entre le nombre de séquences trnL et le nombre de visites reçues par les espèces de plantes. Liens avec d’autres projets structurants Ce projet s’intègre dans 2 des 5 thèmes majeurs de recherche (MTR) du Labex TULIP (http://www.labex-tulip.fr/) "Interactions entre populations et communautés" (MTR4) et "Vers une théorie unifiée des interactions" (MTR5). Ces thèmes visent à englober toute la complexité des interactions entre organismes, tout en tenant compte des facteurs abiotiques à toutes les échelles des systèmes biologiques et à prédire les réponses des systèmes biologiques aux perturbations environnementales. Le manque de connaissances dans ces thèmes a été mis en exergue lors de l’élaboration du Labex et l’un des objectifs majeurs de ce dernier est de soutenir l’émergence de nouvelles connaissances et méthodologies et de nouveaux concepts afférents à ces domaines. Résultats attendus & perspectives A la fin de ce projet, nous souhaitons mettre à la disposition de la communauté scientifique une nouvelle méthodologie standardisée basée sur les NGS pour étudier et dans une seconde étape modéliser les réseaux de pollinisation. Les thématiques pouvant bénéficier d’une telle méthodologie sont par exemple : l’étude de l’impact des milieux naturels ou semi-naturels (bandes enherbées, milieux forestiers, prairies naturelles, espèces adventives) sur la pollinisation des cultures ; l’étude des interactions entre les pollinisateurs sauvages et les pollinisateurs domestiques, le rôle de chaque espèce ou groupe de pollinisateurs dans la fonction collective de pollinisation étant peu connue ; la contribution des espèces ou des groupes fonctionnels à la stabilité ou la résilience des réseaux de pollinisation face aux changements globaux. Dans le contexte de changements globaux, il devient urgent de comprendre quels sont les principaux déterminants du fonctionnement des réseaux de pollinisation. Ceci nécessite de multiplier les études à larges échelles spatiales et temporelles, le long de gradients écologiques contrastés et dans des milieux naturels ou anthropisés. Finalement, les insectes étant d’excellents explorateurs de la végétation et de très efficaces capteurs de pollen, l’étude de leur charge pollinique peut contribuer à évaluer la diversité locale et ses changements dans l’espace et le temps. Références citées [1] Schweiger O et al. 2010. Biological Reviews 85: 777-795 [2] Michez D & Rasmont P. 2015. La recherche 540, 55-58. [3] Smith MR et al. 2015. The Lancet doi : 10.1016/S0140-6736(15)61085-6 [4] Biesmeijer JC et al. 2006. Science 313: 351-354 [5] Goulson D, Lye GC, Darvill B. 2008. Annual Review of Entomology 53: 191-208. [6] Ings TC et al. 2009. Journal of Animal Ecology 78: 253–269 [7] Wilcock C & Neiland R. 2002. TRENDS in Plant Science 7: 270-277. [8] Popic TJ et al. 2013. Austral Ecology 38, 76–86. [9] Taberlet P. et al. 2012. Molecular Ecology 21 : 1789-1793. [10] Galimberti et al. 2014. PLoS ONE 9 (10): e109363. doi:10.1371/journal.pone.0109363 [11] Matsuki et al. 2007. Molecular Ecology 7 : 194–198 Présentation de la thèse Déroulement et programme des travaux de thèse Les travaux de thèse consisteront à : (1) 1e Année : Développer de nouveaux codes-barres à ADN pour les espèces de plantes (tnrL intron, ITS) et de pollinisateurs non référencés (COI, 16S) dans les bases de données (Genbank). Dorénavant, le laboratoire EDB dispose d’une bonne expérience dans ce domaine puisque ce travail a déjà été réalisé pour environ 150 espèces de plantes et d’insectes. De plus nous avons montré que l’identification des insectes par codes-barres à ADN pouvait être réalisée directement à partir de la solution utilisée pour décrocher le pollen de leur corps. A terme, nous souhaitons développer des codes-barres à ADN pour la majorité des plantes entomogames des Pyrénées. Cependant, dans le cadre de cette thèse nous ciblerons 17 communautés végétales Pyrénéennes que nous étudions depuis plusieurs années (Laboratoire EDB). (2) Fin 1e Année- 2e Année : Calibrer la relation ‘quantité de pollen/quantité d’ADN et nombre de séquences Mi-Seq’ pour des espèces ou des groupes d’espèces cibles. En effet, nos résultats préliminaires montrent que le rendement de l’extraction de l’ADN des pollens varie d’une espèce à l’autre. De plus, toutes les espèces n’ont pas le même nombre de copies des fragments-codes-barres. En conséquence, pour une même quantité de pollen, il peut exister une variabilité interspécifique dans le nombre séquences obtenues ce qui peut conduire à une vision biaisée des interactions. Cette calibration nécessite d’identifier et de quantifier très précisément les grains de pollen des différentes espèces (Laboratoire GEODE) et de quantifier l’ADN à chaque étape (extraction, PCR) afin de faire le lien avec le très grand nombre de séquences obtenues (données traitées par bioinfo.genotoul.fr cluster dans notre étude préliminaire). (3) Début 3e année : Le métabarcoding a révélé la présence de séquences de plantes anémogames sur les insectes ce qui suggère, soit que certains insectes collectent du pollen également sur ces plantes, ce qui a été rarement décrit, soit que du pollen ou d’autres particules de plantes se déposent passivement sur le corps des insectes. Le suivi d’insectes issus d’élevage dans une matrice végétale naturelle (cages expérimentales) permettra de comparer les réseaux réalisés à partir des taux de visites à ceux issus des NGS et d’évaluer dans quelle mesure des espèces de la matrice (poacées par ex.) autres que les espèces pollinisées laissent des traces d’ADN sur les insectes. Compétences et complémentarité des équipes impliquées Nom, prénom Statut Compétences Pornon, André Co-directeur de thèse Andalo, Christophe Burrus, Monique Escaravage, Nathalie Holota, Hélène Pelozuelo, Amaïa Zinger, Lucie MCF-HC Ecologie des communautés, Biologie de la pollinisation MCF MCF-HC MCF IE IR Analyse des données Biologie moléculaire Biologie de la pollinisation/biologie moléculaire Biologie moléculaire Biologie moléculaire/ Métabarcoding Métabarcoding/bioinformatique Galop, Didier Co-directeur de thèse Mazier, Florence De Munnik, Nicolas Ollivier, Guirec DR Palynologie, Paleoécologie et histoire de l’environnement Laboratoire EDB Laboratoire GEODE Autres partenaires Jabot, Frank Taberlet, Pierre Marriette, Jérôme Bouchez, Olivier Largier, Gérard Pelletier, Dominique Sarthou, Jean-Pierre Daugeron, Christophe CR1 IE1 TCN Organismes LISC -IRSTEA LECA, UMR 5553 GénoToul GénoToul CNBPMP OPIE INRA MNHN Palynologie/Modélisation spatiale/Botanique Botanique/systématique/palynologie Palynologie Modélisation réseaux interactions Métabarcoding Analyse données séquençage, Plateforme Bioinformatique Séquençage haut débit, Plateforme Génomique Identification des espèces de plantes Identification des espèces d’insectes Identification des espèces d’insectes Identification des espèces d’insectes Perspectives professionnelles pour le doctorant La génomique environnementale est actuellement en plein développement et le nombre d’applications potentielles va s’accroître à mesure que les méthodes s’affinent, les coûts de séquençage diminuent et les capacités de stockage et d’analyse des données augmentent. Elle est de plus en plus employée pour réaliser des inventaires d’espèces ou de groupes taxonomiques plus ou moins cryptiques (macrofaune et microorganismes du sol, amphibiens, poissons, arthropodes), découvrir de nouveaux taxons ou étudier la diversité contemporaine ou la paléo-diversité. Elle permet d’étudier les régimes alimentaires de différentes espèces animales mais également de vérifier l’origine des produits alimentaires (origine florale du miel par exemple). Dans un proche avenir, la génomique environnementale sera l’un des fondements des expertises environnementales de l’ingénierie écologique, de la modélisation prédictive ou du suivi de la qualité des écosystèmes et agrosystèmes. Un premier laboratoire a récemment été créé en région Rhône-Alpes (SPYGEN) et à n’en pas douter bien d’autres verront le jour prochainement. Dans ce contexte, se prévaloir de solides compétences en génomique environnementale sera un atout considérable pour intégrer les laboratoires publics ou privés. Actions de formation, d’insertion et de mobilité internationale pour le doctorant Le doctorant sera encouragé à postuler sur les contrats DCCE (Doctorant Contractuel Chargé d’Enseignement) et dans ce cadre pourra se former à la pédagogie et à l’enseignement. Il lui sera demandé de présenter ses travaux dans des colloques nationaux ou internationaux portant sur la biologie de la pollinisation et la génomique environnementale. Nous soutiendrons et si possible (et nécessaire) compléterons toute demande de bourse de mobilité de sa part. Budget du projet hors contrat doctoral Sollicités à la Région Midi-Pyrénées : Sollicité à Université Fédérale TMP : Sollicité OHM haut-Vicdessos : Autofinancement EDB : Total budget fonctionnement : Détail des dépenses de fonctionnement Développement code-barres plantes (ADNcp : trnL ; ADNnr : ITS1 ) Développement code-barres pollinisateurs (ADNmt : COI ; ADNnr : 16S) Séquençage haut débit Extraction ADN, PCR Séquençage haut débit (MiSeq) Identification et quantification pollen Identification plantes et insectes Missions Frais de publication Total fonctionnement 17 360 € 7 500 € 8 000 € 2 500 € 35 360 € € (TTC) 6 000 3 200 4 000 11 160 5 000 2 000 2 000 2 000 35 360