Etude des réseaux de pollinisation par génomique environnementale

Etude des réseaux de pollinisation par génomique environnementale
(GENOPOLI)
Mots clés : interactions plantes/pollinisateurs, réseaux de pollinisation, barres-codes à ADN,
séquençage haut débit, métabarcoding.
Présentation du projet
Résumé
Les insectes pollinisateurs subissent depuis plusieurs années un fort déclin avec des conséquences
potentielles importantes sur les productions agricoles, le fonctionnement des écosystèmes et la
biodiversité. Si ses causes sont connues, ses conséquences le sont beaucoup moins, principalement
en raison de la très grande complexité des réseaux d’interactions plantes-pollinisateurs et de
l’existence de verrous méthodologiques.
Le doctorant devra utiliser les nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS) et de
génomique environnementale (métabarcoding) pour étudier les réseaux de pollinisation dans des
milieux agricoles ou naturels. Les méthodes conventionnelles en vigueur ne permettent pas de
connaitre la nature (négative, neutre, positive ; directe vs indirecte) et la force des interactions entre
tous les partenaires du réseau et cantonnent les études à un nombre restreint de systèmes
simplifiés. La possibilité de quantifier par métabarcoding les interactions dans les réseaux,
représenterait un progrès méthodologique inédit.
Ce projet est porté par 2 laboratoires de l’Université Fédérale Toulouse Midi-Pyrénées l’un
appartenant à l’UT3 Paul Sabatier (Laboratoire Evolution et Diversité Biologique-EDB- UMR 5174),
l’autre à l’UT2 Jean Jaurès (Laboratoire Géographie de l’Environnement-GEODE-) rattachés à 3 Labex
(EDB : Labex TULIP, Labex CEBA ; GEODE : Labex DRIIHM). La thèse sera co-dirigée par 2
représentants de ces unités (A. Pornon, EDB ; D. Galop, GEODE)
Ce projet s’appui sur un important réseau de collaborations existantes : CNBPMP (G. Largier), OPIE
(D. Pelletier) LECA-Grenoble (P. Taberlet), INRA-Toulouse (J.P. Sarthou), MNHN (C. Daugeron),
GENOPOLE-MIDI PYRENEES (O. BOUCHEZ; J. MARIETTE), F. Jabot (LISC –IRSTEA).
Etat de l’art et motivations
La diversité, l’abondance et l’amplitude géographique de beaucoup d’espèces d’insectes
pollinisateurs [1], particulièrement des abeilles sauvages (incluant les bourdons), ont diminué au
cours des dernières décennies. Par exemple, un quart des espèces de bourdons recensées en Europe
est menacé d’extinction [2].
Les conséquences sur les productions agricoles, sur le fonctionnement des écosystèmes et la
biodiversité pourraient être considérables. En effet, la survie ou l’évolution de plus de 80 % des
espèces végétales dans le monde, et la production agricoles de 84 % des espèces cultivées en Europe
dépendent directement de la pollinisation par les insectes. Ce déclin devrait altérer la quantité mais
également la qualité de l’alimentation avec des effets envisagés désastreux sur la santé humaine [3].
Même si certaines espèces végétales entomogames sont capables de s’auto-polliniser toutes ont
besoin, à l’échelle des populations, des insectes pour maintenir leur diversité génétique, garante de
leurs potentialités d’évolution dans un environnement changeant. D’ores et déjà certaines études
ont révélé un déclin parallèle des pollinisateurs et des plantes entomogames [4,5].

Si les causes de ce déclin sont, dans les grandes lignes connues, ses conséquences dans la structure
et le fonctionnement des réseaux de pollinisation le sont beaucoup moins, principalement en raison
de leur très grande complexité et de l’existence de verrous méthodologiques.
La complexité d’un réseau de pollinisation réside dans le très grand nombre de partenaires
interagissant et dans la multitude de liens interactifs réels ou potentiels qui en découlent. De plus,
ces liens peuvent recouvrir différences situations : des interactions positives (mutualisme
plantes/pollinisateurs) ou négatives (par exemple dépôt de pollen hétérospécifique sur les
stigmates), des interactions directes (entre une plante et un visiteur) ou indirectes (quand les plantes
de la communauté déterminent ensemble la composition et l’abondance des assemblages de
pollinisateurs). L’intensité des interactions varie également en fonction du degré de spécialisation
des partenaires. Ces différents paramètres changent en fonction de nombreuses caractéristiques des
assemblages de plantes et de pollinisateurs.
Cette incroyable complexité explique que la très grande majorité des études se soit focalisée sur des
systèmes de pollinisation très simplifiés incluant un nombre restreint d’espèces et à une échelle
spatio-temporelle réduite [6].
Les méthodes communément utilisées pour caractériser les réseaux, basées sur les taux de visites,
comportent de très sérieuses limites [7] : (i) elles assimilent toute visite à une interaction positive
alors que, lors d’une visite, un insecte peut ne pas déposer de pollen ou déposer du pollen
hétérospécifique et ainsi, interagir négativement avec la plante [1] ; (ii) beaucoup d’espèces
d’insectes sont difficilement voire non identifiables in situ, induisant un faible niveau de résolution du
réseau ; (iii) les pollinisateurs de certaines plantes sont si rares qu’ils ne sont que très rarement
observés en milieu naturel ; (iv) la constitution de réseaux de visites nécessite de très longs temps
d’observation excluant toute possibilité de mener des études à large échelle spatio-temporelle ; (v)
finalement, ces réseaux sont incomplets car ils n’incluent pas les interactions que les insectes ont
réalisées en dehors de l’aire d’observation lors de leur déplacement dans le paysage.
Des études récentes comparant des réseaux basés sur l’identification des pollens sur le corps des
insectes avec des réseaux de visites, montrent que ces derniers donnent une image biaisée de la
réalité [8]. Ils montrent également que l’étude des charges polliniques des insectes et des stigmates
permettrait de bien mieux décrire les réseaux d’interactions, laquelle se heurte à de nouvelles
difficultés : l’identification visuelle des pollens très longue et très difficile voire impossible pour bon
nombre d’espèces et une expertise souvent absente dans les laboratoires.
L’imprécision des méthodes conventionnelles en vigueur et leur coût en temps excluent toute
possibilité d’étudier les réseaux de pollinisation à grandes échelles spatiales et à un niveau de
résolution élevé.
Ainsi, l’un des défis majeurs à relever est de développer de nouvelles méthodologies pour : (1)
comprendre par quels processus les changements globaux peuvent déstabiliser les réseaux de
pollinisateurs, et (2) évaluer les risques de mise en place de spirales d’extinction et les risques de perte
de services écologiques [1].
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’utiliser les nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS,
technologie Mi-Seq Illumina) et de génomique environnementale (métabarcoding) pour étudier les
réseaux de pollinisation dans des milieux agricoles ou naturels. Le métabarcoding consiste à identifier
les espèces dans un échantillon environnemental contenant un mélange d’ADN de nombreux

organismes à partir de courts fragments d’ADN (codes-barres à ADN) spécifiques à chaque espèce
[9].
Les codes-barres à ADN permettront d’identifier à l’espèce les pollens présents dans la charge
pollinique des insectes (CPI) et celles des stigmates (CPS). L’étude des CPI vise à identifier quelles
espèces végétales sont visitée et quels insectes assurent le transfert de leur pollen tandis que l’étude
de la CPS vise à connaitre la composition du pollen déposé sur les stigmates.
La quantification de la multitude de séquences (140 millions de lecture de séquence obtenus dans
l’étude POLLIBAR) générées par NGS vise à obtenir une estimation de la quantité de pollens dans les
CPI et les CPS.
Position du projet dans le contexte local/national/international
Des études précédentes ont montré que l’extraction et le génotypage d’un seul grain de pollen est
possible, et que les grains de pollens collectés par les insectes peuvent être identifiés [10]
permettant, par exemple, d’évaluer l’efficacité d’une espèce de pollinisateur pour une espèce de
plante cible [11].
Aspect novateur/ Actuellement, aucune méthode ne permet de décrire en détail et à large échelle
les interactions agissant au sein de communautés complètes de pollinisateurs et de plantes.
L’originalité et le caractère novateur de ce projet résident dans les faits que jusqu’à ce jour, aucune
équipe au monde n’a utilisé les NGS et la génomique environnementale pour : (1) étudier des
réseaux de pollinisation incluant les assemblages entiers de pollinisateurs et de plantes ; (2) décrire
en détail (quantité et composition) les charges polliniques des pollinisateurs et des stigmates et en
inférer les multiples liens biotiques entre l’ensemble des plantes et des pollinisateurs (interactions
directes) et les différentes espèces de plantes (interactions indirectes) au sein de la communauté ; (3)
reconstituer et modéliser des réseaux de pollinisation à une très haute résolution (infra-spécifique)
incluant force, signe, symétrie des interactions.
Les acquis/ Une étude préliminaire (POLLIBAR, Labex TULIP-Toulouse : ANR-10-LABX41; ERESA, APEGE
2013-2014 : DJ/ST/IP/2013/D-112) menée par EDB sur une communauté végétale subalpine
pyrénéenne a montré que :
(i) Pour une même durée et une même surface d’exploration les NGS permettent de détecter
2.5 fois plus d’espèces de plantes visitées par les insectes que la seule observation des visites, une
proportion importante poussant en dehors de la zone explorée. Ainsi l’approche métagénomique
élargit considérablement la fenêtre d’observation des interactions plantes-pollinisateurs.
(ii) Nous avons développé des codes-barres à ADN pour près de 150 espèces de plantes et de
pollinisateurs mais l’utilisation en routine et à grande échelle de cette méthode pour l’étude de
nombreux réseaux nécessite d’avoir des codes-barres à ADN pour toutes les espèces de plantes et de
pollinisateurs des communautés ciblées.
(iii) Il existe, tous visiteurs confondus, une relation positive significative entre le nombre de
visites reçues par une espèce végétale et le nombre de séquences Mi-Seq (figure 1) de cette espèce
obtenues à partir des charges polliniques des insectes. Globalement, nos résultats sont cohérents
avec les attendus basés sur la biologie des insectes pollinisateurs : en moyenne nous trouvons plus
de séquences sur les insectes connus pour être de bons convoyeurs de pollen (abeilles domestiques
et sauvages) que sur d’autres insectes (diptères, coléoptère). Néanmoins, la quantification des
interactions nécessite à l’échelle spécifique une bonne calibration de la relation ‘quantité de
pollen/quantité d’ADN et nombre de séquences Mi-Seq’ pour les espèces cibles.

Figure 1 : Relation entre le nombre de séquences trnL et le nombre de visites reçues par les
espèces de plantes.
Liens avec d’autres projets structurants
Ce projet s’intègre dans 2 des 5 thèmes majeurs de recherche (MTR) du Labex TULIP
(http://www.labex-tulip.fr/) "Interactions entre populations et communautés" (MTR4) et "Vers une
théorie unifiée des interactions" (MTR5).
Ces thèmes visent à englober toute la complexité des interactions entre organismes, tout en tenant
compte des facteurs abiotiques à toutes les échelles des systèmes biologiques et à prédire les
réponses des systèmes biologiques aux perturbations environnementales.
Le manque de connaissances dans ces thèmes a été mis en exergue lors de l’élaboration du Labex et
l’un des objectifs majeurs de ce dernier est de soutenir l’émergence de nouvelles connaissances et
méthodologies et de nouveaux concepts afférents à ces domaines.
Résultats attendus & perspectives
A la fin de ce projet, nous souhaitons mettre à la disposition de la communauté scientifique une
nouvelle méthodologie standardisée basée sur les NGS pour étudier et dans une seconde étape
modéliser les réseaux de pollinisation.
Les thématiques pouvant bénéficier d’une telle méthodologie sont par exemple : l’étude de l’impact
des milieux naturels ou semi-naturels (bandes enherbées, milieux forestiers, prairies naturelles,
espèces adventives) sur la pollinisation des cultures ; l’étude des interactions entre les pollinisateurs
sauvages et les pollinisateurs domestiques, le rôle de chaque espèce ou groupe de pollinisateurs
dans la fonction collective de pollinisation étant peu connue ; la contribution des espèces ou des
groupes fonctionnels à la stabilité ou la résilience des réseaux de pollinisation face aux changements
globaux.

Dans le contexte de changements globaux, il devient urgent de comprendre quels sont les principaux
déterminants du fonctionnement des réseaux de pollinisation. Ceci nécessite de multiplier les études
à larges échelles spatiales et temporelles, le long de gradients écologiques contrastés et dans des
milieux naturels ou anthropisés.
Finalement, les insectes étant d’excellents explorateurs de la végétation et de très efficaces capteurs
de pollen, l’étude de leur charge pollinique peut contribuer à évaluer la diversité locale et ses
changements dans l’espace et le temps.
Références citées
[1] Schweiger O et al. 2010. Biological Reviews 85: 777-795
[2] Michez D & Rasmont P. 2015. La recherche 540, 55-58.
[3] Smith MR et al. 2015. The Lancet doi : 10.1016/S0140-6736(15)61085-6
[4] Biesmeijer JC et al. 2006. Science 313: 351-354
[5] Goulson D, Lye GC, Darvill B. 2008. Annual Review of Entomology 53: 191-208.
[6] Ings TC et al. 2009. Journal of Animal Ecology 78: 253–269
[7] Wilcock C & Neiland R. 2002. TRENDS in Plant Science 7: 270-277.
[8] Popic TJ et al. 2013. Austral Ecology 38, 76–86.
[9] Taberlet P. et al. 2012. Molecular Ecology 21 : 1789-1793.
[10] Galimberti et al. 2014. PLoS ONE 9 (10): e109363. doi:10.1371/journal.pone.0109363
[11] Matsuki et al. 2007. Molecular Ecology 7 : 194–198
Présentation de la thèse
Déroulement et programme des travaux de thèse
Les travaux de thèse consisteront à :
(1) 1e Année : Développer de nouveaux codes-barres à ADN pour les espèces de plantes (tnrL
intron, ITS) et de pollinisateurs non référencés (COI, 16S) dans les bases de données (Genbank).
Dorénavant, le laboratoire EDB dispose d’une bonne expérience dans ce domaine puisque ce travail a
déjà été réalisé pour environ 150 espèces de plantes et d’insectes. De plus nous avons montré que
l’identification des insectes par codes-barres à ADN pouvait être réalisée directement à partir de la
solution utilisée pour décrocher le pollen de leur corps. A terme, nous souhaitons développer des
codes-barres à ADN pour la majorité des plantes entomogames des Pyrénées. Cependant, dans le
cadre de cette thèse nous ciblerons 17 communautés végétales Pyrénéennes que nous étudions
depuis plusieurs années (Laboratoire EDB).
(2) Fin 1e Année- 2e Année : Calibrer la relation ‘quantité de pollen/quantité d’ADN et nombre
de séquences Mi-Seq’ pour des espèces ou des groupes d’espèces cibles. En effet, nos résultats
préliminaires montrent que le rendement de l’extraction de l’ADN des pollens varie d’une espèce à
l’autre. De plus, toutes les espèces n’ont pas le même nombre de copies des fragments-codes-barres.
En conséquence, pour une même quantité de pollen, il peut exister une variabilité interspécifique
dans le nombre séquences obtenues ce qui peut conduire à une vision biaisée des interactions. Cette
calibration nécessite d’identifier et de quantifier très précisément les grains de pollen des différentes
espèces (Laboratoire GEODE) et de quantifier l’ADN à chaque étape (extraction, PCR) afin de faire le
lien avec le très grand nombre de séquences obtenues (données traitées par bioinfo.genotoul.fr
cluster dans notre étude préliminaire).
(3) Début 3e année : Le métabarcoding a révélé la présence de séquences de plantes
anémogames sur les insectes ce qui suggère, soit que certains insectes collectent du pollen